第三军医大学 硕士学位论文 重庆市水环境中抗生素污染与微生物抗生素耐药性研究 姓名：刘小云 申请学位级别：硕士 专业：劳动卫生与环境卫生学 指导教师：舒为群

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第三军医大学硕士学位论文

ＴＣ ＯＴＣ ＣＴＣ ＳＰＥ
Ｔｅｔｒａｃｙｌｉｎｅ Ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ

中文全称 四环素 氧四环素 氯四环素 固相萃取

ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

Ｃｈｌｏｍｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ

ＳｏＬｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ

高效液相色谱，质谱联用技术

ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ＡＲＡ

抗生素耐药性分析 抗生素多重耐药

ＡＧＰ ＳＴＰ ＰＥＮ ＡＭ［Ｐ ＣＥＦ

ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ

抗菌素促生长剂 污水处理厂 青霉素 氨苄青霉素 头孢他啶 庆大霉素 丁胺卡那霉素 红霉索 链霉素 环丙沙星

ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｅｒ

ｓｅｗａｇｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ

ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ

ａｍｉｋａｃｉｎ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ Ｏｆｌｏｘａｃｉｎ ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ
Ｃ中 ＯＦＬ ＮＯＲ ＥＲＡ ＰＥＣ ＡＯＰ

氧氟沙星 诺氟沙星 环境危险性评价

ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ

ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

ｏｘｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ

ｗｅｔｌａｎｄｓ ｐｌａｎｔ

ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ

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ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ

ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｒｅ ｇｅｔｔｉｎｇ

ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ

ｃｏｎｃｅＨｌ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ

Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ

ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａ

ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｕｓａｇｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ ａｎｄ ａｌｓｏ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ

ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ

ｙｅａｒｓ．Ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ

ｔｈａｔ ｍｏｓｔ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｒｅ

ｆｕｌｌｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｅｄ ｉｎ

ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｂｏｄｉｅｓ．髓ｅ

ｔｈｅｉｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ

ｅｆｆｌｕｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ

ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｆｌｕｘ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｕｎｉｃｉｐａｌ ｓｅｗａｇｅ ｐｌａｎＬ

ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ｈｏｓｐｉｔａｌ

ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｆｉｅｌｄ ｗｉｔｈ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｆｆｌｕｅｎｔ

ｍａｎｕｒｅ．Ｔｈｅｓｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ

ｆｉｎａｌｌｙ ｒｅａｃｈ ｔｈｅ ａｑｕａｔｉｃ

ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ

ｒａｉｎｆａｌｌ ｅｖｅｎｔｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｐｏｌｌｕｔａｎｔ ｓｈｏｗｓ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ

ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｌａｓｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｎｅｗｌｙ ｅｍｅｒｇｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ．ｎｅ

ａｄｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ

ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｕｎｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｆｏｒ

ｈｕｇｅ ｐｒｏｆｉｔｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｂｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ

ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ

ｅｍｅｒｇｉｎｇ．Ｒｅｐｏｔｓ ｆｒｏｍ Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ａｎｄ Ａｍｅｒｉｃａ

ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｅｖｅｒａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｅｆｆｌｕｅｎＬ ｓｅｗａｇｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｔｈｅ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｏｓｐｉｔａｌ

ｅｆｆｌｕｅｎｔ，ａｃｔｉｖｅ ｓｌｕｄｇｅ，ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ

ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ｓｕｒｆａｃｅ

ａｔ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ

ｗａｔｅｒ．１１ｌｅ ｍｏｓｔ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｒｅ

ｌｏｎｇ―ｔｅｒｍ ｔｏｘｉｃｉｔｙ

ｃｒｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｅｘｐｏｓｎｒｅ

ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ

ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ

ｆｌｏｒａ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ．

ｌａｔｔｅｒ ｓｅｅｍｓ ｔｏ ｂｅ ｍｏｒｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｗａｔｅｒ

ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｔｏ ｈａｖｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎ ｗａｔｅｒ

ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ

ｂｅｄｙ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｗａｙｓ

ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｍｏｒｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ，ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ（ＡＲＡ）ｉｓ

ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ

ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ

ｗａｔｅｒ． Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｐａｒｔ ｏｆ

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ?－??ｍｉｃｒｏｂｉａｌ

ｔｒａｃｋｉｎｇ（ＭＳＴ）ｉｎ

ｏｕｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ

ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ

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ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｂａｓｉｃ ｄａｔａ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｅｐ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｃｉｔｙ．Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｐａｒｔ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｖｅｒｓｅ

ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｂｕｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ

ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ

ｉｎ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ａｎｄ

ｃｌｕｅ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ

ｂｙ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ

ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ

ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｃｏｌｉｆｏｒｍ

ｉｎｄｉｃａｔｏｒ．Ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐａｒｔ，ｗｅ ｌｏｃａｔｅｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａｌｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ

ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ． ｅｆｆｌｕｅｎｔ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｆｆｌｕｅｎｔ

Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓａｍｐｌｅｓ ｅｆｆｌｕｅｎｔ

ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｔ，ｐｒｉｍａｒｙ

ｆｒｏｍ ４ ｈｏｓｐｉｔａｌｓ，ｓｏｕｒｃｅ ｗａｔｅｒ ｆｒｏｍ ５ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｒｏｍ

ｐｌａｎｔｓ（ＷＴＰ）ａｎｄ

ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ

ｓｌａｕｇｈｔｅｒｈｏｕｓｅ

ｒａｉｓｉｎｇ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ ｐｏｕｌｔｒｙ

ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

Ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ，Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ

Ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ．Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ 幻ｂｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＰＥ）ｗａｓ

ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ＨＬＢ

ｓａｍｐｌｅｓ．Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ

ＳＡＸ（５００ｍｇ／６ｍ１）ａｎｄ

ｒ５００ｍｅｄ６ｍ１）

ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ ｗｅｒｅ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｉｎ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ａｔ

ａｎｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｐｈｏｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｖａｃｕｕｍ ｔｈｒｏｒＩｇｈ ｅａｃｈ

ｆｌｏｗ―ｒａｔｅ ｏｆ ５ ｍｌ／ｍｉｎ．Ａｆｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ＨＬＢ ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ ｗｅｒｅ ｒｉｎｓｅｄ ｗｉｔｈ

ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ２ｍｌ ｗｅｒｅ ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ ｔｏ

Ｏ．１Ｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ．ａｎｄ ｔｈｅｎ

ｅｌｕｔｅｄ ｗｉｔｈ

ｍｅｔｈａｎ０１．Ｅｌｕｔｅｓ

ｄｒｙｎｅｓｓ ｕｎｄｅｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｒｅ－ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ

ｗｉｔｈ １５０ ｉｄｅｎｔｉｆｙ

１ ＬＣ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ａ ａｎｄ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ一２０＂Ｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＨＰＬＣ／ＭＳ

ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ

ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｅ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ

ＬＣ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ａ ｆ１０

ｍＭ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｅ

ｗａｔｅｒ／ｍｅｔｈａｎｏｌ

ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ、ａｎｄ Ｂ（ＩＯ

ａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｅ ｗｉｔｈ １．Ｏ％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ＭｅＯＨ）ｍｏｂｉｌｅ

３．０×１５０ ｔｕｂａ

Ｌｕｎａ Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｎｏｍｅｎｅｘｌ

ｗｉｔｈ ３ ｕ ｍ ｐａｃｋｉｎｇ． ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ

Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ

ｓｅｌｅｃｔｅｄ―ｉｏｎ

ｕｓｉｎｇ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ

ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ

ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ ｉｏｎｓ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅ―ｐｅａｋ ｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅ

ｔｈｅ ａｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ

ｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ

Ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ

ＡＲＡ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｗａｔｅｒ ｐｏｌｌｕｔｅｄ ｂｙ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｅｆｆｌｕｅｎｔ，ｓｕｒｆａｃｅ

ｗａｔｅｒ ｆｒｏｍ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｓｌａｕＩｇｈｔｅｒｈｏｕｓｅ

ｒａｉｓｉｎｇ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ ｐｏｕｌｔｒｙ，ｉｎｆｌｕｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｒｉｎｇ

ａｎｄ ｅｆｆｌｕｅｎｔ ｆｒｏｍ

ＳＴＰ，ｓｏｕｒｃｅ ｗａｔｅｒ ｆｒｏｍ

ｗａｔｅｒ．Ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ

ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ

ｉｓｏｌａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ

ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ

ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅｄ ｂｙ ＵＳＥＰＡ．Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ

ＡＰＩ Ｌａｂ Ｐｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．

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ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ

ｔｅｓｔｓ（ＡＳＴ）ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ

Ｋｉｒｂｙ―Ｂａｕｅｒ ｄｉｓｃ

ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｂｙ ＮＣＣＬＳ．Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｕｓｅｄ １０ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ

ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ａｍｉｋａｃｉｎ，ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，

ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，Ｏｆｌｏｘａｃｉｎ ａｎｄ ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔ．Ｐｌａｓｍｉｄ

ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｓｉｎｇ ａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｎ．ｐｌａｓｍｉｄ

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｚｅ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＡＧＥ），ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｅｄ ｂｙ

Ｂｉｎ－Ｒａｄ ｇｅｌ ｄｏｅ２０００．Ａｔ ｌａｓｔ，ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｚｅ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｗｉｔｈ
Ｒｅｓｕｌｔｓ：１．Ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ，Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ １４ ｗａｔｅｒ

Ｃｈｌｏｒｏｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ

ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｏｃｃｕｒ ｉｎ ８

ｓａｍｐｍｌｅｓ ｆｒｏｍ

５ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｅ

ｍｏｒｅ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ

ａｔ ０．０１５～０．２１４ ｕ

ｇ／Ｉ．．Ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ

ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＳＴＰ ｗａｓ

ｔｏ ｃｏｎｔａｉｎ ａｌｌ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＴＣｓ．

２．０ｆ ｔｈｅ １６２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ

ｂｏｄｉｅｓ，１５６（９６．３％）ｗｅｒｅ

Ｅ ｃｏｌｉ，５ ｂｅｌｏｎｇｅｄ

ｔｏ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ

ａｎｚｏｎａｅ．Ｅ ｃｏｌｉ ｗａｓ ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ａｌｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｏｒ

ｍｏｒｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｅｘｃｅｐｔ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｐｒｉｎｇ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；ｔｈｅ

ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＡＲ、ｗａｓ

ｔｈｅ ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ

９８．１％．１５（９．３％）ｉｓｏｌａｔｅｓ

ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ａｌｌ ｔｈｅ ｔｅｎ ｓｔｒａｉｎｓ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ

ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，

ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ，ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ

Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｒａｔｅｓ

ａｎｄ ａｍｉｋａｃｉｎ

９９．４％，８５．２％，７４．５％，５６．８％，５６．２％，４７．５％，４２．Ｏ％，３３．３％ａｎｄ ２２．２％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ，ａｍｉｋａｃｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ

ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＜０．００５）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ

ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｔｅｒ ｂｏｄｉｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｌｌｅｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｒａｔｅｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ

ｏｔｈｅｒ（Ｐ＜ｏ．０１２５０），ｅｘｃｅｐｔ ｔｈｅ ａｎｄ

ＷＴＰ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｗａｔｅｒ

ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｗａｔｅｒｓｈｅｄ．Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｆｌｕｅｎｔ

ｅｆｆｌｕｅｎｔ ｏｆ

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

ｒａｔｅ（Ｐ＞０．０１２５０）．

ｓｉｚｅ ｏｆ ０．９０―１５８．８３Ｋｂ

３．Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ ９２

ｉｓｏｌａｔｅｓ（５６．８％）ｗｉｔｈ ｔｈｅ

ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ

ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ，８１ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｒｅｅ

ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｅｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ

ｍｏｒｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ．１１ｌｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｔｈａｔ ｈａｄ ｔｈｅ

ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ

ａｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ

第三军医大学硕士学位论文

ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ

ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：１．ＳＰＥ

ａｎｄ ＨＰＬＣ／ＭＳ

ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｄｙｎａｍｉｃ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ

ｍｉｃｒｏｐｏｌｌｕｔａｎｔ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ． ２．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｗｉｄｅｌｙ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｐｒａｃｔｉｓｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ ｔｈｏｒｏｕｇｈ

ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ．Ｉｔ ｉｓ

ｌｏｎｇｔｅｒｍ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ａｎｄ ｍｏｒｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｄａｔａ

ｍｉｃｒｏｐｏｌｌｕｔａｎｔ

ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ．

ｉｎ ｔｈｅ ａｒｅａ

３．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ｗｉｄｅｌｙ ｅｘｉｓｔｓ，ｈｏｗｅｖｅｒ

ｉｓ ｕｎｋｎｏｗｎ ａｎｄ ｎｅｅｄｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｅｐ ｓｔｕｄｙ．

４．Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ

ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ，ｇｅｎｔａｍｉｅｉｎ，ａｍｉｋａｃｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｏｆ

ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｔｈｅｓｅ

ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ

ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ

ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｃｏｌｉｆｏｒｍ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｓｔｓ ａｎｄ ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ

ｄａｔａｂａｓｅ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ｂａｓｉｃ ｓｔｕｄｙｆｏｒｔｈｅＡＲＡｒｅｓｅａｒｃｈ

ａｍｅｔｈｏｄｏｆＭＳＴｉｎ．Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ．

５．Ｉｔ ｍａｙ ｂｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔＯ ａｄｄ ＡＲＡ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｄｉｃｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｑｕＮｉｔｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ ＳＴＰ ｅｆｆｌｕｅｎｔ，ｈｏｓｐｉｔａｌ ｅｆｆｌｕｅｎｔ

ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ

ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ

ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｓ ｎｏｔ ｍａｉｎｌｙ

ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｌａｓｍｉｄ．Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．

ａｎａｌｙｓｉｓ ｍａｙ

ｐｒｏｐｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ

ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ

ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｑｕａｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ，ＳＰＥ，ＨＰＬＣ／ＭＳ，

Ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ ｃｏｌｉｆｏｒｍ

ｂａｃｔｅｒｉａｌ，Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｏｆｄｅ

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重庆市水环境中抗生素污染与微生物抗生素耐药性研究

随着人畜药物使用量的剧增和环境分析测试技术的快速发展，水环境中药物污染 研究近年在德国、丹麦、瑞士和美国等发达国家受到了前所未有的关注。现有研究表 明：多数药物在人和动物机体内都不能够被完全代谢，多以原形和活性代谢产物的形 式通过粪便排到体外。这些物质最终会通过医院污水、城市生活污水、牲畜粪便及医 药工业废水等多种途径进入水环境造成污染。在水环境的药物污染中，抗生素污染是 显得格外重要的一类。医药行业为牟取暴利而不合理使用抗生素、畜牧水产养殖业为 增产而大量使用抗生素的现象使得抗生素对生态环境的负面作用正逐渐显现。德国、 瑞士、丹麦和美国等国先后有人报道在医院污水、污水处理厂污水和活性污泥、水产 养殖厂水体和底泥、地表水和地下水等水体中检出多类不同浓度的抗生素。水环境抗 生素污染最有可能产生的效应是其持续低水平的暴露对水生生物的远期毒性作用和对 其微生物群落产生的抗生素耐药性选择压力，后者与人类健康的关系更为密切。水环 境微生物耐药性卫生学意义重大：耐药微生物及耐药因子可经多途径侵入机体，将耐 药性传递给体内致病菌，加大感染性疾病的治疗难度；抗生素耐药谱分析（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ａｎａｌｙｓｉｓ，ＡＲＡ）是近年发展并得到应用的水污染的微生物源追踪（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ

ｔｒａｃｋｉｎｇ，ＭＳＴ）技术的主要研究方法之一。

本课题第一部分以地处三峡库区的重庆市水环境为研究对象，对水环境中的抗生 素污染进行初步探索，为今后的深入研究和动态监测提供基础。第二部分以耐热性大 肠菌群（亦称为粪大肠菌群）为指示菌，对重庆市多种水体中微生物对十种常用抗生 素的耐药性进行了初步调查研究，并为在重庆市以ＡＲＡ为手段进行ＭＳＴ研究提供了 线索。第三部分对所有分离的耐热性大肠菌群的质粒谱进行分析，对菌株的多重耐药 性决定因子进行初步定位。 实验方法：采集水样：采集唐家桥污水处理厂进水、一级处理污水和二级处理污 水，西南医院、３２４医院、肿瘤医院和新桥医院污水处理站出水，沙坪坝水厂、渝中 区水厂、江南水厂、和尚山水厂和西南制药厂水厂水源水，屠宰场下游地表水和畜禽 养殖厂下游地表水水样。确定受试抗生素为：氧四环素（Ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、四环素 （Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）和氯四环素（Ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）。固相萃取（ＳＰＥ，ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）：经

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预处理的ＳＡＸ（５００ｍｇ／６ｍ１）和ＨＬＢ（５００ｍｇ／６ｍ１）固相萃取小柱串联过水样，后者用柠檬 酸缓冲液和冲洗后在氮气流下吹干，甲醇洗脱。洗脱液经氮气吹干后用１００ｕ ｌ流动相 Ａ定容，一２０℃储存备测。用ＨＰＬＣ／ＭＳ对各水样中经ＳＰＥ所得富集产物中的四环素 进行分析测试。色谱柱为Ｐｈｅｎｏｎｏｍｅｎｅｘ

Ｃ１８（１５０×３．０衄，３

ｍｂｌ甲酸铵、０．３％甲酸和１０％甲醇的水溶液）和流动相Ｂ（含１０ ｍ／Ｖｌ甲酸铵、１．０％

甲酸的甲醇溶液）进行梯度洗脱，分离受试化合物。离子化采用电喷雾阳离子模式 （ＥｓＩ（＋）），监测方法为选择性离子监测（ＳＩＭ）。四环素的鉴定以保留时间、定量离 子与确认离子（１或２种）的比值为依据，其定量通过分析物与内标物（Ｓｉｍａｔｏｎｅ）的基

峰离子面积比值来计算。

以耐热性大肠菌群作为指示菌分析重庆市水环境中微生物对人畜常用十种抗生索 的耐药性并小量制备质粒ＤＮＡ进行质粒谱分析。采集的水样有：受医院污水污染地 表水样，屠宰场下游与畜禽养殖场下游地表水样，污水处理厂进水与出水、嘉陵江地

表水，歌乐山山顶泉水。富集分离并鉴定菌株：用经美国国家环保局认证的滤膜法对

各水样中耐热性大肠菌群进行富集分离，并用ＡＰＩ

Ｐｌｕｓ微生物分析系统进行菌种

鉴定。抗生素敏感性试验：采用美国临床实验室标准委员会（ＮｃｃＬｓ １９９７版）推荐 的Ｋｉｒｂｙ．Ｂａｕｅｒ琼脂扩散法，选择人畜最常用的青霉素、氨苄青霉素、头孢他啶、庆 大霉素、丁胺卡那霉素、红霉素、链霉素、环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星等ｌＯ种抗 生素进行药物敏感性试验。分析菌株质粒谱：用碱裂解法小量制备各分离菌株的质粒

ＤＮＡ，经Ｏ．７％琼脂糖凝胶电泳后用Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｎｅ系统估算其大小，分析菌株质粒谱。 实验结果：１．从重庆市５种水体的１４个水样中检出浓度为０．０１５～０．２１４

氯四环素、氧四环素和四环素。其中有８个水样至少检测到１种四环素，检出最多的

是测到３种四环素的污水处理厂进水。

２．从７种不同水体分离得到的１６２株耐热大肠杆菌中１５６株（９６．３％）为埃希氏大 肠杆菌，５株为克雷伯氏菌，１株为亚利桑那沙门氏菌，埃希氏大肠杆菌为优势菌。除 ３株分离自山泉水的菌仅对青霉素和红霉素两种抗生素耐药外，其它菌株都对３种及３ 种以上抗生素耐药，多重耐药率达到９８．１％，对所选十种抗生素都耐受的菌为１５株

（９．３％）。十种抗生素耐药率依次为：青霉素ｌＯＯ％，红霉素９９．４％，链霉素８５．２％，

氧氟沙星７４．５％，环丙沙星５６．８％，诺氟沙星５６．２％，庆大霉素４７．５％，头孢他啶４２．０％， 氨苄青霉素３３．３％，丁胺卡那霉素２２．２％。不同水体分离菌株对氧氟沙星、诺氟沙星、 庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素等５种抗生素的耐药率有显著性的差异（Ｐ＜Ｏ．００５）。 不同水体的分离株耐药率两两比较发现：除嘉陵江地表水和屠宰场、畜禽养殖场下游

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地表水外，其它不同水体间微生物对１～５种抗生素的耐药率具有显著性差异 （Ｐ＜０．０１２５０）。污水处理厂进水和出水分离菌株的抗生素耐药率无显著性差异

（Ｐ＞０．０１２５０）。

３．１６２株分离菌株中有９２株（５６．８％）提取到大小为Ｏ．９０～１５８．８３Ｋｂ、数量为１～ ６个的质粒，有８１种质粒谱型。７０株（４３．２％）未提取到质粒的细菌中对２种抗生素耐 受的有３株，其余６７株均对３种及３种以上抗生素耐受（多重耐药）；具有相同质粒 谱型的菌株耐药谱都不相同；未发现质粒数量的多少与抗生素耐受种类多少间有明显

结论与展望：１．ＳＰＥ与ＨＰＬＣ／ＭＳ适于对重庆市水环境中抗生素污染进行动态监 测。２．重庆市多种水体中普遍存在痕量水平的四环素类抗生素，应进行周密布点，选 择出具代表性的抗生素，对重庆市水环境中抗生素污染进行长期监测。３．重庆市水环 境中微生物的抗生素耐药性已普遍存在，形成原因有待深入研究。４．不同水体分离的 耐热性大肠菌群对氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素和链霉素的耐药性 有显著性差异，可以这五种抗生素为代表进一步研究重庆地区耐热大肠菌群各宿主（如 人、各种家禽家畜）粪便及各种水体中耐热性大肠菌群的抗生素耐药性并建立相应数 据库，为以ＡＲＡ进行微生物污染源追踪的可行性研究奠定基础。５．在重庆市医院污水、

污水处理厂出水和嘉陵江地表水的水质监测项目中加入微生物耐药性指标具有重要意

义。６．未发现耐热性大肠菌群质粒谱与耐药谱间有明显相关性，推测菌株多重耐药性 可能不是质粒ＤＮＡ介导：各菌株质粒谱具有高多态型，质粒谱分析不能用于区分重 庆市水环境中微生物污染来源。

关键词：水环境：抗生素污染；固相萃取；高效液相色谱，质谱联用技术；微生 物耐药性；耐热性大肠菌群；质粒谱

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重庆市水环境中抗生素污染与微生物抗生素耐药性研究

过去近四十年中，人们对环境化学污染的关注仅限于传统的优先污染物，尤其是 在环境中持续存在且具急性毒性和致癌性的杀虫剂和工业副产物。对包括处方药、生 物制剂和诊断用药在内的一大类具有生物活性、可能造成生态环境污染的医用、兽用 药物的研究很少…。目前还只有德国、瑞士、丹麦等欧洲国家及美国等少数发达国家 对医用和畜用药物的环境行为进行了一些初步研究。他们的研究表明：多数药物在人

和动物机体内都不能够被完全代谢，多以原形和活性代谢产物的形式通过粪便排到体

外。这些物质最终会通过医院污水、城市生活污水、牲畜粪便及医药工业废水等多种

途径进入水环境造成污染（图１）【２Ｊ。

Ｆｉｇｕｒｅ １．Ｓｏｕｒｃｅｓ。ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｓｉｎｋｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ

图１水环境中药物污染源与污染途径

城市生活污水大多进．Ｋ－－级污水处理厂进行处理，处理工艺以传统的活性污泥法 最为常用。研究表明，现行的污水处理技术很难彻底清除医用药物，未被清除的具生

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物活性的药物会随出厂污水渗入地下水或汇入地表水造成污染【３】。 医院污水是一种极其复杂的体系。除了与城市污水相同种类的污染物外，医院污 水中还含有高浓度、难降解的处方药、生物制剂、消毒剂、重金属离子和放射性同位 索等特殊化学污染物。现行的医院污水处理工艺主要利用生物氧化和化学氧化等常规 方法，对医用药物的降解效率低，处理后污水中仍有残留药物进入外环境水体。有调 查显示，国内有相当大比例的医院污水处理系统不能维持正常运转，污水未经处理就 被排入城市污水或直接排放到地表水体造成污染１４．５）。 畜牧养殖厂排出的动物粪便中同样有兽用药物及其代谢产物的残留。这些粪便仅 通过简单的堆肥处理就被用作农田粪肥，其中的兽药将渗透到地下水或经地表径流进 入地表水。 在药物污染中，抗生索污染是显得格外重要的一类。自二十世纪４０年代青霉素问 世来，已有百余种抗生素被相继开发使用，它们在治疗感染性疾病方面发挥了巨大作用， 有效地保障了人类的生命健康。此外，抗生素还被大量用于畜牧业和水产养殖业防治 感染性疾病，并用作抗菌生长促进剂（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＡＧＰ）ｊ／Ｉ快动物的生 长，促进了食品工业的发展。然而，医药行业为牟取暴利而不合理使用抗生素、畜牧 水产养殖业为增产而大量使用抗生素的现象使得抗生素对人类和生态环境的负面作用 也逐渐开始显现。有统计数据显示：欧洲１９９６年抗生素的使用总量为１０２００吨，其中 约５０％用作兽药和ＡＧＰ：１９９９年其用量上升至１３２８８吨，其中３５％用于动物；美国 ２０００年抗生素的用量约为１６２００吨，约７０％用于畜牧水产养殖业；全球抗生素年均使

用总量约为１０００００～２０００００吨【６】。

同多数药物一样，抗生素不能被人和动物机体完全代谢，它们大多以原形和活性 代谢产物随粪便排入污水，而现行的污水处理技术又不能够彻底清除残留的抗生素， 未被清除的部分将对水环境造成污染‘７‘１ ０１。近年来，随着分析测试技术的快速发展及 抗生素使用量的不断增加，在德国、瑞士、丹麦等欧洲国家和美国先后有人在医院污 水、污水处理厂污水和活性污泥、水产养殖厂水体和底泥、地表水和地下水等水体中 检出多类不同浓度的抗生素‘７。５１。 因受检测技术的限制，水环境抗生素污染的研究目前仅在少数发达国家得到开展， 有关资料还极为缺乏，其对人类和生态环境带来的负面效应也未能确定。美国ＦＤＡ 和欧盟ＯＥＣＤ分别于１９７７年和１９９５年开始进行药物注册前环境危险性评价

（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ

ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ＥＲＡ），并规定药物进入ＥＲＡ程序的预期环境浓度 ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＰＥＣ）域值分别为ｌｐｇ／Ｌ和Ｏ．Ｏｌｌ－Ｌｇ／Ｌ［ｔ６－１７）ｏ收

（ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ

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集足够的环境中药物暴露水平资料是进行科学的环境危险性评价的第一步【１引。我国是 抗生素生产和消费大国。据统计，１９９６年和１９９７年全国大环内酯类产量分别为５９１．４ 和９３１．６吨，１９９８年各类抗生素生产总量为３万多吨，１９９９年喹诺酮类抗生素的用量 为２５４８吨ｎ９．２０】。从我国抗生素的使用情况和污水处理现状来看，很有必要对水环境中 抗生素污染水平进行调查研究和长期的动态监测，为深入进行抗生素环境危险性评价 提供足够的数据支持。然而，目前国内在该领域还没有研究报道。

重庆市地处嘉陵江和长江汇合处，水资源丰富，人口众多（近３１００万），医疗卫 生事业和医用制药行业较为发达，共有西药制药企业３２个（其中城区占２４个），医

疗卫生机构４５００多个。同时，兽药产业和畜禽水产养殖业在该地区业也较发达。医院

污水、制药厂排放废水、居民生活污水和畜禽水产养殖厂废水都可能成为该地区水环

境的抗生素污染源。举世瞩目的三峡工程将给重庆特别是三峡库区水环境带来广泛而 深远的影响，库区形成后的水质状况受各级政府和广大群众的密切关注。本课题第一 部分即以地处三峡库区的重庆市水环境为研究对象，用近年得到快速发展的固相萃取

（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＰＥ）和高效液相色谱与质谱联用技术（ｈｉｇｈ

ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ

ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＨＰＬＣ／ＭＳ）对水环境中的抗生素污染进

行初步探索，为该地区水环境抗生素污染长期动态监测提供基础。 水环境抗生素污染最有可能产生的效应是其持续的暴露对水生生物的毒性作用及 对微生物群落产生的抗生素耐药性选择压力，后者与人类健康的关系更为密切［２，２１－２４１。 水环境中微生物耐药并非新兴话题，早在１９７６年Ｃｏｏｋｅ就对自然水环境中大肠杆菌 和粪性大肠菌的耐药性进行了报道伫５１。近年来，随着抗生素用量和种类的不断增加， 对水环境中微生物抗生素耐药现象及其形成机制的研究也受到了前所未有的关注，有 关报道层出不穷［２２，２３，２６－５０】。研究显示：人和动物体内耐药菌或耐药因子向水环境的扩 散及水环境中低浓度的抗生素对菌群产生的耐药性选择性压力都可能是微生物耐药性 的形成原因口”。水环境微生物耐药性卫生学意义重大。耐药微生物及耐药因子可经多 途径侵入机体，将耐药性传递给体内致病菌，加大感染性疾病的治疗难度［５１－５３］；抗生

素耐药谱分析（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ，ＡＲＡ）是近年发展并得到应用的水污染的 微生物源追踪（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ

ｔｒａｃｋｉｎｇ，ＭＳＴ）技术的主要研究方法之一【３６４８?５¨８”。

然而，对水环境微生物耐药性的研究在国内还未见报道。本课题第二、三部分以耐热 性大肠菌群为指示菌，对重庆市多种水体中微生物耐药谱和质粒谱进行了初步调查研 究，试图揭示该地区人和动物抗生素滥用所造成的负面效应，并为在以ＡＲＡ为手段 进行ＭＳＴ研究提供线索。

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第一部分重庆市水环境抗生素污染研究

抗生素对水环境造成的污染近年在欧美一些国家已受到关注，在我国还没有相关 研究报道。本研究利用近年得到快速发展的ＳＰＥ与ＨＰＬＣ／ＮＩＳ技术，对重庆市医院污 水、污水处理厂污水、农业流域地表水和两江地表水等水环境中３种最常用的四环素 类抗生素污染情况进行了初步研究。

一、主要仪器与设备 １．ＶｉｓｉｐｒｅｐＴｍＤＬ固相萃取器

美国Ｓｕｐｃｌｃｏ 美国Ａｇｉｌｅｎｔ

ＨＰＬＣ与１９４６Ｂ ＭＳ

３．无油真空泵（ＨＤ．２５） ４．氮吹仪（ＭＴＮ．２８００）

５．ｐＨ计（ＰＨＳ．Ｐ） ６．电子天平（ＢＳｌｌ０Ｓ） ７．高温烤箱（ＣＳｌ０１ＩＩ）
天津 上海大中分析 德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 江苏
１．ＳＡＸ柱（５００ ｍｇ／６ｍｌ，美国Ｉｓｏｌｕｔｅ）

２．ＨＬＢ固相萃取柱（５００ｍｇ／６ｍｌ，美国Ｗａｔｅｒｓ）

４．甲醇（色谱纯） ５．超纯水：ｍｉｌｉ―Ｑ系统制备 ６．４０％硫酸 ７．９９．９９９％氮气 ８．醋酸钾（分析纯） ９．１０ｍＭ甲酸铵（色谱纯） １０．Ｎａ２ＥＤＴＡ（分析纯） １１．１．２３ｍｇ／Ｌ四环素甲醇溶液（美国，Ｓｉｇｍａ） １２．１．２３ｍｇ／Ｌ氧四环素甲醇溶液（美国，Ｓｉｇｍａ）

１３．１．２３ｍｇ／Ｌ氯四环素甲醇溶液（美国，Ｓｉｇｍａ）

１４．１．２３ｍｇ／Ｌ Ｓｉｍａｔｏｎｅ溶液（美国，Ｓｉｇｍａ）

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ｍｇ／Ｌ甲基氯环素溶液（美国，Ｓｉｇｍａ）

１７．Ｏ．０４Ｍ柠檬酸缓冲液 三、抗生素使用情况调查与检测种类确定 统计分析西南地区医院用药分析与监测系统（中国药房杂志社信息中心内部资料， 第三军医大学第一附属医院药剂科提供）２００３年全年各类药品中抗生素类药物的按日 剂量数（ＤＤＤｓ）排序及通用名按日剂量数（ＤＤＤｓ）排序‘５９１，结果见表１－１与表１－２。

表１－１西南地区２００３年各类药品按日剂量数（ＤＤＤｓ）排序１００名内抗生素类药品

表ｌ一２西南地区２００３年药品通用名按日剂量数（ＤＤＤｓ）排序１００名内抗生素 排序

５ １０ ７５ ９５ １００

抗生素通用名 青霉素Ｇ钠 甲硝哒唑 诺氟沙星 司帕沙星

查阅相关文献，了解到重庆市近年医院抗生素使用情况。根据金蜀蓉等人的报道， 重庆市１９９８年至２００２年间用量居前２０位的药品中，抗感染药物占相当大的比例。 在喹诺酮类药物中，１９９８年只有氧氟沙星和环丙沙星进入前２０位，而到１９９９年、２０００

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年，环丙沙星和氧氟沙星被逐步排出前２０位以外，取而代之的是依诺沙星和左旋氧 氟沙星。大环内酯类中罗红霉素和阿奇霉素使用最为广泛【６０ｔ６”。 对九龙坡区畜禽养殖厂抗生素使用情况进行走访调查发现，畜禽用抗生素以四环 素类、磺胺嘧啶类、氟喹诺酮类、丁胺卡那霉素、链霉素、红霉素为主。其中四环素 类抗生素是最常用的促生长剂之一。 综合以上调查结果与现有的ＨＰＬＣ／ＭＳ检测方法所能检测的抗生素种类，确定对 水环境中氧四环素（Ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、四环素（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）和氯四环素 （Ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）的污染进行初步研究。

表１．３各采样点污水（水）处理工艺流程 采样点 污水（水）处理工艺流程 进水一粗格栅一进水泵房一细格栅一曝气沉砂池一计量槽一初 唐家桥污水处理厂 沉池一曝气池一二沉池一出水 西南医院、３２４医院、肿瘤医 院污水处理站 医院污水一化粪池一格栅过滤池过滤一沉淀池一污水消毒池次 氯酸钠消毒一进入市政污水排放系统 医院污水一化粪池一格栅过滤池过滤一沉淀池一污水消毒池次 新桥医院污水处理站 氯酸钠消毒一排入地表水体 沙坪坝水厂、渝中区水厂 江南水厂 江水一沉沙池一加碱铝一沉淀池一加聚合氯化铁一过滤池一加 液氯一清水池一出厂水 江水一前加碱铝一预沉一后加碱铝一沉淀池一前加氯一 和尚山水厂 过滤池一后加氯一清水池一出厂水 江水一沉沙池一加聚合硫酸铁一反应池一缓冲池一沉淀池一过 西南制药厂水厂 滤一加液氯一清水池一出厂水 屠宰场下游地表水 畜禽养殖厂下游地表水 未经处理，直接进入农户使用 未经处理，直接进入农户使用

准备器皿：为防止四环素和蛋白、硅醇基结合，并与金属离子形成螯合物，所有 玻璃器皿须经重铬酸钾洗液浸泡２４ ｈ、超纯水清洗后经２５０＂Ｃ烤２ ｈ，并加入２．５ｍｌ饱 和的Ｎａ２ＥＤＴＡ甲醇溶液进行涮洗‘６２】。采样瓶为５００ｍｌ棕色玻璃瓶，采样前加入５ｍｌ ５Ｍ 醋酸铵。

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采集样本：于２００４年１０月用经处理的５００ｍｌ棕色玻璃瓶采集重庆市主城区１家

城市污水处理厂进厂污水、一级处理污水、二级处理出厂污水和４家医院（西南医院、

新桥医院、３２４医院、肿瘤医院）污水处理站排放污水２５０ｍｌ，５家自来水厂（沙坪坝 水厂、渝中区水厂、江南水厂、和尚山水厂和西南制药厂水厂）水源水，农业流域屠 宰场下游地表水和畜禽养殖场下游地表水各５００ｍｌ。各样本采集两份平行样。水样置 于带有冰块的保温箱运回实验室，立即用Ｏ．４５

的Ｎａ２ＥＤＴＡ后置于４℃保存备用１９，６３］。

ｍ孔径醋酸纤维滤膜过滤后添加１．３９

各城市污水处理厂污水、医院污水处理站污水、嘉陵江地表水和农业地区地表水 处理工艺流程如表１．３。

图１固相萃取流程图 在固相萃取前，水样（１２３ｍ１）和分析物对照（１２３ｍ１）中均加入４０％硫酸７５

ｍ，Ｃｔ，甲基氯环素（替代标准）溶液２００ ｕ ｌ。分析物对照为添加１．２３ ｍｇ／ｔ，各分析物

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甲醇溶液２００ ｌａ ｌ的超纯水。用甲醇２ｍｌ和Ｏ．０４Ｍ柠檬酸缓冲液（ｐＨ ４．７）２ｍｌ将ＳＡＸ

和ＨＬＢ固相萃取小柱进行预处理后，将ＳＡＸ置于ＨＬＢ上串联使用。前者用于去除带 阴离子的腐殖质等干扰物，后者保留抗生素类物质。水样与对照过柱，ＨＬＢ小柱以 Ｏ．０４Ｍ柠檬酸缓冲液（ｐＨ ４．７）２ｍｌ和Ｏ．ＩＭ的醋酸钾２ｍｌ冲洗并在９９．９９９％氮气流下吹

干，甲醇２ｍｌ洗脱２次‘¨６”，洗脱液滴入盛有１００｜ｌ ｌ浓度为１．２３ｍｇ／Ｌ内标（ｓｉｍａ００ｎｅ） 的试管中，氮气吹干，加入１５０ｕ ｌ流动相Ａ（见分析测试部分），一２０℃储存备测。 五、分析测试 用ＨＰＬＣ／ＭＳ对各水样中经ＳＰＥ所得富集产物中的四环素进行分析测试。 （一）液相色谱条件 １．色谱柱：ＰｈｅｎｏｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａＣｌＢ（１５０×３．０ｉｎｌｌｌ，３１１ｍ）。 ２．流动相 流动相Ａ：浓度为ｌＯｍＭ甲酸铵溶液，溶剂为９０：１０（ｖ／ｖ）的甲醇和水，含Ｏ．３％ 甲酸。 流动相Ｂ：浓度为ｌＯｍＭ的甲酸铵甲醇溶液，含１．０％甲酸。 ３．总流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ ４．进样量：２０ｕｌ ５．柱温：３５℃ ６．梯度洗脱（表１．４）
表ｌ＿４梯度洗脱流动相比例

注：各次检测间以初始条件平衡色谱柱５ｒａｉｎ。

（二）质谱条件 １．电离方式：电喷雾离子化源（ＥｓＤ，正离子检测。

２．监测方法：选择性离子监测（ｓｍ），各化合物的质子化分子离子【Ｍ＋Ｈ】＋和确认

离子见表１－－５。 ３．参数设置：喷雾压为３０ｐｓｉｇ，毛细管电压４０００Ｖ，解离电压１００Ｖ。

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四环素的鉴定以保留时间、定量离子与确认离子（１或２种）的比值为依据，其 定量通过分析物与内标物（Ｓｉｍａｔｏｎｅ）基峰离子面积比值来计算。 各分析物以蒸馏水为基质的回收率见表１―６。定量限（Ｌｉｍｉｔ ｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ＬＯＱ）

Ｉｏｎ Ａｄｄｕｃｔ ａｎｄ Ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ Ｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ

Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ

表１―５四环素分子离子加合物与确认离子（Ｍ／Ｚ）

Ｔａｂｌｅ １．６ Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ １２３ ｍＬ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ

表１＿６四环素以１２３ｍＬ蒸馏水为基质的回收率

Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ ｏｆ０．２０，１．０，ａｎｄ ２．０ ｇ／Ｌ．

从重庆市５种水体的１４个水样中检出氯四环素、氧四环素和四环素，其中８份至 少检测到１种四环素，检出最多的是测到３种四环素的污水处理厂进水，检出浓度为

０．０１５～０．２１４

ｇ／Ｌ（见表１―７）。

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注：ＣＴＣ：氯四环素，

ＯＴＣ：氧四环素，ＴＣ：四环素。

四环素类抗生素（ＴＣ）为广谱抗生素，主要通过抑制蛋白质合成而产生抑菌作用，

对大多数革兰氏阳性和阴性菌、包括一些耐青霉素菌株均有效。在临床上，它们主要

用于治疗尿路感染和立克次体、衣原体、支原体、弧菌感染等。同时，在集约化动物

养殖场，ＴＣ被广泛地用作畜禽渔类促生长剂【６４．６５１。

近年来，抗生素在水环境中的存在被一些发达国家作为一种公共卫生问题日渐关

注。Ｚｈｕ等人用ＳＰＥ与ＨＰＬＣ／ＭＳ联用技术对美国养殖场废水样中ＣＴＣ、ＯＴＣ和ＴＣ中进

行检测发现，多数样本至少有１种以上的检出浓度高于３ ｐ ｇ／Ｌ，过半的水样中３种四环 素都有检出：检出浓度最高的是ＣＴＣ，达到１２０００ ｕ ｇ／Ｌ，其次是ＯＴＣ和ＴＣ，达１３００ｐ ｇ／ｄ６４】。Ｌｉｎｄｓｃｙ用ＳＰＥ与ＨＰＬＣ／ＭＳ对１４４份地下水和地表水中的６种四环素污染情况进 行研究发现：ＯＴＣ最常检出，检出浓度为０．０７～１．３４

ｇ／Ｌ；在１份地表水样中检测到Ｏ．１５

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ｇ／Ｌ雕ＪＣＴＣ【６５】。

本课题利用ＳＰＥ与ＨＰＬＣ／ＭＳ对重庆市多种水体中四环素类抗生素的污染进行了初 步研究。结果表明，该方法具有灵敏度高、特异性强的特点，适用于检测重庆市水环 境的痕量抗生素。在２份（５０％）医院污水样，２份农业流域地表水（１００％），ＳＴＰ进水、 一级处理出水和二级处理出水样本各ｌ份（１００％），１家自来水厂水源样（２０％）中至 少检出１种四环素类抗生素，检出浓度为０．０１５～０．２１４

ｇ／Ｌ。ＳＴＰ进水样中检出种数最

多。检出率最高的是ＣＴＣ。畜禽养殖场下游地表水样中的ＣＴＣ检出浓度最高（Ｏ．２１４ｌｌ

ｇ，Ｌ）。ｓ盯进水、一级处理出水、二级处理出水中四环素的种类和浓度有逐步减少的

趋势。有研究显示：四环素是很强的螫合剂，对土壤有极强的吸附作用。其中，ＯＴＣ 的辛醇，水分配系数仅为０．０２６，而它在活性污泥中的土壤分配系数是１９９０［６５１。此次研 究的医院污水处理站出水样中仅有５０％检ＮＮｏ．０２０～０．０２７

ｇ／Ｌ的四环素、ｓＴＰ污水中

四环素随处理进程逐步减少，可能与污水处理过程中四环素对污泥的强吸附作用有关。 农业流域，特别是畜禽养殖场下游中样检出浓度远远高于其它水样。可能是由于四环 索类抗生素在农业的使用量较大，也可能与畜禽养殖场粪便中药物未被处理而直接随 粪肥经地表径流进入地表水有关。 四环素类抗生索对光降解作用较为敏感，它们在自然水环境中的浓度可能呈现明 显的地区和季节相关性１６７１。本研究的５家自来水水源水样中仅１份水样检ＮＮｏ．０１５

∥Ｌ的ＣＴＣ。原因可能是：本次采样时间为ｌＯ月，江水流速快、重庆市日照充足，江水 对污染物的稀释和光解等自净作用都很强。 受时间和技术条件的限制，本研究仅对重庆市１４个采样点进行了１次水样采集，检 测结果的随机性和偶然性在所难免。然而，该研究在国内首次利用近年发展起来的ＳＰＥ 与ＨＰＬＣ／ＭＳ联用技术对水环境中的抗生素污染进行了初步探索，发现重庆市多种水体 中存在不同浓度的四环素类抗生素，为在该地区深入研究水环境中药物污染奠定了基 础。今后的研究应在采样布点上进行周密部署并进行动态监测，寻找水环境中抗生索 污染的时间、空间分部规律，为药物的环境污染效应研究和环境安全性评价累积数据。

一、ＳＰＥ与ＨＰＬＣ／ＭＳ适于对重庆市水环境中抗生素污染进行动态监测。 二、重庆市多种水体中普遍存在痕量水平的四环素类抗生素，应进行周密布点、 选择几种抗生素作代表，对重庆市水环境中抗生素污染进行动态监测。

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第二部分重庆市水环境微生物耐药性研究

抗生素滥用对生态环境所造成的负面效应还鲜为人知。研究表明，环境中抗生素 耐药性细菌的存在和传播不容忽视。水环境中细菌的抗生素耐药性卫生学意义尤为重 大。本研究以重庆市医院污水、污水处理厂污水、屠宰场下游地表水、畜禽养殖场下 游地表水、嘉陵江水和山泉水中耐热性大肠菌群作为指示菌，利用滤膜法对其进行分 离、鉴定，分析其对常用十种抗生素的耐药谱。
１．冷冻恒温振荡器（ＤＨＺ．Ｄ） ２．超净工作台（ＬＺ一２） ３．水样过滤装置 ４．电子天平（ＢＳｌｌ０Ｓ） ５．ＡＰＩ微生物分析系统（ＡＰＩ ６．ｐＨ计（ＰＨＳ．Ｐ） ７．全自动电热高压蒸汽灭菌器（ＬＤＺＸ一４０ＳＢＩ） ８．电子比浊器

江苏 苏州 日本 德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 法国ＢｉｏｓＭｅｒｉｅｕｍｘ

上海申安 法国ＢｉｏｓＭｅｒｉｅｕｍｘ

二、主要试剂及配制 １．枚红酸（ｒｏｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ）溶液

准确称量１９枚红酸（重庆，化玻公司）和０．８９氢氧化钠ＮａＯＨ（重庆，化玻公 司）溶于１００ｍｌ三蒸水中，置于棕色玻璃瓶在４０ｃ保存备用。

２．甲基蓝（ｍｅｔｈｙｌ ｂｌｕｅ）溶液

准确称量ｌｇ甲基蓝（重庆，化玻公司）溶于ｌＯＯｍｌ三蒸水在棕色玻璃瓶中４。ｃ

ｍ孔径、４７ｒａｍ直径网格滤膜（美国，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）

４．ｍ―ＦＣＡｇａｒ培养基 胰蛋白示（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ，英国，Ｏｘｏｉｄ）１０．０ ｇ；聚胨（ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，英国，Ｏｘｏｉｄ）５．０

酵母提取物３．０９；氯化钠５．０ ｇ；乳糖１２．５ ｇ：三号胆盐（Ｂｉｌｅ

Ｎｏ．３）１．５ ｇ：琼脂１５．０

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ｇ。各组分加入三蒸水１．０ Ｌ充分混匀后加热至沸腾时立即加入枚红酸溶液和甲基蓝溶

液各１０ｍｌ，沸腾约ｌｍｉｎ后移开热源冷却到５０。ｃ，用氢氧化钠溶液调节其ｐＨ到７．４ 后倒入６０×１５ｒａｍ培养皿中４０Ｃ倒置保存备用。 ５．平皿计数琼脂培养基 胰胨（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，英国，Ｏｘｏｉｄ）５．０９，酵母提取物２．５９，葡萄糖１．０９，琼脂１５．Ｏｇ， 蒸馏水１０００ｍｌ。１２１。Ｃ高压蒸汽灭菌后ｐＨ用ＮａＯＨ调至７．Ｏ±Ｏ．１倒入６０Ｘ １５ｍｍ培 养皿中４。Ｃ倒置保存备用。

６．半固体（菌株保存）培养基

蛋白胨１０９；牛肉膏５９；ＮａＣＩ ３９；磷酸氢二钠Ｎａ２ＨＰ０４ ２９；琼脂４．５９。各组分 溶入１０００ｍｌ蒸馏水后分装于１０ｍｌ试管，每试管分装３ｍｌ，１２１。Ｃ高压蒸汽灭菌１５ｍｉｎ 后４０Ｃ保存备用。 ７．ＡＰｌ２０Ｅ试剂盒（法国，ＢｉｏｓＭｅｒｉｅｕｍｘ） ８．稀释缓冲液 磷酸缓冲储备液：３４．０克ＫＨ２Ｐ０４溶于５００ｍｌ蒸馏水，用１Ｎ的ＮａＯＨ溶液调节 ｐＨ到７．２±０．５，然后再加蒸馏水稀释到１Ｌ。 缓冲工作液：１．２５ｍｌ的磷酸缓冲储备液和５０ｍｌ的氯化镁溶液（３８９ＭｇＣｌｙＬ）加

到１Ｌ蒸馏水中，分装灭菌备用。

９．普通羊血平板（重庆，庞通） １０．水解酪蛋白（Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ，ＭＨ）琼脂平板（英国，Ｏｘｏｉｄ） １１．十种抗生素药物敏感性试验６．３５ｍｍ纸片（英国，Ｏｘｏｉｄ） １２．麦康凯平板培养基（重庆，庞通） 三、水样采集 于２００４年１１月采集医院污水排放点地表水样与白市驿农业流域地表水（包括屠 宰场污水排放口下游地表水和畜禽养殖地区地表水），２００５年３月采集污水处理厂进 厂污水与出厂污水、嘉陵江地表水和歌乐山山顶山泉水（表２―１）。用经２００。Ｃ高温 干烤２ ｈ后包裹于灭菌牛皮纸袋的５００ｍｌ棕色采样瓶进行采样。采样按照无菌操作进 行，各水样采集平行样三份，每份采样量５００ｍｌ。样本置于放有冰块的冷藏箱中运回 实验室４。Ｃ保存，６ｈ内进行过滤。

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ＨＥＰＳ：ｈｏｓｐｉｔａｌ

ｐｏｌｌｕｔｅｄ ｓｕｆａｃｅ ｗａｔｅｒ；ＡＧＲＩ：ｓｕｒｆａｃｅ ｗａｔｅｒ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆｒｏｍ ｓｌａｕｇｈｔｅｒｈｏｕｓｅ；

ＡＧＲ２：Ｓｕｒｆａｃｅ ｗａｔｅｒ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆｒｏｍ ｆａｒｍｓ ｒａｉｓｉｎｇ ｆｉｖｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ ｐｏａｌｔｙ；ＳＴＰｉ：ｉｎｆｌｕｅｎｔ ｏｆ ｓｅｗａｇｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ

ｐｌａｎｔ；ＳＵＲ：ｓｕｒｆａｃｅ

ｗａｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｊｉａｌｉｎｇ

ｒｉｖｅｒ；ＳＴＰｅ：ｅｆｆｌｕｅｎｔ

ｏｆ ｓｅｗａｇｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ

Ｓｐｄｎｇ ｗａｔｅｒ

四、菌株分离 参照美国《水和废水标准检验法》【６９１中的滤膜法在６ ｈ内对水样中的耐热大肠菌 群进行检测分离。各水样过滤体积分别为：医院污水排放点地表水和污水处理厂进厂 水０．００１ｍｌ，污水处理厂出厂水样０．０１ｍｌ，屠宰场下游地表水０．１ｍｌ，畜禽养殖基地地

表水和嘉陵江地表水ｌｍｌ，山泉水１００ｍｌ。

除山泉水直接过滤外，其它水样在１００ｍｌ无菌缓冲稀释液中充分混匀后用口径为

ｈｉｍ的过滤器和直径４７ｍｉｌｌ、孔径０．４５ ｕｍ的网格滤膜（美国，ＭｉＵｉｐｏｒｃ）过滤。

对每批水样进行过滤时都以１００ｍｌ灭菌稀释缓冲液作为空白对照。滤膜细菌截留面向

上，以滚动方式置于经ｍ―ＦＣ平板（染料组份苯胺蓝替换为甲基蓝）上，于３７＂Ｃ进行

ｈ的复苏培养后转至４４．５＂Ｃ培养１９ ｈ。对滤膜上典型蓝色菌落数为２０～６０的平板上

菌落进行计数，计算耐热大肠菌群平均密度（ｃｆｕ／１００ ｃｍ）。用无菌接种针随机挑取各 类形态的蓝色菌落５个用标准计数培养基平板划线接种纯化，纯化菌株接种于半固体 培养基３７℃培养２４ｈ后置于４＂Ｃ保存备用。

所有分离菌用ＡＰＩＬａｂＰｌｕｓ微生物分析系统、ＡＰｌ２０Ｅ试剂盒（法国，ＢｉｏｓＭｅｒｉｅｕｍｘ） 进行菌种鉴定。具体步骤如下。 １．纯化菌株。本次实验将保存在试管内的菌种用灭菌后的接种环挑取少许，采用

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“三线法”接种于普通羊血平板上，置３５。Ｃ电子恒温孵育箱培养１８ ｈ后得到经活化

２．制备菌悬液。打开一安瓿ＮａＣｌ Ｏ．８５％（５ｈａ），以灭菌接种针从羊血平板上挑取已 分纯的单个目的菌落至上述无菌盐水中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，然后用电 子比浊器测定菌悬液的浊度，本次实验所有菌悬液必须均调整为Ｏ．５麦氏单位。 ３．准备试验条。准备一个培养盒，倒入约３ｍｌ灭菌蒸馏水于盘凹中。记录菌株资 料于盘的边沿部分。从包装中取出试验条置于盘中。

４．接种试验条。用无菌吸管将细菌悬液充满￡竖、迎及至逼Ｌ管，避免气泡产生：

其它管仅充满管部（非杯部），避免气泡产生；△旦盟、丛堑、ｌ！基亘、ＯＤＣ和丛点，则 用无菌矿物油覆盖；盖上培养盖，于３５～３７℃孵育１８～２４ ｈ。 ５．判读结果。如果葡萄糖阳性并且，或３个以上测定是阳性，加以下试剂观察结果。 ＴＤＡ测定，加一滴ＴＤＡ试剂，深褐色为阳性反应；ＩＮＤ测定，加一滴Ｊａｍｅｓ试剂， 反应立即发生，整个反应管呈现粉红色为阳性；或加一滴吲哚试剂，等２ ｒａｉｎ，出现 红色环为阳性反应：ＶＰ测定，加１滴ＶＰｌ和ＶＰ２试剂各１滴，等１０ｒａｉｎ，浅粉或红
色为阳性，如浅粉红色在１０ｂ１２ ｒａｉｎ内出现，判断结果为阴性。取出ＡＰＩ 报告单进行记录。

６．鉴定。所得反应的类型以数字化形式记录在报告单，每３个测定为一组，数字

以１、２和４标明，每组中阳性反应以相应的数字相加，由ＡＰｌ２０Ｅ的２０个测定可得

一个７位数，氧化酶反应构成其第２１个反应，如阳性则为４。在ＡＰＩ 据库中输入所得的７位数字，由数据库根据数字编码给出鉴定结果。

采用美国Ｉ临床实验室标准委员会（ＮＣＣＬＳ １９９７版）推荐的Ｋｉｒｂｙ．Ｂａｕｅｒ琼脂扩散 法，选择医疗和畜禽养殖最常用的１０种抗生素进行药物敏感性试验。抗生素纸片（英 国，Ｏｘｏｉｄ）种类及其抗生素含量为：青霉素（ＰＥＮ，１０ＩＵ／片），氨苄西林（ＡＭＰ，１０

ｇ，片），头孢他啶（ＣＥＦ，３０ｕ ｇ，片），庆大霉素（ＧＭ，１０Ｉｔ ｇ，片），丁胺卡那霉素

（ＡＭＩ，３０Ｉｔ ｇ，片），红霉素（ＥＭ，１５Ｉｔ ｇ／片），链霉素（ＳＭ，１０ｕ ｇ／片），环丙沙星

ｇ／片），氧氟沙星（ＯＦＬ，５

ｇ／片），诺氟沙星（ＮＯＲ，５ ｕ ｇ／片）。质控菌

株为埃希氏大肠杆菌ＡＴＣＣ２５９２３（第三军医大学第二附属医院检验科保存菌株），结

果判定参照ＮＣＣＬ２００３版【７０】。

实验具体步骤如下。 １．接种、活化菌种。将保存在试管内的菌种用灭菌后的接种环挑取少许，采用“三

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线法”接种于普通羊血平板上，置３５℃电子恒温孵育箱培养１８ ｈ得到经活化后的目 的菌种。 ２．制备菌悬液。用灭菌后的接种环从上述平板上挑取已分纯的单个菌落２．３个， 小心地放在约含２ｍｌ无菌生理盐水的试管管壁内，缓慢地将细菌碾磨均匀并与无菌生 理盐水充分混匀，即可得到菌悬液，最后用电子比浊器测定菌悬液的浊度，本次实验 所有菌悬液均调整为０．５麦氏单位。 ３．接种Ｍ．Ｈ平板。制备好的菌悬液必须在１５ ｒａｉｎ内使用。用灭菌的棉拭子蘸取 菌液在管壁上旋转挤压３次，去掉多余的菌液。用该拭子涂布整个Ｍ．Ｈ培养基表面，

每次将平板旋转６０度，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。

４．贴药敏纸片。待平板上的水分被琼脂完全吸收后用镊子取药敏纸片一片贴在琼

脂平板表面，用镊尖稍稍压平。每张纸片间距不少于２４ １１１１１３．，纸片中心距平皿边缘不 少于１５ ｍｍ。直径为９０ ｍｍ的Ｍ―Ｈ平板贴５张，贴完纸片后在１５ ｒａｉｎ内将平板反 转，置于３５℃孵箱中培养１８―２４ ｈ后观察结果。

５．判断结果。孵育１８―２４ ｈ后，检查每块平板，如果平板划线满意，接种物准确无

误，抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融合生长。抑菌环的边缘以细菌明显生长为限，

测量包括纸片在内的完全抑制区域直径。 七、统计学分析

采用ＳＰＳＳ １１．０统计软件包进行数据统计。多个样本率比较采用ｘ２检验，按照检

验水准口＝Ｏ．００５进行分析，Ｐ＜０．００５为差异显著：多个样本率间两两比较采用ｘ２分割

法，按检验水准口’＝Ｏ．０１２５分析，Ｐ＜０．０１２５为差异显著【７“。

一、耐热大肠菌群检测结果 检测结果显示（表２－－２），不同水体中耐热大肠菌群密度有较大差异，菌群密度 排序为ＨＥＰｓ＞ｓＴＰｉ＞ｓＴＰｅ＞ＡＧＲｌ＞ＡＧＲ２＞ｓｕＲ＞ｓＰＲ。ＨＥＰＳ、ＳＴＰｉ、ＳＴＰｅ水体位于人 口密集、排污点固定的主城区，以点源污染为主；ＡＧＲ２和ＳＰＲ水体无固定排污点， 主要受地表径流产生的散在性非点源污染影响：ＡＧＲｌ和ＳＵＲ受到的为混和性污染。

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表２―２不同水样耐热大肠菌群密度与分离菌株数

经鉴定发现，从７种不同水体分离得到的１６２株耐热大肠杆菌中１５６株（９６．３％） 为埃希氏大肠杆菌，５株为克雷伯氏菌，１株为亚利桑那沙门氏菌（表２－－３），埃希氏 大肠杆菌为优势菌，占菌群总数的９０％以上，该结果与水环境中耐热大肠菌群的常见

分布‘７２１基本一致。

表２―３不同水样耐热大肠菌群菌种分布

注：括号中为样本各鉴定菌种占其分离菌株百分比

二、耐热大肠菌群抗生素药物敏感性试验结果

（一）分离菌株耐药性概况 对十种常用抗生素的药物敏感性试验表明，重庆市水环境微生物耐药性普遍存在：

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除了３株分离自山泉水的菌仅对青霉素和红霉素两种抗生素耐药外，其它菌株都对３

种及３种以上抗生素耐药，多重耐药率达到９８．１％，对所选十种抗生素都耐受的菌为 １５株（９．３％）。十种抗生素耐药率依次为：青霉素１００％，红霉素９９．４％，链霉素８５．２％，

氧氟沙星７４．５％，环丙沙星５６．８％，诺氟沙星５６．２％，庆大霉素４７．５％，头孢他啶４２．Ｏ％， 氨苄青霉索３３．３％，丁胺卡那霉素２２．２％（表２―４）。各分离菌株的耐药谱见表３―１。 （二）不同水体分离菌耐药率的比较

分离自不同水体的菌株对Ｏｆｆ、Ｎｏｒ、ＧＭ、Ａｍｉ、ＳＭ的耐药率及对十种受试抗生 素都耐药的菌株比例具有显著性差异，对其它抗生素的耐药率未见显著性差异（图ｌ，

＋Ｏｆｆ：Ｘ２＝１６．９５３，Ｐ＜０．００５；Ｎｏｒ：Ｘ２＝２４．１３８，Ｐ＜０．００５；ＧＭ：ｘ２＝５１．６６２，Ｐ＜０．００５； Ａｍｉ：Ｘ２＝６３．８７７，Ｐ＜０．００５；ＳＭ：Ｘ２＝２０．８８５，Ｐ＜０．００５；Ｔｅｎ：ｘ２＝２０．１７７，Ｐ＜０。００５）。

（三）各水体分离菌耐药率的两两比较

１．山泉水与农业流域地表水（包括屠宰场下游与畜禽养殖场下游地表水）分离菌 株比较（ＳＰＲＶＳＡＧＲ）

∞吾妻酌∞ 皋；㈣∞踟∞０

ｃｅｆ ｅｒｙ ｃｉｐ ｏｆｆ

Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

图２ ＳＰＲ与ＡＧＲ分离菌耐药率比较

山泉水与农业流域地表水分离菌株比较，前者对Ｏｆｆ、Ｎｏｒ、ＧＭ和Ａｍｉ的耐药率

显著低于后者，对其它抗生素的耐药率未见显著性差异（?Ｏｆｆ：Ｘ２－－－－－９．６６４，Ｐ＜０．００２２７； Ｎｏｒ：ｘ２＝９．０９４，Ｐ＜０．００３１３；ＧＭ：ｘ２＝１８．８９２，Ｐ＜０．００２２７；Ａｍｉ：Ｘ２＝７．４５３，Ｐ＜０．００７１４）。
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２．山泉水与医院污水污染地表水分离菌株比较（ＳＰＲｖｓ

第三军医大学硕士学位论文 ＨＥＰＳ）

ＡｎｔｉｂｉｏｔｉＣＳ

ＳＰＲ与ＨＥＰＳ分离菌耐药率比较

山泉水与医院污水污染地表水分离菌株进行比较发现，前者对Ｃｅｆ．Ｎｏｒ、ＧＭ、 Ａｍｉ和ＳＭ的耐药率及对所选十种抗生素都耐受的菌株比例显著低于后者，对其它抗 生素的耐药率未见显著性差异（＋Ｃｅｆ：Ｘ２＝８．０６１，Ｐ＜０．００４５５；Ｎｏｒ：ｘ２＝７．５５５，Ｐ＜０．００６２５；

ＧＭ：ｘ２＝３０．１６８．Ｐ＜Ｏ．００２２７；Ａｍｉ：ｚ２＝３３．９９３，Ｐ＜０．００２２７；ＳＭ：ｘ２＝１８．４８９，Ｐ＜０．００２２７； Ｔｅｎ：ｘ２－－－－７．５９７，Ｐ＜０．００６２５）。

３．山泉水与污水处理厂污水分离菌株比较（ＳＰＲ ＶＳ

８０ ６０ ４０ ２０ ０

冀 ．搦均． 霞 ．窗．圜．豳．一｜｜｜．昀．量冀

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山泉水与污水处理厂污水分离菌株比较，前者对ＳＭ的耐药率显著低于后者，对

其它抗生素的耐药率未见显著性差异（＋ＳＭ：Ｘ２＝６．４２７，Ｐ＜０．０１２５０）。

４．山泉水与嘉陵江地表水分离菌株比较（ＳＰＲＶＳ ＳＵＲ）

ｆ嘲，卤Ｉ｜．酗ｊ卤．嘏ｌ蕾，ｊ．圉。嘲，囫ｌ：：

Ｐ吼ａｍｐ。。‘ｅｒｙ。ｉｐ盛ｋ。６毒阱ｇｅｎ砌５拉咖

图５ ＳＰＲ与ＳＵＲ分离菌耐药率比较

山泉水与嘉陵江地表水分离菌株的比较，前者对Ｏｆｌ、ＧＭ和ＳＭ的耐药率显著低 于后者，对其它抗生素的耐药率未见显著性差异（?Ｏｆｆ：工２＝６．８７６，Ｐ＜０．０１２５０；ＧＭ：工２

＝６．３４９．Ｐ＜０．０１２５０；ＳＭ：ｘ２＝９．５２４，Ｐ＜０．００２２７）。

５．农业流域与受医院污水污染地表水分离菌株比较（ＡＧＲＶＳＨＥＰＳ）

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图６ ＨＥＰＳ与ＡＧＲ分离菌耐药率比较

第三军医大学硕士学位论文

农业流域与受医院污水污染地表水分离菌株比较发现，前者对Ａｍｐ和Ａｎｔｉ的耐 药率及对所选十种抗生素都耐受的菌株比例显著低于后者，对其它抗生素的耐药率未

见显著性差异（Ａｍｐ：工２＝６．２８５，Ｐ＜Ｏ．０１２５０；Ａｍｉ：ｘ２＝１３．７１３．Ｐ＜Ｏ．００２２７；Ｔｅｎ：Ｘ２＝ ７．０３２，Ｐ＜０．００８３３）。

６．嘉陵江地表水与农业流域地表水分离菌株比较（ＳＵＲＶＳＡＧＲ）

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０ ｐｅａ ａｍｐ ｃｅｆ ｃｒｙ ｃｉｐ

Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

图７ ＡＧＲ与ＳＵＲ爿＞离菌耐药率比较

嘉陵江地表水与农业流域地表水分离菌株对十种受试抗生素的的耐药率均无显著

性差异（Ｐ＞Ｏ．０１２５０）。 ７．嘉陵江地表水与受医院污水污染地表水分离菌株比较（ＳＵＲＶＳＨＥＰＳ）
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Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＋：Ｐ＜０．０１２５

图８ ＨＥＰＳ与ＳＵＲ分离菌耐药率比较

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嘉陵江地表水与受医院污水污染地表水分离菌株比较，前者对Ａｍｉ、ＧＭ和ＳＭ 的耐药率显著低于后者，对其它抗生素的耐药率未见显著性差异（＋ＧＭ：ｘ２＝ｉ０．００５，

Ｐ＜Ｏ．００８３３；Ａｍｉ：ｘ２＝１１．２０８。Ｐ＜Ｏ．００８３３；ＳＭ：ｘ２＝６．６５６，Ｐ＜０．００８３３）。

８．嘉陵江地表水与污水处理厂污水分离菌株比较（ＳＵＲｖｓ ＳＴＰ）

１００ 团ＳＴＰ ８０

ｏｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ

图９ ＳＵＲ与ＦｒＰ分离菌耐药率比较

嘉陵江地表水与污水处理厂污水分离菌株比较，前者对Ａｎｔｉ的耐药率显著高于后 者，对其它抗生素的耐药率未见显著性差异（ｔＡｍｉ：ｘ２＝９．００２，Ｐ＜０．００３１３）。

９．受医院污水污染地表水与污水处理厂污水分离菌株比较（ＨＥＰＳ ｖｓ

Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＋：Ｐ＜０．０１２５

图１０ ＨＥＰＳ与ＳＴＰ分离菌耐药率比较

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受医院污水污染地表水与污水处理厂污水分离菌株比较，前者对Ｎｏｒ、ＧＭ、Ａｍｉ 的耐药率及对所选十种抗生素都耐受的菌株比例显著高于后者，对其它抗生素的耐药

率未见显著性差异（４ Ｎｏｒ：ｘ２＝１２．９３６，Ｐ＜０．００２２７；ＧＭ：ｘ２＝－３１．６４０，Ｐ＜０．００２２７；Ａｍｉ：工２ ＝－４４．４６２。Ｐ＜０．００２２７；Ｔｅｎ：工２＝８．７９６，Ｐ＜０．００３１３）。

１０．污水处理厂进水与出水分离菌株比较（ＳＴＰｉ ｖｓ

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图１１￥ＴＰｉ与ＳＴＰｅ分离菌耐药率比较

污水处理厂进水与出水分离菌株对十种受试抗生索的耐药率均末见显著差异

（Ｐ＞ｏ．０１２５０）。

一、水环境中耐热性大肠菌群分离与鉴定 从五类水体中用滤膜法在ｍ．ＦＣ培养基上成功分离到１６２株呈蓝色菌落的菌株， 经鉴定有１６１株（９９．４％）属耐热大肠菌群，埃希氏大肠杆菌为优势菌，占菌群总数 的９０％以上。说明该方法是检测分离耐热大肠菌群特异性高、简单易行的方法。 Ｇｅｌｄｄｒｅｉｃｈ和Ｓｍｉｔｈ等人的研究表明，当水中耐热大肠菌群密度在２００ｃｆｕ／１００ｍｌ 以上时，就有可能分离出沙门氏菌口”，此次研究从耐热大肠菌群密度为２．１Ｘ１０３的畜 禽养殖地区河流水样中分离到＆ａｒｉｚｏｎａｅ，符合其研究结论，表明该地区河流受到了 畜禽病原菌的污染，在该地区以耐热大肠菌群作为水体粪便污染指示菌具有重要的卫

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耐热大肠菌群密度在各水体中呈现较大差异：医院污水污染地表水和污水处理厂 污水最高（以点源性污染为主，数量级为１０５－１０６），屠宰场下游地表水和嘉陵江地表

水居其次（同时受到点源性污染和非点源性污染，数量级为１０３ １０４），山泉水和畜禽 养殖地区地表水最低（以非点源性污染为主，数量级１０２～１０３）。该结果提示：污水处

理厂生活污水的处理对微生物的去除效率较低，处理后仍带有高浓度微生物的大量生 活污水是重庆市自然水环境微生物污染的最主要来源，该结果与Ｉｓａｂｅｌｌｅ Ｇｅｏｒｇｅ的研 究结果相似【『Ｈ】。本研究所选采样点的医院污水并未按照《医院污水排放标准》进行严 格消毒处理，医院污水也是该地区自然水环境中微生物污染的重要污染源。屠宰场和

养殖场污水、污物未经处理而直接排放或用作粪肥后经地表径流进入水体是农业地区 水环境微生物污染的主要途径。

对水环境微生物污染，应从源头抓起，采取针对性的控制措施。应高度重视医院 污水对环境的危害性，对医院污水的处理进行严格监控管理，保证医院污水设施的正 常运行，使排放污水符合《医院污水排放标准》，避免医院污水对环境造成微生物污染。 要大力推广现行的堆肥、沼气厌氧发酵等技术，试点利用新开发的新技术（如深槽好 氧发酵技术等）对集约化养殖场粪便进行无害化处理，减少农业养殖对水环境的污染。 长期以来，污水处理厂首要的目的是去除污水中的悬浮颗粒和有机物，对微生物的去 除并没有进行特别的要求。随着人口的增长和水资源的紧缺，越来越多的地区将面临 着回收水的利用问题，对污水处理设施微生物去除效率的评价和要求也显得日益重要。 因此，应逐步建立起以聚合氯化铝混凝沉淀结合快砂滤、臭氧氧化、紫外线消毒、和 高级氧化处理程序（ａｄｖａｎｃｅｄ ｏｘｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，ＡＯＰ）等技术，对二级污水处理厂出水 进行深度处理。也可因地制宜，利用人工湿地（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗｅｔｌａｎｄｓ，ＣＷ）这种投资 少、效能高的污水处理设施，在无条件建造污水处理厂的地区进行生活污水和农业养 殖场污水的无害化处理，并对二级污水处理厂出水进～步处理。 二、重庆市水环境中耐热性大肠菌群抗生素耐药性 本课题研究结果表明，重庆市人类与动物抗生素的滥用已经造成了水环境微生物 对抗生素的普遍耐药。分离自不同水体的１６２株菌对人畜常用十种抗生素的耐药率达 到２２．２―１００％，多重耐药率为９８．１％，对青霉素的耐药率为１００％，说明耐热性大肠菌 群对青霉素具有固有耐药性。Ｇｕａｒｄａｂａｓｓｉ对污水水样和水产养殖厂水样分离的不动杆

菌∽ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）的研究结果表明，分离菌株对抗生素的耐药率为：氯霉素５０％，

氨苄青霉素２７％，氧四环素２６％，磺胺嘧啶２６％，庆大霉素７％，对环丙沙星全部敏 感【３２】。Ｍｕｌａｍａｔｔａｔｈｉｌ报道了从密闭网组化水系分离的２７３株耐热大肠菌中９３％对一 种以上抗生素具有耐药性，对各受试抗生素的耐药率分别是：氨卡青霉素８３．５％，头

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孢菌素７５．５％，磺胺嘧啶７４．４％，链霉素３９．６％，四环素３３．８％ｔ ２９１。Ｍａｄｓｏｌ的研究显 示，分离自污水排放口上下游的肠杆菌中对四环素、ｂｅｔａ－Ｉ勾酰胺类抗生素和萘啶酸的 耐药率分别是２４＿３％、２０．５％和２０％【２”。由此可见，本次研究的耐热性大肠菌分离株 耐药率高于国外的相关研究结果，国内还未见类似报道。 Ｔｉｓｃｈｌｅｒ发现加拿大野鹅粪便分离菌株大多对链霉素，红霉素，万古霉素，四环 素和青霉素具有强耐受性［４９１；Ｓｈｅｒｌｅｙ等对分离自澳大利亚野生哺乳动物的９４６株肠杆 菌的抗生素耐药性的分析结果显示：近１００％的细菌对抗革兰氏阳性菌的抗生素耐药， ８０％的细菌对一种或一种以上的抗革兰氏阴性菌的抗生素耐药Ⅲ】；Ｇｉｌｌｉｖｅｒ报道了英 国西北部野生啮齿类动物肠道菌群抗生素耐药性的普遍存在Ⅲｌ。根据以上报道可知： 在很多国家，野生动物体内微生物耐药性已普遍存在。本次研究从受人类和农业污染 影响极低的山泉水分离的２５株细菌中有３株对两种抗生素耐受，其余２２株均具多重 耐药性。该结果间接提示：重庆地区野生动物肠道微生物耐药性可能已普遍存在。 Ｓｈｅｒｌｅｙ的研究发现野生动物分离菌对合成抗生素甲氧苄啶和萘啶酸具有耐药性，推测 野生动物对抗生素的暴露很可能来自于人类【７ ５１。 对不同水体耐热性大肠菌群两两比较发现：山泉水中分离株对十种抗生素的耐药 率显著低于其它水体分离株，主要原因可能是由于这些菌株的宿主的（多为野生动物） 抗生素暴露水平低于人类和饲养动物。受医院污水污染地表水分离菌株耐药率显著高 于其它各种水体，这是因为高水平抗生素暴露的病人体内耐药性微生物及其耐药因子 随污水排放入地表水，也可能是由于医院污水低浓度的残留抗生素排入地表水后对其 微生物群落产生了耐药性选择压力。污水处理厂进水和出水分离菌株对十种抗生素的 耐药性没有显著性差异，提示污水处理过程对微生物耐药性并无显著影响，这与 Ｇｕａｒｄａｂａｓｓｉ等对三级污水处理对微生物耐药性影响研究的结果一致【３４１。污水处理厂污 水中耐药性微生物的排放很可能是公共卫生的重大隐患，这进一步表明了污水处理厂 应采取有效的深度处理措施防止耐药性微生物向外环境的传播。 分析所有耐热性大肠菌群对十种常用抗生素的耐药谱发现：不同水体微生物的耐 药谱各不相同，它们对Ｏｆｆ、Ｎｏｒ、ＧＭ、Ａｍｉ和ＳＭ五种抗生素的耐药率有显著性差 异。受不同污染源污染的水体中微生物的宿主不相同，不同宿主对抗生素的暴露水平 与种类的差异使得其体内微生物受到不同的耐药性选择压力、产生不同的耐药谱。抗 生素耐药谱分析（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ａｎａｌｙｓｉｓ，ＡＲＡ）正是以此为理论基础在近年发展起

来的一种微生物源追踪技术（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ

ｔｒａｃｋｉｎｇ，ＭＳＴ）陋５１。本次研究筛选出不同

水体微生物对其耐药性具有显著差异的Ｏｆｆ、Ｎｏｒ、ＧＭ、Ａｍｉ和ＳＭ五种抗生素，为 进一步深入研究重庆地区耐热大肠菌群各宿主（如人、各种家禽家畜）粪便及各种水

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体中耐热性大肠菌群的抗生素耐药性并建立相应数据库提供了线索，给在重庆地区以

ＡＲＡ作为手段进行ＭＳＴ研究奠定了初步的研究基础。 水环境微生物耐药性形成的原因可能有：人和动物体内耐药菌及耐药因子向水环 境的扩散，水环境中低浓度的抗生素对菌群产生的耐药性选择压力［３”。虽然水环境微 生物耐药性的机制并不清楚，但它极有可能是公共卫生和生态环境的一大隐患。耐药 微生物及耐药因子可经多途径侵入机体，将耐药性传递给体内致病菌，加大感染性疾

病的治疗难度‘５０’５１，５ ２１。根据本课题研究结果及国外类似文献报道来看，在水质微生物

监测中加入抗生素耐药性分析有重要意义。它不仅会提高水质微生物监测的预警效能， 还能为深入研究水环境中微生物耐药性的形成机理和ＡＲＡ在ＭＳＴ的应用提供长期而

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