免疫金标记检测方法标准操纵程序,_实验百科_中国百科网
免疫金标记检测方法标准操纵程序,
    
实验室名称
**年**月**日
保证免疫金标技术检验正确性
【本SOP适用范围】
免疫金标技术
【该SOP变动程序】
本标准操纵程序的变动，可由任一使用本SOP的工作职员提出，并报经下述职员批准签字：专业主管、科主任。
氯化金分子在还原剂作用下聚合形成金颗粒，颗粒与颗粒之间因静电作用而相互排斥，使其保持一个比较稳定的胶体状态，故称作胶体金。利用胶体金颗粒的高电子密度及其表面能结合生物大分子(如抗体、SPA、植物血凝素和刀豆蛋白A等)以 及具有一定颜色等特性，可用光镜和电镜对细胞内抗原进行定位、定性的研究。
【方法学分类】
1. 班点金免疫渗滤试验 固相膜免疫测定中液体在微孔膜中穿过流出呈穿流形式，为斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，亦有称免疫金溶胶斑点法、滴金免疫测定法等。试验单位为三层反应盒，第一层为过滤器(滤纸层)，第二层为反应膜(NC膜或MC膜)上点加有特异性抗原或抗体，第三层为吸水垫料，有称此渗滤装置为滴金反应板。
以双抗体夹心法测dsDNA为例：试验中将标本加在反应盒上，血清(标本)透过过滤层进进反应层，反应层上点有“一”字形抗IgG(或某种人血清蛋白作为试验阳性对照)及“．”形被测物相应抗体，血清中抗原与反应层中抗体结合，其余无关蛋白等滤出膜片，加进金标记抗体试剂，反应膜上“一”字形及“．”形均显红色为试验阳性，仅“一”形显红色为试验阴性(试剂盒状态良好)，“一”不显色提示试剂盒质量分歧格，需另取反应盒重做试验。
试剂盒基本试剂成分有滴金反应板、金标记试剂及洗涤液。
2. 斑点金免疫层析试验 固相膜免疫测定中液体通过毛细管作用在膜上向前移行呈横流形式，为斑点金免疫层析试验(dotimmunogoldchromatographyassay，DIGCA)。试验单位为一滤膜条，自上而下分有多个层次。
如单克隆双抗体法测HCG，滤膜条各区域分别为：吸水滤纸—固定有金标二抗的MC膜—固定有抗β-HCG抗体的MC膜—金标记抗。α-HCG玻璃纤维—吸尿玻璃纤维。试验中将滤膜条浸进被测尿液或滴加尿液，尿液在毛细管作用下向试纸条上端缓缓移行，尿液将金标抗。α-HCG溶解并带动它向前移动，结合尿中HCG至抗β-HCG抗体处形成复合物，并在抗β-HCG抗体固定处显示胶体金特有红色，提示试验阳性。尿中无HCG时，溶解的抗α-HCG至固定有金标二抗的MC膜处显示胶体金特有红色(质控线条)，提示试验阴性。
试剂盒基本单位仅有一滤膜条，只有一步操纵。
3. 胶体金颗粒的制备
在氯化金溶液中加进不同的还原剂，可制备出不同大小的金颗粒。常采用柠檬酸、抗坏血酸和白磷。用这三种还原剂可分别制备出大、中、小三种主要胶体金颗粒。目前，有更多的实验室仅以柠檬酸为还原剂，在柠檬酸还原氯化金时，加进不同量的单宁酸即可获得大小不同的金颗粒，所制备金颗粒的大小非常一致。
[1] 以抗坏血酸为还原剂制备10～15nm直径的胶体金(Au l5) 在一个洗净烤干的250 ml容量的三角烧瓶中，加进20ml三蒸往离子水(3DW)、l ml 0.1 mol/L K2CO3和l ml％氯化金水溶液于冰浴中混匀，立即加进l ml 0.7％ 抗坏血酸，并充分摇动至溶液呈紫红色，加3DW至100ml，100℃水浴5min后，溶液变成红色，放室温冷却待用。
[2] 以柠檬酸为还原剂制备8～10 nm直径的胶体金(Au l0) 125 ml 3 DW煮沸后加进1％ 柠檬酸7.5 ml，再煮沸5 min，迅速加进1.25 ml％氯化金溶液，100℃水浴15 min，溶液置室温待用。
[3] 以柠檬酸为还原剂制备5—6 nm直径胶体金(Au 6) 将l ml氯化金加进100 ml 3DW中煮沸，快速加进2．45ml柠檬酸—单宁酸的混合液(2 ml 1％ 柠檬酸三钠、0.45 ml 1％ 单宁酸)，继续煮沸5 min，放室温待用。
[4] 白磷为还原剂制备5 nm直径的胶体金(Au 5) 将120 ml 3DW、1.5 ml％氯化金和2.7 ml 1 mol/L K2CO3，混合，缓慢搅拌中快速加进l ml白磷一乙醚溶液，室温轻搅拌15 min，100℃水浴30 min后放室温待用。
胶体金制备一般需在中性pH(7.2左右)条件下进行，也可在稍偏酸或稍偏碱的环境中进行。制备的胶体金其大小和外形可在电镜下观察确定。一般胶体金溶液呈红葡萄酒颜色，大颗粒胶体金是紫红色。正常情况下，胶体金溶液应清澈而不含任何可见的沉淀或漂浮物，如溶液、试剂、瓶皿等不干净。将造成如下结果：第一不能获得预期大小的胶体金颗粒，第二将影响到下一步生物大分子的吸附过程和包被后胶体金的稳定性。因此，为了获得满足的胶体金，应选择最纯净的各有关试剂和液体。如有条件，所有试剂最好经过超过滤处理，以除往其中的分子聚合体和可能混进的杂质块。制备过程中所用的水以三蒸往离子水最合适，各类器皿均应严格清洗，盛胶体金的瓶皿先经过硅化则更为理想。胶体金颗粒在吸附生物大分子之前具有一定的稳定性，4℃可存放一周左右，假如经超过滤和透析处理后加0.002％ 叠氮钠，能保存5个月左右。
4. 胶体金和生物大分子的结合
任何蛋白质都能结合到胶体金颗粒表面，胶体金和蛋白质结合后，并不影响蛋白质的反应性。
[1]生物大分子的预备 盐类成分能影响胶体金的吸附能力，并使胶体金颗粒发生聚集，因此，生物大分子在包被金颗粒前，常需透析，使溶液无盐或盐的浓度极低，常用的透析液为0.003ml/L NaCI。
[2]胶体金颗粒的包被 以生物大分子包被胶体金颗粒时，首先需要确定其精确用量，即蛋白质完全包被胶体金所需蛋白质的最小剂量。由于过多或过少地结合生物大分子均可使胶体金呈不稳定状态，它们的最佳浓度可通过如下方法获得。
制备好的胶体金以0.1mol/L K2CO3，调pH至6.2(SPA的等电点)待与SPA结合。用一个滴定盘或一排小试管，以0.005mol/L NaCl连续稀释50µl SPA(1mg／m1)至第十孔或第十管为止。然后，分别于每孔中加进250µ1的胶体金，5min后再加进250µ1 10％ NaCl，l min后震荡试管，这时SPA浓度较低的孔中，胶体金由红色变为紫色，说明SPA的量不足以包被胶体金。以胶体金未改变颜色，且SPA浓度最稀一孔胶体金与SPA的比例，计算出全部胶体金溶液所需SPA的总量，最后以10～20％过量加进到胶体金中，结合2—5min，再加进1％ 聚乙二醇(MW 20，000)至终极浓度为0.05％，以进一步稳定包埋后的胶体金。
[3]胶体金的浓缩纯化及储存 包被好的胶体金可用离心的方法使稳定的金颗粒沉淀于管底，而与多余的蛋白分开，使探针得以浓缩和纯化。将SPA—金颗粒复合物加到几个洗净的离心管中，再于离心管底部加进3—6 ml 5％ 甘油、0.05％聚乙二醇、0.02％叠氮钠的混合液垫层。纯化2—5nm的金探针时，以125，000×g离心45min(4℃)；纯化8～15nm直径金探针时，以60，000×g离心45~60min(4℃)。离心后SPA—金颗粒复合物浓缩于管底部，呈暗红色，尽量吸往无色上清后，收取暗红色层，而紧挨管壁的致密凝集块不应收集。浓缩纯化的胶体金探针置4℃保存待用，有效期约6个月。
【临床应用】
应用范围 包括感染性疾病抗原、抗体检测，如HBsAg、疟原虫抗原、TB—Ab、HP—Ab、HIV—Ab等；各种蛋白质抗原检测，如AFP、CEA、肌红蛋白、肌钙蛋白、尿微量白蛋白、OB等；激素检测，如HCG、LH、FSH、TSH等；药物检测，如吗啡、可卡因等。适用范围一般为定性试验。
【金标记方法学特点及质量控制】
特异性与ELISA相似，敏感性略低于ELISA。定性检测时单个操纵(NC膜条或NC反应块)、检测快速(胶体金本身为红色，不需加发色试剂，阳性反应即出现红色斑点或条带，整个操只需5—30分钟)、操纵简便(蘸取或滴加标本、试剂即可)、不需特殊设备(手工)、结果明确(显红色，肉眼观察)，且金标记物稳定，冷冻干燥后可在室温长期保存。金标记方法学尤其适合个人保健、床边检测、基层卫生单位检测、急诊检验、新项目小标本量筛查等。
金标记方法学的局限性在于不易正确定量(变异系数大)、不易自动化分析、试剂本钱偏高及质量控制困难。金标记法商品化试剂盒众多，无同一治理，存在题目有：
1.命名与方法学有时不符，方法学表示不明确，包被物与检测物表示不明确。
2.各厂家生产产品质量不一，无比较标准。
3.试剂盒没有标出敏感性(有时即使标出也不相符)及检测上限(有发生前带)，敏感性及临界值标准不同一，造成一些疾病诊断上的假阴性、假阳性。
4.结果不稳定、重复性不满足，试剂盒应有低浓度标准测试重复性。
5.室内质控无有效方法：试剂盒中质控点或质控线中包被的是与标记结合物能直接结合的物质，仅能作为试验过程是否有效的参考指标(标记结合物是否失效、层析过程是否正常、被测物中有无干扰物质等)，不能反映敏感性、特异性、重复性等质量指标；室内质控应有质控物(应有低浓度)经常检测试验条(卡)有否呈色、呈色时间、呈色深浅，将敏感性及敏感性改变作为质控要点。
6.没有试剂盒批检。
【半定量与定量】
在测定一般正常体液中存在而在疾病时升高的物质时，如单以超过正常参考值上限为阳性界限往往不能满足临床要求。胶体金显色深浅与被测物浓度有一定相关性，因此可对被测物进行定量检测。
【金标半定量】
1.DIGFA：可用标准色阶对比法及质控标准对照法。标准色阶对比法是以与被测物浓度相对应的深浅不同的色带板与被测反应板显色斑点对比估计被测物浓度；质控标准对照法是以质控品同时测定对比光彩半定量。
2.DIGCA：可用质控线对比法及多条测定线法。质控线对比法质控线光彩为临床临界浓度显色。多条测定线法在NC膜上置多条受体线(抗体或抗原)，显色线条数与被测物浓度相关，或显色线第几条与被测物浓度达到多少浓度相关。
【金标定量】
1.DIGFA：膜上斑点免疫金标显色终点时用光电比色，
2.DIGCA：由于反应在NC膜上呈横流推进，测定线上反应出现的颜色逐渐加深，液流速度、反应温度等为可变因素，很难在规定时间得到恒定结果。
操纵职员 部分主管 质量负责人
姓名 ****** ****** ******
日期 **年**月**日
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6第六章免疫胶体金银技术讲解.ppt33页
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免疫金技术发展简史 1971年
胶体金应用于免疫组化 1978年免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原 1981年免疫金银法 1986年彩色免疫金银法 3 蛋白质的胶体金标记 原理：
PH值等于或稍偏碱性的蛋白质等电点时，蛋白质呈中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质表面张力最大，处于微弱的水化状态，能牢固吸附于金颗粒表面，形成蛋白层，阻止胶体金颗粒相互接触，而使胶体金处于稳定状态；
PH值高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与胶体金颗粒负电荷相互排斥不能结合。
稳定剂：牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇、明胶 （1）待标记蛋白质准备 透析除盐 除去蛋白质内多余电解质，过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的电位，影 响蛋白质吸附。 方法:蛋白质置于透析袋直接放入双蒸水或极低浓度盐水透析 去除蛋白沉淀 低温保存的蛋白质或抗体易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针 的稳定性有影响，标记前离心除去聚合物。 待标记蛋白质最适稳定量的测定 光电比色法、目测法 5nm SPA胶体金电镜观察 * * 第六章
免疫金银及铁标记技术 免疫胶体金银技术 一、免疫金技术
二、免疫金银法
三、彩色免疫金银法
四、免疫金和免疫金银法的优点
五、免疫金银法染色中常见的问题及对策
六、免疫胶体铁技术 一、免疫金技术 胶体金：金的水溶液，具有一般溶胶特性。
胶体金制备：化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子变成金原子（氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。
胶体金颜色：用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜
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胶体金的制备方法
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【求助】我的培养液PH值怎么总是偏碱？
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我养的是成纤维细胞，用DMEM培养液，刚配好时PH值是7.1。第一次养细胞挺好，可是后来取了几次材都养不出来细胞来了，发现培养液呈紫红色，测PH值，成8.2了！！就重新调PH值，到7.15，颜色纯正了。一个月后，发现又变紫红了，测PH值，测得正在用的一瓶是8.4，过滤后封口再一直没打开的变成7.6。
我又重新调PH值了，调到7.10，过滤后不到7.3。配了50ml新鲜的DMEM+10%胎牛血清，放在4C，平常换液用，刚一周，发现又开始变紫了。又着急又害怕。
我是买的Gibco的干粉，小包装，可以配1升，当时有的同学说需要加NaHCO3 3.7g，Hepes 2.4g，再加双抗。也有的同学说没必要加Hepes，最后我就真没加。会不会跟这有关系？真的不胜其烦。每次都是麻烦导师从临床上取材，可是细胞总养不出来，无言、无颜啊！
请各位同仁请教了！查看完整版本请点击这里：
yjf1026 ( 16:17:13)
调PH值的时间长一些,一般培养基要搅拌6小时.
ffooll ( 16:18:51)
不知道你的培养基隔多长的时间换液，最长不能超过三天。
配好的培养基如果在一周之内能用完，可以放在4度保存，如果不能就得放在－20度，这样放得久一点。
hyuu ( 16:20:07)
“调PH值的时间长一些,一般培养基要搅拌6小时.”
这样配不对吧？
应当是用接近终体积的容器配制，溶解调pH后不要过量搅拌，尽快过滤除菌后冰箱内冷藏保存。培养基要注意避光。
hyuu ( 16:21:15)
我的经验是Milli－Q级水，配制Gibco DMEM高糖，初始pH为7.8左右。HCl或HEPES调pH7.2，过滤除菌。
培养基在温育时因HCO3-分解，pH会升高。储存的培养基应尽量装满容器，可减少HCO3-分解。
bongte ( 16:29:13)
不知道你测pH值的时候是否将培养液升温后操作，温度的培养液的pH值有重要影响。正常按照说明书配制培养液溶液的pH不会差很多，建议将配好的液体在培养箱中平衡4小时以上以后再检测pH，然后再决定是否调整培养液的pH。
周伯通pp ( 16:29:54)
谢谢你的回复。那如果不调PH值，在氟箱里，二氧化碳会自己溶在培养液里，使PH值降低吗？我觉得现在加了胎牛血清的培养液颜色又开始有点紫红了。
周伯通pp ( 16:31:04)
谢谢大家。根据大家的建议，再加上这几次被折腾出来的经验，我想有这么几点要注意：
1.现在用的装培养液的瓶子确实太大，是250ml，一般在4c放一个月才能用完。马上换成小瓶的。（其余放－20c）。而且应尽量装满。
2.用的时候动作迅速，尽量减少跟空气接触的时间。
3.测PH：培养液在培养箱中平衡4小时以上再检测，然后再决定是否需要调整。
4..下次再配培养液时，可以试试加点HEPES，增加缓冲能力。
5.过滤一点HCL、NAHCO3，备用。（省得PH再不准时用有菌的酸碱调了之后还得过滤培养液）
对吗？谢谢大家。
tuuu2 ( 16:31:51)
DMEM可以-20度保存么？
JK.jon ( 16:32:37)
不可以吗？我们都是只留一瓶在4C，其他都放－20。有什么不对吗？
yes4 ( 16:33:31)
培养液不能冷冻保存的，而且需要加NAHCO3，一般我们配的可以在一年内使用，都不错的。
yjf1026 ( 16:34:08)
我本科毕业论文的实验室
有人专门配培养基
配完放在-4度，能放很久，都不变碱
可现在我自己配
好像很容易就碱了
我常常是每次取一些放到20ml小瓶中，加20%血清
如果放了两星期就变紫了
不知道原因
NaHCO3,HEPES都加了
rxcc33 ( 16:34:42)
我用的培养液不是DMEM，是199。不过我都一口气抽5L，500ml分装，4度保存，经常要用2～3个月的，从来没出现培养液变碱。反而，在加了血清后，由于平时的使用时经常开盖，时间长了才会变碱。所以一旦开盖了就要尽快用完。
还有培养液最好不要放在－20度，否则对细胞状态会有比较大的影响。（可能是我的细胞比较娇贵吧）。
不过在配培养液时，加点NaHCO3，对缓存PH效果会比较好。
周伯通pp ( 16:35:15)
谢谢。我觉得你说的很有道理。平常不开封的PH值变化较慢，加了血清之后因反复开盖使用，颜色“日新月异”。我平常习惯于取5m的血清加45ml的培养基，（10％浓度），因为养细胞处于摸索阶段，只有2个皿的几个组织块，一般两个多周才能用完。好好想想，真的是这样。l
可是，培养液不能冻存？我想不通为什么。我以后注意这个问题。
zzzz ( 16:35:51)
我以前是用MEM,没有觉得很快变碱，但DMEM 变碱就有点快了。最好是按用量分装，没必要放在大瓶中，打开的时间一长，很快变碱！
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第一节　免疫胶体金的制备
文献资料&-&医学书籍&-&和免疫学检验&
第十九章　金免疫技术
　　金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。迄今为止，金标记仍主要用于免疫组织化学中。在免疫测定中，金标记常与配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的简便、快速检验方法。
第一节　的制备
　　一、胶体金的特性和制备
　　（一）胶体金的结构
　　胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。
　　胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。
　　（二）胶体金的特性
　　1．胶体性质胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。
　　2．呈色性微小颗粒胶体呈，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（2～5nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。
　　3．光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长，表19-1所列为部分胶体金的λmax。
　　（三）胶体金的制备
　　1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有钠、、、白磷、等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：
　　（1）将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。
　　（2）搅动下准确加入一定量的1％三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。
　　（3）继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的水溶液在钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成。全过程约2～3min。
　　（4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。
　　用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。
表19-1&四种粒径胶体金的制备及特性
胶体金粒径（nm）&1％三钠加入量（ml）*&胶体金特性&
呈色&λmax&
16&2.00&橙色&518nm&
24.5&1.50&橙红&522nm&
41&1.00&&525nm&
71.5&0.70&紫色&535nm&
　　*还原100ml0.01％HauC14所需量
　　2．注意事项
　　（1）易潮解，应干燥、避光保存。
　　（2）对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
　　（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
　　（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
挂机一个月得百万，你还蓝瘦香菇么？
　　（5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。
　　肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。
　　胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。
　　二、免疫金的特性和制备
　　（一）免疫金的特性
　　胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。
　　胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。
　　（二）免疫金的制备
　　1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。
　　在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的（PEG，20000）稳定胶体金后，再胶体金的pH值。
　　2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。
　　由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低的蒸馏水透析去盐。
　　3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
　　4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
　　5．轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。
　　6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。
　　多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。
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