2018-11-22 14:56
来源:
析源医检
cf-DNA大多数是双链DNA分子，分子量范围很宽，在 0.18 kb～21 kb之间，其分子量低于基因组 DNA的分子量。在健康人的血浆中，cf-DNA来自于凋亡细胞，不来自于坏死细胞，而癌症病人血浆中的cf-DNA 除来自于凋亡细胞外，还来自于肿瘤细胞主动释放出的DNA 及肿瘤细胞坏死溶解释放出的 DNA。cf-DNA 在血液中的半衰期很短，只有约 16 分钟，因此 cf-DNA 能够用于实时动态监测。多项实验表明肝、脾和肾参与了 cf-DNA 的迅速清除。
cf-DNA 不仅可在癌症病人或其他破坏性疾病病人的血浆或血清样本中检出，在健康个体中也能检测到。过去，由于健康人血浆中cf-DNA 浓度通常很低，加之所用方法分析敏感度低，不能可靠地检测，因此，以前错误臆断它仅存在于病理标本中。现代尖端生物技术的发展，采用实时定量PCR 或荧光染料法，可检测人体血液中的cf-DNA。从而使对健康、亚健康群体和患者的 cf-DNA监测成为可能
癌症病人cf-DNA浓度比健康人高，此现象早已为所知，并被大量的科学研究反复证实。据Boddy 等报道，与对照组比较，癌症病人 cf-DNA 浓度增高。其定量改变来自于肿瘤细胞及邻近的非肿瘤细胞释放的 cf-DNA 增加。癌症病人 cf-DNA 水平受肿瘤阶段、大小、位置和其他危险因素及预后有关因素的影响，这些变动的影响在不同癌症之间不尽相同。此外还有很多研究证实了癌症患者的cf-DNA部分来自肿瘤细胞。用肿瘤鼠的血浆作细胞培养实验，显示 cf-DNA 被细胞吸收，且DNA 渗入到基因组中，由此建立了“基因转移假说”，根据这个概念，癌转移的形成可能产生于来自肿瘤的 cf-DNA。多项来自动物实验的结果表明，肿瘤转移与血浆中来自肿瘤的 cf-DNA 浓度比与循环肿瘤细胞（CTCs）有更密切的关系。
许多研究者研究了不同癌症时，cf-DNA对肿瘤复发及病人生存期的预后价值及对治疗反应的监测。在患乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌的病人中，大多数病例出现较高浓度的cf-DNA，是疾病生存期一个独立的危险因素，有不良后果。比如，Banki 等报道在食管癌手术切除的病人中，术后若 cf-DNA 值不断增加，在追踪时通常表示早期复发，比标准参数癌胚抗原 (CEA)或影像信息要早，且特异性和灵敏度都更高。
多项研究表明纳入cf-DNA 完整性指标能进一步提高cf-DNA 检测的准确性。cf-DNA 来源于凋亡和坏死的细胞。在凋亡时由于程序酶解的结果，自凋亡细胞中释放的 cf-DNA 碎片有一致的大小，范围在185~200bp。肿瘤病人的血浆中 cf-DNA 有更大比例来自于坏死细胞，其DNA 片段的长度分布与健康人不同。基于这个现象，DNA“完整性指数”界定为较长 DNA 碎片与较短 DNA 碎片的比率，是 cf-DNA 来源的指征，可在浓度基础上进一步修正肿瘤负荷。
2014年,德国的 Madhavan D 等发布了一项大型临床研究结果。该研究的目的是评估 cf-DNA 作为原发性乳腺癌（PBC）和转移乳腺癌（MBC）标志物的能力。共对 383 名乳腺癌患者（其中 82PBC、201MBC）以及 100 名健康人测定了 cf-DNA 浓度和完整性。MBC 组被进一步分为可检测到循环肿瘤细胞（CTCspos-MBC, n = 100）和未检出循环肿瘤细胞（CTCsneg-MBC, n = 101）两个组。检测结果显示，健康人、PBC、MBC 三组的 cf-DNA 浓度依次上升，DNA 完整性依次下降。综合 cfDNA浓度和完整性能够区别 PBC 和健康对照组（AUC = 0.75）。也能够区别MBC 和健康对照组（ CTCsneg-MBC AUC = 0.81 for ， CTCspos-MBC AUC = 0.93）。DNA 完整性与 PFS (HR = 0.46, P = 0.0025)和 OS 正相关。预测的可靠性高于 CTCs。
2014年，中国的 Hao TB 等发表了cf-DNA 临床研究报告。样本来源是 104位原位结直肠癌、85位手术后结直肠癌患者、16位结直肠癌复发转移患者、63位良性肠息肉患者和 110位健康人。检测结果显示：原位结直肠癌组的 cf-DNA 浓度显著高于良性息肉组和健康组(both P<0.0001)；复发转移组显著高于原发癌组 (P<0.002)和手术后组 (P<0.0001)。此外，连续监测显示 cf-DNA 浓度在手术后显著下降。
Zaher ER 等于2013 年发表的大型多癌种临床研究选取了120 位肿瘤患者、120 位良性病患者和 120 位健康人做为对照。检测结果显示癌症患者的 cf-DNA 水平显著高于良性病组和健康组，ROC 曲线的AUC 值分别高达 0.962 和 0.895，可见 cf-DNA 作为肿瘤标志物的有效性，论文作者建议将 cf-DNA 浓度和完整性作为广泛使用的癌症筛查工具。
越来越多的证据表明：cf-DNA 检测对肿瘤筛查、诊断、治疗效果评估和预后监测有很高的临床价值。大量临床研究覆盖了乳腺癌5、结直肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌以及其他多种类型的实体肿瘤。返回搜狐，查看更多
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2019-10-22 20:00
来源:
检验科空间
作者：李禹龙 贺建勋 曾小莉 袁慧
游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）是一种血液或体液中游离于细胞之外的DNA。1947年，Mandel和Metais[1]首次报道了外周血中存在cfDNA。生理情况下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡，在某些疾病和特殊状态下，其他细胞也会释放游离DNA入血，包括来源于肿瘤细胞的循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA），来源于胎儿的cfDNA等。1994年，Vasioukhin等[2]和Sorenson等[3]在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和胰腺癌患者外周血ctDNA中发现了RAS基因的突变，表明可以利用ctDNA发现肿瘤的特异性基因突变。随着新的研究结果的不断出现，cfDNA用于疾病早期诊断、预后评估、疗效监测等方面的潜在价值越来越受到关注。检测血浆或血清中cfDNA可视为一种"液体活检"，有利于开展各种相关诊断，并能避免有创的组织活检。以血液为检测标本，使重复采集检测样本成为了可能，从而有利于对疾病的发展及肿瘤的治疗过程进行跟踪监测。
血液中cfDNA的来源与细胞凋亡、坏死和细胞主动分泌DNA有关。正常生理情况下，巨噬细胞会清除凋亡和坏死细胞，因此健康人血中cfDNA浓度很低。然而，在恶性肿瘤、剧烈运动或体内存在炎症等情况下，巨噬细胞不能有效清除凋亡和坏死的细胞，细胞内的DNA被释放至血中。目前cfDNA的检测主要用于肿瘤的检查和产前诊断，但是，最新的多项研究表明，cfDNA水平在心肌梗死、冠心病等心血管疾病中也会出现显著的升高[4]。
一、cfDNA的生物学特点
cfDNA多以DNA和蛋白质结合的复合物形式存在，仅极少数为游离的DNA片段。cfDNA在血浆和血清中都有存在，健康人外周血中cfDNA浓度大都小于100 ng/ml，平均值约为30 ng/ml。而在肿瘤患者体内，外周血cfDNA浓度可高达到1 000 ng/ml，平均值约为180 ng/ml。在其他的一些疾病，包括术后、寄生虫病、心血管疾病等也可见cfDNA水平的升高[4,5,6,7]。
目前，血浆cfDNA的产生机制尚不明确。医学界主要认可两个主要机制，其一是细胞发生凋亡或者坏死后会释放出DNA片段。凋亡坏死的细胞产生这些带有典型的凋亡坏死细胞特征的片段化基因组DNA可通过毛细血管壁或者淋巴管壁渗透到外周血循环中。另外一种观点认为，是有核细胞裂解释放出DNA片段，例如一些侵入外周血循环的细胞（如肿瘤细胞）会在吞噬细胞的作用下裂解释放出DNA片段，从而产生cfDNA[8]。目前普遍认为细胞发生凋亡或者坏死释放的DNA片段是cfDNA的主要来源，但是不同疾病发生的病理生理进程不同，致病机制和疾病微环境也不同，因此不同疾病导致产生cfDNA的过程极为复杂，单一机制不能充分的阐明cfDNA产生的来源，往往是同时存在这两种产生机制。
二、cfDNA的检测方法
目前cfDNA的检测方法包括单链构象多态性分析聚合酶链反应法（polymerasechain reaction，PCR）、限制性片段长度多态性PCR法、测序和数字PCR等。前两种方法由于敏感度较低，目前已经被后两种方法取代。
测序法可以对cfDNA进行深度分析，对未知突变进行筛查，并分析基因遗传多态性。该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序，目前所说的高通量测序技术主要是指第二代测序和单分子测序，以及在这两者基础上发展的技术[9]。第二代测序技术的原理主要是酶级联化学发光反应，即在生成新DNA互补链的过程中，要么加入的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）通过酶促级联反应催化底物发光，要么直接加入被标记的dNTP，使其在合成或连接生成互补链时释放信号，通过捕获信号来转化为一个测序峰，从而得到序列的信息。单分子测序技术的原理主要是对待测DNA进行随机打断，之后对小片段末端加上poly-dA，然后使之与芯片上的poly-dT杂交并精确定位，再逐一加入荧光标记的末端终止子，之后进行检测并对荧光基团切除，允许下一个核苷酸渗入，如此通过渗入、检测和切除的循环，即可实时读取大量序列。
数字PCR法灵敏度更高，检测速度更快，但只能对已知的cfDNA突变类型进行分析。其主要的原理是将单个DNA分子于独立反应室中进行PCR扩增，利用不同标记的探针检测特定的靶DNA序列，根据呈现的不同信号类型的反应单元比例和数目进行统计分析，实现检测特定血浆cfDNA的绝对定量[10]。在整个检测过程中不需要扩增标准曲线和管家基因，准确度和重复性好，能够实现真正意义的绝对定量。根据其分液方式的差别，可以分为3种：微流体数字PCR、微滴数字PCR和芯片数字PCR。其中在血浆cfDNA检测中，微滴数字PCR的方法应用更为广泛和成熟[11]。
另外，基于实时荧光定量PCR平台检测cfDNA的方法也广泛应用，如扩增受阻突变体系和肽核酸钳制PCR等[12]。对于cfDNA的检测也具有高灵敏度和特异度，然而由于其价格比较昂贵以及技术的复杂性，制约了这些检测方法的发展。
三、cfDNA在疾病诊断中的应用
1．cfDNA在肿瘤诊断中的应用：
肿瘤患者血浆内循环肿瘤细胞释放或原位肿瘤细胞释放入循环的cfDNA也称ctDNA，ctDNA在肿瘤诊断中的研究方向主要包括：ctDNA突变的检测、肿瘤特异性微卫星改变、表观遗传学改变、ctDNA完整性检测以及病毒DNA检测。ctDNA的突变检测既能够得到与肿瘤组织相对应的基因突变结果，也能够更敏感更特异的检测出肺癌的EGFR基因突变、结直肠癌的KRAS突变、黑色素瘤的BRAF突变等典型的特征性突变。研究表明，检测肺癌患者ctDNA中的EGFR基因突变，敏感性可以高达80%以上，有利于监测耐药基因[11]。而转移性结直肠癌患者血浆ctDNA中KRAS基因突变的检测敏感度高达87.2%，特异度高达99.2%[13]。另有研究对59例结直肠癌患者的血浆ctDNA突变谱进行筛查，发现至少128种基因点突变，其中筛选出特征性突变24种，最常见的是KRAS（G12C）、KRAS（G12D）、KRAS（G12V）、TP53（R273C）和BRAF（V600E），通过联合多重PCR、深度测序和数字PCR的方法，仅仅需要等位基因突变的频率在0.1%以上即可检出[14]。另外，检测血浆ctDNA还能获得疾病早期的DNA突变结果，利用二代测序等更灵敏和特异的方法检测ctDNA，能够发现胃癌、乳腺癌和肺癌的肿瘤早期特定基因的突变[15,16]。
肿瘤ctDNA完整性检测也是当前研究的热点。完整性检测的主要原理是由于肿瘤坏死过程中会释放出较长较完整地DNA片段，而正常凋亡的细胞释放的cfDNA则较短。检测ctDNA的完整性能预测早期癌症的发展和微转移[17]，目前研究最多的是ALU和LINE1序列，它们在DNA损伤修复、转录过程、表观遗传和转座子等方面起到重要作用[18]。ctDNA完整性的检测是独立于基因突变的检测因素，与体细胞突变检测联用可以提高检测灵敏度和特异性[19]。另外，研究ctDNA中基因杂合性缺失[20]以及ctDNA的甲基化水平[21]也能为肿瘤的特异性诊断和患病风险预测提供帮助。ctDNA的甲基化检测也有助于肿瘤的早期诊断。
目前肿瘤ctDNA的检测方法逐渐增多，新的方法如碱基位点错配率的高通量测序分析和特殊基因启动子的甲基化分析都能更准确捕获到肿瘤内在异质性的特征。阐明ctDNA的特殊基因或表型改变可以更好地反映肿瘤发展过程的分子异质性特点，也有利于监测实时的基因突变情况，便于判断预后和疗效。
2．cfDNA在无创产前筛查中的应用：
cfDNA检测也广泛应用于无创产前筛查（noninvasiveprenatal testing，NIPT）中。对于NIPT检测cfDNA的方法主要是基于下一代测序技术（next-generationsequencing technology，NGS）的方法发展的，包括随机高通量平行测序、靶点或染色体特异性测序和单核苷酸多态性测序[22,23,24]。孕妇血浆中的胎儿cfDNA约占母体血浆总cfDNA的10%以上，通过检测这些胎儿cfDNA的情况可以判断胎儿的RhD血型、性别、染色体非整倍体疾病、单基因遗传病等相关信息。另外，这种检测孕妇血浆胎儿cfDNA的方法较羊水穿刺或者绒毛活检等侵入检查方法创伤性小，大大降低了宫内感染、流产等并发症的风险[25]。目前主要应用于对于常见的非整倍体染色体疾病，包括21三体综合征、18三体综合征和13三体综合征的筛查判断[26,27,28]。此外，其在性染色体非整倍体疾病、染色体微缺失、拷贝数异常以及一些单基因遗传病中也有报道[29]。研究[30,31]发现，无创产前筛查cfDNA具有极高的敏感度（大于99%）和特异度，而假阳性率比较低（小于0.1%）。目前，国际产前诊断学会（International Society forPrenatal Diagnosis，ISPD）[32]、美国妇产科医师协会（The American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）[33]和美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）[34]推荐具有高危风险因素的孕妇应在怀孕时进行cfDNA检测染色体非整倍体疾病（如21三体综合征）和单基因遗传病。而也有研究认为即使非高危风险因素的孕妇也应该进行cfDNA的无创产前筛查检测[35,36]。2016年ACMG更新了相关的建议，提出了针对所有的妇女，NIPT都应该是一种胎儿非整倍体筛查的选择[37]。目前对于21三体、18三体和13三体的检出率已经提升到99%、90%和89%[27]。通过提取母体血浆的凋亡的胎儿滋养层细胞释放出的cfDNA，来检测胎儿是否存在21三体、18三体和13三体的异常染色体表现，甚至对于性染色体X和Y的异常情况也能进行判断[38]。最近的研究表明通过血浆cfDNA检测21号染色体三体异常的敏感度和特异度分别是100%和99.5%，检测18号染色体三体异常的敏感度和特异度分别是91%和99.2%，检测13号染色体三体异常的敏感度和特异度分别是100%和99.6%[39]。据此，进一步表明利用cfDNA检测胎儿染色体是否存在异常的适用性好。
针对cfDNA的NIPT筛查不仅能发现非整倍体和单基因遗传缺陷，还能发现胎儿染色体是否存在微缺失现象[40]。而针对cfDNA的NIPT检测具有较高的灵敏度和较低的假阳性率，这种方法可以用来对胎儿的先天性疾病进行筛查以决定是否需要进行有创检查来确诊，但是目前的研究认为对阳性结果仍需要使用经典的有创检查进行确诊[41]，可以考虑的检查方法包括荧光原位杂交（fluorescence insitu hybridization，FISH）、羊膜穿刺活检以及基因芯片技术等。
3．cfDNA在心血管疾病检验中的应用：
cfDNA主要来源于凋亡或坏死的细胞，在这种情况下会因cfDNA的释放入血而出现血浆内水平升高。冠心病往往会出现心肌长时间严重缺血导致的心肌细胞的坏死和凋亡。特别是在心肌梗死（myocardial infarction，MI）发生时，除了伴随心肌缺血造成的心肌细胞坏死和凋亡引起cfDNA的升高，cfDNA的清除延迟和障碍也与疾病的发病有关[42]。冠心病患者血浆cfDNA升高可以用以补充心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）的诊断结果。研究[43]显示，MI患者血浆cfDNA浓度较健康对照升高10倍以上，此外，cfDNA的水平也是一个独立的检测指标，其浓度水平和CK-MB、cTnI以及C反应蛋白无相关性。由于心肌损伤出现时，血浆cf-DNA和肌红蛋白、CK-MB、cTnI等释放的动力学不同，这些指标的达峰时间也各不相同[42]。cfDNA浓度在心肌损伤早期即可升高（远早于肌钙蛋白），而达峰时间要晚于CK-MB，可以用于早期检测判断心肌损伤情况。另外，cfDNA水平还是一个潜在的监测疾病进程和患者预后的指标[44]。随访结果显示，出现心脏不利结果的MI患者血浆中cfDNA的水平升高达3.5倍以上[44]。同时，cfDNA的特异性检测也对研究冠心病的致病机制有帮助。研究发现，由于心肌细胞表达Toll样受体9（Toll-LikeReceptor 9，TLR9），富含GC序列的cfDNA能够识别TLR9从而降低心肌细胞收缩频率[45]。所以，检测富含GC序列片段的cfDNA有助于认识急性心肌梗死的严重程度和可能的致病机制，从而对其心肌收缩功能的降低提供一种解释。
由于心力衰竭也存在心肌细胞的凋亡和坏死，故也会出现血浆cfDNA的升高。cfDNA可以作为一种心肌功能提高的潜在诊断指标。超过50%的左西孟旦治疗后的心衰患者血浆cfDNA水平的大幅度降低。然而，基于样本量和统计学原因，该研究并未发现cfDNA的水平在心衰患者和健康对照组之间存在差异[46]。另有报道[47]，在心衰患者血浆中循环核小体水平存在升高的现象，其升高水平与炎症以及心衰其他指标（如N-末端脑钠肽）具有显著相关性，提示基于大样本分析数据表明心衰患者血浆cfDNA显著高于健康对照组。
4．cfDNA在其他疾病中的应用：
除了在肿瘤、无创产筛以及心血管的应用外，尚有报道[48]认为cfDNA的检测可以应用在自身免疫疾病、感染性疾病、创伤、移植排斥反应、急性胰腺炎、卒中和急性肠系膜缺血等方面。特别是在移植排斥的监测上有很好应用。通过检测尿液中游离DNA特异性可以很好地连续监测肾移植患者发生早期急性移植排斥反应[49]。
四、目前cfDNA检测临床应用中存在的问题
目前cfDNA检验应用于临床常规的瓶颈主要集中于方法学和样本的质量上。cfDNA检测对方法学要求极高，虽然目前cfDNA的检测方法都具有很高的敏感度和特异度，但是仍存在一些和传统病理学或细胞遗传学检测结果不一致的情况。以产前筛查为例，对于无创产前检测阳性的结果仍需经过有创产前诊断的方法进行证实，目前仍以细胞遗传学的检测结果作为金标准[33,50]。另外，由于不同厂家所提供的提取和检测的方法都不同，导致对于同一段cfDNA检测的定量定性分析都存在差异。由于这种标准化操作的缺乏，使用不同方法检测同一cfDNA的实验室结果也存在一定差异[51]。目前普遍认为数字PCR方法和高通量测序方法具有极高的检测灵敏度和特异性，但是数字PCR只能检测已知突变，检测的成本和时间也会随检测位点的增加而增多；高通量测序方法对提取得到的DNA浓度和质量要求较高，同时也具有较高的成本和检测周期，都不利于临床常规开展[52]。另一方面，由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微，标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量，造成假阳性或假阴性的结果[53]。所以，优化提取和检测的方法，进一步提高检测cfDNA方法的灵敏度和特异性，缩短检测的时间，降低检测的成本，同时实现检测方法之间的标准化，都是亟待解决的问题。
综上，cfDNA以其早期出现入血和无创检测的优势，将逐渐成为多种疾病筛查的常规检测指标。未来的研究除着眼于cfDNA与不同疾病的相关性和检测价值外，还应进一步发展更便捷更经济的检测方法，使之能尽快进入日常常规实验室，成为检验科常规检验项目。
选自中华检验医学杂志,2019,42(4)
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ctDNA液体活检是基因科技下一个巨大的潜在市场。编辑丨高雨杉10月11日-13日，“天府健谈·CHS 2021第六届中国大健康产业升级峰会”正式召开。本届峰会由中国卫生信息与健康医疗大数据学会全科医学与健康管理工作委员会、亿欧EqualOcean主办，四川省卫生健康委、中国卫生信息与健康医疗大数据学会指导，中国卫生信息与健康医疗大数据学会三医联动健康保障分会、健康保险工作委员会、信息及应用安全防护分会协办，成都市卫生健康委支持，亿欧大健康承办。中国大健康产业升级峰会已成功举办了5届，本届峰会以“集成创新·引领产业融合”为主题，围绕数字医疗、AI和计算驱动的新药研发、基层医疗、支付创新、基因检测、中医康养、智慧养老七大细分领域的市场环境、投资热点和产业变革等话题展开探讨，共包括1场开幕式、7场产业论坛、1场晚宴盛典、3天产业创新展、1场创新项目路演、1场院长培训班。在10月13日的基因检测产业论坛上，桐树基因CEO严令华发表了以“ctDNA——肿瘤基因科技下一次腾飞”为主题的演讲，他的核心观点如下：1、判断ctDNA技术是否具备价值的两个最大的关键指标，是组织和血液的一致率。2、ctDNA技术的优劣需要由前瞻性的临床结果来证实。以下为其演讲全文（在不改变原意的基础上略有删改）：今天我将分享一些桐树基因在ctDNA液体活检赛道中的技术优势和看法。桐树基因取名自凤栖梧桐、凤凰涅磐，这是因为我们认为肿瘤患者在做基因检测以后就像经历了凤凰涅盘，而我们希望作为梧桐树。桐树基因为大家所知，一是因为我们获得了迄今为止国内第一张结直肠癌微卫星不稳定（MSI）试剂盒三类医疗器械证书；其次是我们的ctDNA检测技术平台，ctDNA检测技术平台近期刚在CSCO的黑科技比赛中取得了第一名。可以说，两者都是桐树基因的优势。在认知国内肿瘤基因检测市场的时候，我们从两个方面来分析，首先是中国人群的人口老龄化和癌症高发病率；其次是相较国外，肿瘤分子诊断渗透率低。这样看来，整个国内肿瘤基因检测市场的增长是非常值得期待的。做为从业者，经常会被问到一个问题：肿瘤基因检测的终局在哪里？我觉得肿瘤基因检测的终局还遥不可及，这个赛道至少还有10倍以上的空间。我曾经是临床医生，我认为能够承担肿瘤基因检测费用和高昂药费的人进入了肿瘤高发年龄范围。众所周知，肿瘤的中位发病年龄在65岁，原来发病的群体都是我父母一代，他们连支付100元看病都不愿意。得益于改革开放，70年代生人步入了50岁，这部分支付意愿强的人开始生病了，这是我认为生物医药发展的核心逻辑。在这个过程中，医药行业会有销售额超出10亿元的大品种药物，但是在肿瘤IVD行业，目前没有单品种超过10亿元的品类。那么在IVD行业中我们是否能发掘超过10亿元市场潜力的“大品种”，这才是未来市场10倍增长空间的所在。这里就不得不提到液体活检，液体活检如何帮助到患者呢？这首先涉及对肿瘤发展发生过程中基因组学特征的理解，知己知彼，百战不殆。而我们原来的组织检测其实皆是单点检测，其中最大的问题就是肿瘤异质性。而对晚期患者的液体活检是能够克服肿瘤异质性的。举个例子，组织监测和液体活检的动态检测的区别，就如同单看一张照片和看电影的区别一样，电影能够叙述的内容肯定比画要更加清晰，如果基因检测能够进行动态监测，这能帮我们更好、全方位的了解肿瘤，以此去攻克肿瘤。自2018年到2021年，针对ctDNA的指南共识也迎来了改版。曾经所有指南中都说ctDNA（血浆）是组织的补充，而今年国际最大的肺癌协作组织IASLC首次发布了一个共识（指南）定义了ctDNA（血浆）优先的场景。指南中提到两类患者应用于血浆优先的场景，第一类患者是初治患者，可能组织样本不够做基因检测；另外一类经治患者，是在其监测靶向治疗疗效、微小残留灶和耐药机制里面，液体活检被定为首选方法，也就是说在经过治疗的患者当中，如果接受过靶向治疗或者化疗，接下来所有的治疗都是先做血液检测再做组织检测，血液阴性再去做组织检测，这就把血液的ctDNA检测重要程度大大提高了。刚才的话题集中在早筛环节，早筛的目的是提高五年生存率，这是一个二级预防措施，使晚期患者因提早发现而变成早期患者，这能大大提高患者的五年生存率，比如早期患者术五年生存率是57%，晚期患者则是5%。但如果在术后阶段，让部分患者够通过MRD的检测获得治愈的机会，这个市场需求也不小。早筛和术后对患者的意义其实是并重的。中国的早筛市场在60亿美金，术后复发市场在38亿美金，我认为伴随诊断市场总体在25亿美金，其中15亿美金是动态检测的市场。真正伴随诊断的市场在30~40亿美金左右。ctDNA检测技术是未来肿瘤早筛、术后复发监测、晚期患者动态监测，从而大大延长患者生存的底层技术。就像做手机，手机做得再好，芯片是底层技术。但为什么这样一个底层技术在2018年时会遭遇“歧视”呢？第一个原因是ctDNA含量很少，平均丰度少于0.19%。其次是在丰度0.1%以下的在测序过程中背景噪音大大增加，之前很多技术都陷入了一个误区——解决噪音，我个人认为有些矫枉过正。第三个问题是克隆性造血，ctDNA的突变可能不仅仅来源于肿瘤。这三大障碍导致了ctDNA检测技术是有一定壁垒和门槛的。我举个例子，我们一直在分析端寻求降噪，单端接头不够双端接头，去保证PCR扩增里面没有错误。但ctDNA从离开人体到上机测序会损耗76%的ctDNA，这个过程历经血浆分离、cfDNA的抽提、文库构建、上机测序、数据分析，再好的生信分析最多只能挽回其中的20%。寻找ctDNA就像钓鱼，在亿万条青鱼里面去钓一条黑鱼出来，光鱼钩、鱼饵好有用吗？我觉得不一定有用，这当中的数据是这么的复杂。这个过程中其实还存在一个悖论，这“万分之一”的挑选只存在与实验室当中，不存在临床过程当中。如果在4毫升血浆里面有1万个拷贝，这个数量正好。但实验是有损耗的，要稳定检测出这“万分之一”至少需要4毫升血浆的4倍，这样每个患者要抽50毫升血。如果能稳定让每一个患者去抽50毫升血，“万分之一”的寻找才是有意义的，否则所有都没有意义。我认为不要去追求技术上的优势，而是追求一个临床指标来帮助我们衡量。ctDNA技术再好，也要拿到真实临床环境里面跟患者的组织去比一比。2018年之前，全球数据中，NGS、DDPCR、SuperARMS三种检测方法，所得出的结论基本上组织和血液的一致率在70%左右。桐树基因的ctDNA技术最区别于市场的，是从抽提、建库、NGS分析到ctDNA标准品全方位去解决ctDNA的问题。核心解决了76%的损耗问题。我们用抽提来举例，我们对标的是国际知名的cfDNA抽提试剂盒，我们富集的100到400游离核酸片段比国际知名试剂盒多了将近20%。光这一步的增长就比生信分析的10万层测序、5万层测序要好，因为相当于增加了20%ctDNA进去，这之中我们用了专利的抽提技术。其实国际试抽提试剂盒是有顶层限制的，因为我们全方位解决，桐树基因的组织和血液的一致率大概能达到80%，这一数据和FoundationOne、Guardant health在招股书里的一致率数据是基本相同的。我个人觉得如果组织和血液的一致率能够达到80%，基本上晚期患者是100%能够检出的，因为按照我们的经验来说，同一患者的组织检测结果的一致率也就在85%左右。另一方面，在应用到临床的时候一定要有临床数据来验证。仍然举例子，曾经我们做肺癌治疗的时候，晚期患者的含铂两药化疗中位OS是8个月，安慰剂的中位生成期是6个月，我们可以看到，只要你有临床数据的验证，即便只延长了两个月也能成为标准。用临床数据来验证技术是非常重要的，而且这个验证一定要是前瞻性的数据。有一个能够衡量技术优劣的指标，是复发患者的ctDNA阳性率，这标志着复发的患者你得检出来，检出阳性可以不复发，但是复发的一定要找到，这是这个指标非常关键的一点。不过很可惜这个指标还是回顾性指标，希望后面有更大的前瞻性的临床研究能够证实。目前而言，验证ctDNA技术的临床研究方案只有两种：1、先检测，检测后分为阳性和阴性，然后用标准治疗和intensive治疗进行对比，这种方案不仅解决了ctDNA检测的问题，还解决了用药的问题。2、只检测，检测了以后阳性组intensive治疗，没有检测的拿一组作为对照组，这个临床研究的设计主要解决一个问题，只解决检测有没有用的问题。桐树基因会同步启动国内三个前瞻性的大型临床研究，明年或者后年我们会公布初步数据，是前瞻性头对头的比较，根据我们检测的MRD的结果来改变治疗的方案。最后总结一下，ctDNA液体活检是基因科技下一个巨大的潜在市场，在此分享破局的两大观点，第一，要抛弃技术指标，用临床数据来做验证的金标准，要以终为始，拿终局和结果来判断；第二，无论何种技术，都需要用临床研究数据和结局来证实。桐树基因的第一步，MSI拿到了证，第二步就是我们要做整个肿瘤液体活检基因科技的引领者，谢谢各位。请尊重原创，转载需获得许可本文由“健康号”用户上传、授权发布，以上内容（含文字、图片、视频）不代表健康界立场。“健康号”系信息发布平台，仅提供信息存储服务，如有转载、侵权等任何问题，请联系健康界（jkh@hmkx.cn）处理。
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