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点击联系发帖人 时间：2022-06-26 00:01

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石金钱龟板酶解肽改善PCPA诱导失眠小鼠神经递质系统紊乱促进睡眠的机理研究

睡眠是一种对人类健康起着重要作用的生理活动。它有助于神经系统的能量储存和恢复，并能加强大脑连接，帮助人们学习和记忆。然而，失眠已经逐渐成为一种常见病，大约35%的人经历过失眠症状的折磨。睡眠不足会导致非常严重的健康问题，如抑郁症、心脏病、高血压和肥胖，而目前市面上的镇静催眠类药物有效但副作用明显，长期使用更可导致耐受性和成瘾性。几十年来，睡眠调节已成为世界性难题，迫切需要安全有效的催眠镇静类产品。因此，具有镇静催眠作用的中草药因其安全性和有效性逐渐被世界所接受。

石金钱龟龟板是一种药食同源中草药材，具有解毒、消炎、镇静、益脑等作用。目前，从传统饮食和药用材料中提取的生物活性肽的潜在生理功能引起了广泛关注，许多研究证明了多肽具有诸如抗菌、抗肿瘤、抗氧化、免疫增强、神经调节和神经保护等作用。我们通过从石金钱龟龟板中提取活性多肽，利用动物实验探究其促睡眠效果及分子机制，为开发基于食疗的高效低副作用的促睡眠产品奠定实验基础。

对氯苯丙氨酸（PCPA）可以通过抑制色氨酸羟基化阻断5-HT合成，造成小鼠神经递质系统紊乱，使小鼠失去昼夜节律不能睡眠，可建立失眠模型。戊巴比妥钠可通过抑制脑干网状上行激活系统，起到模拟睡眠效果，根据睡眠潜伏期，睡眠时间可判断小鼠睡眠状况。5-HT、DA、GABA、IL-1、BDNF是脑内与睡眠密切相关的神经递质和细胞因子，通过测定以上因子的变化，可判断小鼠大脑神经递质系统的功能变化情况；进一步采用western blot技术测定5-HT1A受体和GABAA受体α1亚单位的含量变化，有助于推断其可能调节睡眠的机理。最后利用高效液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱（HPLC-ESI-QqTOF-MS/MS）联用，鉴定石金钱龟多肽提取物的主要成分结构，有助于寻找镇静催眠作用的关键活性肽成分，为石金钱龟多肽高附加值产品的开发奠定理论基础。

图1 本研究技术路线图

本研究结果表明高剂量石金钱龟龟板肽在促进睡眠、改善神经递质系统紊乱、增加促睡眠因子含量、使5-HT1A受体和GABAA受体α1亚单位表达正常化等方面效果最佳。阳性药物地西泮在增加5-HT和GABA含量方面优于肽，但不能调节神经递质受体的表达。这也表明石金钱龟龟板肽肽不仅可以改善睡眠，还可以防止失眠引起更严重的精神疾病。在最终的结构鉴定过程中,我们发现PMM多肽的许多氨基酸具有镇静和抗氧化作用，个别肽段的重复氨基酸结构和己糖基化修饰为肽的高活性值提供了理论依据。

图2 本研究结果推测龟肽有助于调节睡眠的可能信号通路

论文获资助信息：中央高校基础研究基金(2)的支持。

第一作者信息：吕彦帛，华中农业大学食品科技学院毕业，现就读于复旦大学脑科学研究院药理学博士，研究方向是学习记忆及药物成瘾的神经机制。

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实现无损且精准的神经调控是长久以来神经家们梦寐以求的。

北京时间2020年8月18日晚23时，Cell Reports在线发表了香港理工大学团队的最新研究成果，研究人员证明了低频超声可以打开来自细菌的机械敏感通道MscL。

利用这一发现，人为地将MscL选择性表达在特定神经元上，可以增加所选择神经元对超声的敏感度，从而利用较低的超声强度实现对其的控制。

超声波可以无损地穿过颅骨并被聚焦在大脑的任意毫米级区域。因此本技术实现了小鼠大脑中的无损精准神经调控。

香港理工大学副教授孙雷为该论文的通讯作者，丘志海博士、Shashwati Kala, 郭景慧博士和博士生冼铨香为该论文共同第一作者。

光遗传学（optogenetics），是一种利用光进行精准神经调控的新技术。光遗传学的基本原理是——将光敏感通道蛋白选择性地表达在特定的神经元中，然后通过特定波长的光照实现神经元活动的快速控制。

然而颅骨和脑组织对光的散射严重，导致光在脑中的聚焦变得困难。通常的做法是利用纤细的光纤将光能量导入到需要刺激刺激的脑组织当中。在脑中插入光纤是一个有损的过程，因此限制了其在很多场合中的利用。

例如在发育过程中，脑组织还在发生结构性的变化，光纤的存在将对发育本身起到很大影响。因此，如何无损地精准调控神经元成为目前一个主要的技术挑战。

超声遗传学，模仿光遗传学技术，将超声敏感蛋白表达在特定的神经元中，然后利用超声波实现对特定神经元的激活。

超声波可以无损地通过颅骨，被精准地聚焦在人脑任意一个毫米级的小区域内，它在人脑部疾病的临床治疗中已经有应用。

例如利用核磁引导的超声阵列，将超声能量集中在小范围，实现特定组织的消融，从而治疗包括脑肿瘤和Essential tremor 等疾病。

相比于光，它具有很好的穿透能力，可以到达人脑中最深的区域；相比于磁场，超声具有较高的空间分辨率，可以被聚焦在毫米级的脑区。

最近的研究表明，超声波可以激活机械敏感通道 [1-2]，这为超声遗传学奠定了坚实的基础。本研究开始于2015年，从开始到见文，历时五年有余，可见交叉学科研究的不易之处。

图1 ，超声遗传学原理图

本研究首先从离体HEK293t细胞开始，选择了著名的源自细菌的机械敏感通道MscL作为目标，证明超声可以打开MscL，选择性地在MscL过表达细胞中引发钙离子内流（如图2a所示）。

在神经细胞中过表达机械敏感通道，可以提高其对超声的敏感度，从而用更低的超声能量激活所选择的细胞，而没有机械敏感通道过表达的细胞则不会被激活。

利用腺病毒，将MscL过表达在元代培养的神经元细胞中，用钙离子成像，证明了这些神经细胞表现出了对超声更高的敏感性，即用更低的能量可以激活这些神经元（如图2b所示）。

图2， MscL增加A）293t细胞和B）神经元对超声的敏感性

精准神经调控可以引发对应的行为变化。在证明了MscL可以增加神经元对超声的灵敏度后，研究人员将MscL表达在小鼠的M1区域，利用EMG表征其刺激效果。

如图3A和图3B 所示，0.5MHz、声压为0.1MPa的超声波可以引发MscL表达小鼠的肌肉反应，不会引起控制组小鼠的反应，而且从超声发射到引发肌肉相应的延迟在200ms以内，显示出较高的时间分辨率。

超声遗传学可以无损调控深脑区神经元。利用c fos 作为指标，研究人员发现超声激活MscL具有空间靶向性：当MscL表达在M1时，c-fos 的表达主要集中在M1区域，当MscL表达在DMS中，c-fos的表达主要集中在DMS （图3C-D），表明超声遗传学可以无损地、选择性地激活深脑区神经元。

图3， A）声遗传学活体实验示意图；B）典型的EMG响应结果图；C）MscL靶向的c-fos激活以及在c-fos激活效率在D）M1和DMs的统计结果图

基于上述结论，研究人员展示了一种新的无损精准神经调控技术，为将来的应用打下了坚实的基础。

转载本文请联系原作者获取授权，同时请注明本文来自小柯生命科学网博客。

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要是说起运动对人体的好处，这话可就长了。运动可 改善人体的新陈代谢，促进骨骼生长，提高骨密度，强健肌肉，提高心肺功能。经常运动的人 神经系统的调节功能得到强化，身手更敏捷、灵活。运动可消耗脂肪，增加肌肉， 帮助你减肥和塑型。除了这些生理上的好外，运动还可以给人 带来愉悦感，缓解紧张情绪，减轻压力……

运动的好处真是数不胜数，这也让其成了科学研究的热点，尤其是运动在减缓认知老化和神经退化方面，一直受到重点关注。有研究表明运动带来的认知益处，与海马体内的可塑性增加和炎症减少有关，但对调节这些影响的因素和机制仍知之甚少。

clusterin 的研究性论文，比较了相同年龄的运动小鼠和久坐小鼠的血液样本，发现 将跑步小鼠的血液输到久坐小鼠的体内，可以减少小鼠的神经炎症，并提高他们的认知能力 。

此外，研究人员分离出一种血源性蛋白质—— clusterin（CLU），该蛋白质似乎在抗神经炎症中发挥着重要作用。这一发现可以为治疗打开大门，通过控制久坐不动的人的大脑炎症，降低他们患神经退行性疾病的风险或减缓其进展。

跑步小鼠的血浆可改善认知

首先，研究者检测了运动对小鼠海马体的影响。 在小鼠跑步 28 天后，海马体中整体细胞存活率增加，包括神经元（NeuN + BrdU + 细胞）、神经干细胞和祖细胞（NSPC；Sox2 + GFAP - 细胞）和星形胶质细胞（GFAP + BrdU + 细胞）。

鉴于运动对海马体的有益影响，研究者将来自运动雄性小鼠的血浆输入到同窝出生的不运动的小鼠身上，看其是否可以产生运动相同的效果。令人惊奇的是，与输对照组血浆的小鼠相比， 接受运动小鼠血浆的受体小鼠的总增殖细胞、DCX + 神经母细胞和存活细胞数量显著增加 。然而，存活的成熟神经元的数量并没有显著增加，而是导致新产生的星形胶质细胞的存活率增加了两倍。

此外， 输入运动小鼠的血液后，受体小鼠的空间学习能力和记忆力也得到增强。这些结果表明，运动可以改善小鼠的认知能力，且输入跑步小鼠的血液后也可以提高受体小鼠的认知能力。

跑步小鼠的血浆可减少神经炎症

由于跑步小鼠血浆的输注下调了免疫和炎症基因，研究者测试了跑步小鼠的血浆是否可以减少受体小鼠的急性神经炎症。

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，通过外周注射 LPS 可以诱导脑血管和中枢神经炎症，模拟与神经退行性疾病相关的神经炎症。LPS 注射处理后，导致小鼠海马体中有 4,936 个基因差异表达。令人兴奋的是， 输注跑步小鼠血浆处理治疗后，逆转了大量这些基因的表达。对最重要的 500 个差异表达基因进行通路分析，发现 主要与对细胞因子的反应、先天免疫反应的调节、对刺激和细胞因子产生的反应的调节相关。总之，这些结果表明 运动小鼠的血浆能有效地拮抗海马体中 LPS 诱导的神经炎症反应。

跑步改变补体和凝血途径的蛋白质

研究者接下来探讨了跑步如何影响血浆蛋白质组。他们使用质谱分析了跑步小鼠血浆的蛋白质组，鉴定了 235 种蛋白质。在跑步小鼠的血浆中，23 个下调，26 个上调。值得注意的是， 补体和凝血途径的蛋白质占显著变化蛋白质的 26%。蛋白质组学分析还显示 CLU、补体因子 H（FH）、补体 1 抑制剂（C1INH）的水平增加。 这些发现提示了跑步对大脑中补体和凝血级联反应的影响，尤其是在男性中。

蛋白 CLU 减少海马体炎症

为了鉴定跑步血浆中的抗炎成分，研究者在运动小鼠血浆中分别去除了上述发现的四种蛋白。给小鼠全身注射 LPS 诱导神经炎症，并输入正常的运动小鼠血浆（IgG 对照抗体）或缺乏 CLU、FH、PEDF 或 LIFR 的运动小鼠血浆处理，8 小时后使用 qPCR 分析小鼠海马的免疫和炎症基因表达。值得注意的是， 蛋白 CLU 的缺少在很大程度上消除了运动小鼠血浆的抗炎特性，而 FH、PEDF 或 LIFR 的缺失几乎没有影响。

为了评估这些观察结果在人类中的作用，研究人员在 20 名具有轻度认知障碍的患者中进行了实验，经 6 个月的锻炼干预后，检测了前 13 种补体/凝血蛋白中的 8 种，包括在小鼠中鉴定的 CLU。与小鼠中的发现一致， 运动患者在运动干预后 CLU 显著增加，而补体因子 3（C3）、凝血因子 II（FII/凝血酶原）、uPA 和纤溶酶原（PLG）减少。

神经炎症与人类的神经退行性疾病密切相关。动物研究表明，神经炎症会导致神经退行性疾病的进展，逆转或减少神经炎症可以延长认知健康。而运动会改善大脑健康，例如产生更多神经细胞和减少炎症。

本研究发现， 身体进行有氧运动引起的血浆变化，足以概括运动对神经发生和记忆的有益影响，并可以减少未运动的小鼠和神经炎症小鼠的海马体炎症。这些影响与补体和凝血途径有关，其中 CLU 蛋白在抗神经炎症中发挥着重要的调节作用 。

「我们发现，运动的效果在很大程度上可以归因于血液中的因素，我们可以将这种效果转移到同龄的、不运动的个体身上」， Wyss-Coray 教授说。她推测，一种增强或模拟 CLU 与大脑内皮细胞受体结合的药物，可能有助于减缓与神经炎症相关的神经退行性疾病（如阿尔茨海默症）的进展。

话不多说，跑步赶紧安排上！

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