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几种喹诺酮类原料药影响因素的液-质联用技术分析
喹诺酮类药物是目前临床上广泛使用的一种药物,主要用于治疗由各种细菌引起的感染性疾病,为保证临床用药的安全性和有效性,此类药物的质量控制显得尤为重要。但在药品的研究、生产、供应和使用过程中,由于受到各种外界环境的影响,药品本身可能会发生降解或变质,为了保证药品的安全、有效和质量可控,需要一种可快速、简便、灵敏、准确分析药品质量的方法。随着高分辨质谱的发展,液相色谱质谱联用技术在药物结构、稳定性的研究中显示出了独特的优势,可提供精确的分子量以及特征碎片峰推测鉴定出目标化合物的结构,已成为复杂基质中未知物结构鉴定和药品质量控制的一个重要的方法。　　本课题首先对盐酸左氧氟沙星、盐酸环丙沙星、盐酸恩诺沙星、盐酸沙拉沙星、诺氟沙星等五种常用喹诺酮类药物的二级质谱裂解行为进行研究,发现这类喹诺酮类药物的断裂方式主要为一些中性小分子,如H2O、CO2、HF、CO、CH2CH2和环丙烯等的丢失,以及哌嗪基部分的四元环氢重排。然后,采用液相色谱质谱联用法(LC-MS)对在强酸、强碱、氧化、高温、高湿和光照等药典规定的强制条件下,分别对放置10天的六种喹诺酮类原料药进行质量跟踪分析,且通过多级质谱分析对其降解产物进行鉴定,实验结果表明:高温、光照和氧化对这六种喹诺酮类药物的影响较为显著。高温条件下,恩诺沙星、诺氟沙星、盐酸环丙沙星和盐酸沙拉沙星产生的降解产物较多,多为哌嗪基部分开环,在双键上引入CO的产物,盐酸恩诺沙星和盐酸左氧氟沙星未见明显的降解现象;光照条件下,盐酸左氧氟沙星产生五种明显的降解产物,多为哌嗪基部分重排和中性分子丢失的产物;氧化条件对除盐酸环丙沙星外的其余五种原料药均有影响,其中对恩诺沙星的氧化作用大于盐酸恩诺沙星;强碱条件下除盐酸左氧氟沙星产生m/z336,盐酸沙拉沙星产生m/z751的降解峰外其他四种原料药均未发生明显的降解现象;高湿和强酸条件对这六种原料的影响不显著。　　通过考察高湿、高温、光照、氧化、强酸和强碱这六种影响因素对喹诺酮类原料药的影响,可以比较全面地了解其稳定特性,从而为该类药物的制剂处方、工艺的设计,以及产品储存等条件的确定提供科学的理论依据。　　
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2015药典 药物稳定性试验指导原则
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原料药影响因素试验主要内容
&&& (一)影响因素试验
&&& 此项试验是在比加速试验更激烈的条件下进行。其目的是探讨药物的固有稳定性、了解影响其稳定性的
因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件与建立降解产物的分析方法提供科学
依据。供试品可以用一批原料药进行，将供试品置适宜的容器中(如称量瓶或培养皿)，摊成&5mm厚的薄
层，疏松原料药摊成&10mm厚薄层，进行以下实验。
&&& 1．高温试验
&&& 供试品开口置适宜的密封洁净容器中，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点
考察项目进行检测。若供试品有明显变化(如含量下降5％)，则在40℃条件下同法进行试验。若60℃无明显变化，不再进行40℃试验。
&&& 2．高湿度试验
&&& 供试品开口置恒湿密闭容器中，在25℃分别于相对湿度90％&5％条件下放置10天，于第5天和第10
天取样，按稳定性重点考察项目要求检测，同时准确称量试验前后供试品的重量，以考察供试品的吸湿潮解
性能。若吸湿增重5％以上，则在相对湿度75％&5％条件下，同法进行试验；若吸湿增重5％以下，且其他考察项目符合要求，则不再进行此项试验。恒湿条件可通过在密闭容器如干燥器下部放置饱和盐溶液实现，根据不同相对湿度的要求，选择NaCl饱和溶液(15.5～60℃，相对湿度75％&1％)或KNO3饱和溶液(25℃，
相对湿度92.5％)。
&&& 3．强光照射试验
&&& 供试品开口放在装有日光灯的光照箱或其他适宜的光照装置内，于照度为4500lx&500lx的条件下放
置10天，于第5和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，特别要注意供试品的外观变化。
&&& 关于光照装置，建议采用定型设备&可调光照箱&，也可用光橱，在箱中安装日光灯数支使达到规定照度。箱中供试品台高度可以调节，箱上方安装抽风机以排除光源产生的热量，箱上配有照度计，可随时监测箱内照度，光照箱应不受自然光的干扰，并保持照度恒定。同时要防止尘埃进入光照箱。
&&& 此外，根据药物的性质必要时可设计实验，探讨pH值与氧及其他条件对药物稳定性的影响，并研究分
解产物的分析方法。创新药物应对分解产物的性质进行必要的分析。
&&& (二)加速试验
&&& 此项试验是在超常的条件下进行的。其目的是通过加速药物的化学或物理变化，探讨药物的稳定性，为
药品审评、包装、运输及贮存提供必要的资料。供试品要求3批，按市售包装，在温度40℃&2℃、相对湿度75％&5％的条件下放置6个月。所用设备应能控制温度&2℃，相对湿度&5％，并能对真实温度与湿度进行监测。在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末取样一次，按稳定性重点考察项目检测。在上述条件下，
如6个月内供试品经检测不符合制订的质量标准，则应在中间条件下即在温度30℃&2℃，相对湿度
60％&5％的情况下(可用NaNO2饱和溶液，25～40℃相对湿度64％～61.5％)进行加速试验，时间仍为6
个月。加速试验，建议采用隔水式电热恒温培养箱(20～60℃)。箱内放置具有一定相对湿度饱和盐溶液的干
燥器，设备应能控制所需的温度，且设备内各部分温度应该均匀，并适合长期使用。也可采用恒湿恒温箱或其他适宜设备。
&&& 对温度特别敏感的药物，预计只能在冰箱中(4～8℃)保存，此种药物的加速试验，可在温度25℃&2℃、
相对湿度60％&10％的条件下进行，时间为6个月。
&&& (三)长期试验
&&& 长期试验是在接近药物的实际贮存条件25℃&2℃进行，其目的为制订药物的有效期提供依据。供试品
要求3批，市售包装，在温度25℃&2℃、相对湿度60％&10％的条件下放置12个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月按稳定性重点考察项目进行检测。12个月以后，分别于18个月、24个月、36个月仍需继续考察，取样进行检测。将结果与0月比较，以确定药物的有效期。由于实测数据的分散性，一般应按95％可信限进行统计分析，得出合理的有效期。有时试验没有取得足够数据(例如只有18个月)，也可用统计分析以确定药物的有效期。如3批统计分析结果差别较小，则取其最短的时间为有效期。如果数据表明，测定结果变化很小，表明药物是很稳定的，则不作统计分析。
&&& 对温度特别敏感的药物，长期试验可在温度6℃&2℃的条件下放置12个月，按上述时间要求进行检
测，12个月以后，仍需按规定继续考察，制订在低温贮存条件下的有效期。
&&& 原料药进行加速试验与长期试验所用包装应采用模拟小桶，但所用材料与封装条件应与大桶一致。
附表&&&&&&&&&&&& 原料药及药物制剂稳定性重点考察项目表
稳定性重点考察项目
性状、熔点、含量、有关物质、吸湿性以及根据药品性质选定的考察项目
性状、含量、有关物质、崩解时限或溶出度
外观、内容物色泽、含量、有关物质、崩解时限或溶出度、水分。软胶囊要检查内容物有无沉淀
外观色泽、含量、pH值、澄明度、有关物质
性状、含量、融变时限、有关物质
性状、均匀性、含量、粒度、有关物质(乳膏还应检查有无分层现象)
性状、均匀性、含量、粒度、有关物质
如为溶液，应考察性状、澄明度、含量、pH值、有关物质如为混悬型，还应考察粒度、再分散性
性状、含量、色泽、有关物质，溶散时限
性状、含量、澄清度、相对密度、有关物质、pH值
口服溶液剂
性状、含量、色泽、澄清度、有关物质
性状、检查有无分层、含量、有关物质
口服混悬剂
性状、含量、沉降体积比、有关物质、再分散性
性状、含量、粒度、有关物质、外观均匀度
吸入气(粉)雾剂
容器严密性、含量、有关物质、每揿(吸)主药含量、有效部位药物沉积量
性状、含量、粒度、有关物质、溶化性
性状、含量、有关物质、释放度
搽剂、洗剂
性状、含量、有关物质
注：有关物质(含降解产物及其他变化所生成的产物)应说明其生成产物的数目及量的变化。如有可能应说明有关物质中何者为原料中的
中间体，何者为降解产物。稳定性试验中重点考察降解产物。
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题名: 高温和光照对光系统I结构与功能的影响;
Effects of High Temperature and Light on the Structure and Function of Photosystem I
学位类别: 博士
其他题名: Effects of High Temperature and Light on the Structure and Function of Photosystem I
中文摘要: 光合膜上包含有捕光并将光能转化为化学能所必需的四类跨膜蛋白复合体，即PSII、PSI、Cytb6f和ATP合成酶，其中PSI利用吸收的光能诱导电子从膜内侧的PC传递至相对一侧的铁氧还蛋白，被还原的铁氧还蛋白在FNR（Fd-NADP+氧化还原酶）的作用下生成NADPH，因此关于PSI的研究是光合作用研究领域中的重大问题。为了进一步阐明PSI的结构和功能，本论文分别研究了热对PSI的影响和光诱导的PSI核心复合物（CPI）的积累过程： 1.以菠菜PSI颗粒为材料研究了热处理对PSI复合物的降解和失活作用; 2.以衣藻叶绿素暗合成突变体y-1为材料研究了类囊体膜形成过程（即光诱导的转绿过程）中PSI中CPI的变化。另外，由于膜脂在光合作用中具有重要的功能，本论文还研究了y-1突变体转绿过程中光合膜脂、脂肪酸的变化。
一．应用光谱学、氧电极和变性电泳等技术研究了高温(25oC~80oC)对PSI结构和功能的影响，主要结果如下：
1． 在热处理过程中，683nm组分（主要归属于LHCI）的吸收峰强度有显著的下降并发生峰位蓝移现象，显示该组分对热处理最敏感，首先遭到破坏。
2． 77K荧光显示随着处理温度的升高，728 nm处的峰强和峰位均发生了明显的变化，F728-F720和F680的比率下降，说明热处理抑制了LHCI 680向LHCI 730以及反应中心的能量传递。
3． SDS-PAGE显示PSI核心蛋白PsaA/B亚基以及LHCI亚基在热处理情况下发生了不同程度的降解和聚合。为了能够显著地观察到热处理对PSI多肽降解的影响，实验采用了更高的温度处理方法，结果显示，90oC、100oC时PsaA/B亚基完全降解，而LHCI亚基仍有少量存在，说明PSI核心蛋白PsaA/B比LHCI亚基具有更高的热敏感性。
4． 推测热处理情况下可能发生的机制是，捕光天线首先从PSI反应中心分离，随后发生了反应中心光化学反应的抑制，直至最后多肽的严重降解。
5． 利用红外光谱技术（FT-IR）对PSI蛋白二级结构的研究显示，PSI颗粒在60oC以上时发生了明显的蛋白构象变化,且随着温度的升高蛋白构象的变化越来越大，表明PSI蛋白具有较高的热稳定性和热变性温度，PSI蛋白酰胺I带( cm-1)二级结构的解析表明热处理过程中二级结构的主要变化是α-helical的下降和β-sheet的增加。
6． 利用CD光谱技术研究了热处理对PSI色素微环境的影响，结果表明热处理破坏了PSI色素蛋白复合物中色素的蛋白微环境，归属于LHCI的Chlb（645 nm处组分）在较低的温度处理条件下(25~60oC)蛋白微环境即发生破坏;随着处理温度的升高（70和80 oC），478 nm处（主要归属于LHCI的Chlb）和498 nm（归属于类胡萝卜素）处的CD信号强度快速下降，说明在高温条件下LHCI比核心复合物更敏感。
7． 研究发现，PSI的摄氧活性随着处理温度的升高而显著下降，70oC时几乎完全失去摄氧能力，表明70oC时PSI复合物受到了严重的破坏，这可能是由于热处理过程中色素的蛋白微环境以及蛋白结构尤其是PSI核心蛋白PsaA/B中跨膜α-helix的构象发生了严重的变化。
二．主要运用温和电泳和蛋白印迹技术检测了暗培养4天(脱绿)的y-1突变体在光照诱发的转绿过程中PSI的核心色素蛋白复合物（CPI）及其叶绿素脱辅基蛋白PsaA/B的变化。
1． 暗培养4天的衣藻脱绿细胞中，PSI的主要色素蛋白复合物-CPI完全缺失，然而核心多肽PsaA/B仍有一定量的积累，同时检测不到P700的含量。
2． 当脱绿的y-1细胞转移至光照下时，伴随着叶绿素的合成，色素蛋白复合物CPI和PsaA/B脱辅基蛋白的合成也逐渐达到正常水平，说明叶绿素和PsaA/B蛋白进行组装并形成了具有功能的PSI反应中心,P700含量也得到了恢复。
3． 实验证明了光照是形成光合系统色素蛋白复合物的重要前提。同时发现，叶绿体基因编码的PSI核心多肽PsaA/B能够在暗条件下合成。而根据资料(Berends et al.,1987)报道，在豌豆、大麦的黄化体中不能合成PsaA/B蛋白，这可能是由于在脱绿的y-1细胞中叶绿体仍然具有相对完整的大小和形状，而在叶绿体的被膜上定位着多种与光合作用相关的酶系统。
三. 利用薄层层析及气相色谱分析技术对转绿期间y-1突变体光合膜脂和脂肪酸组成的含量变化进行了分析。结果表明：
1． 光照能够促进各种脂的积累并影响脂的组成，同时有利于脂肪酸脱饱和酶的激活。MGDG中脂肪酸不饱和程度明显升高，表现为16:0及18:1的下降，以及16:4，18：2和18:3（9，12，15）等的升高，说明光照促进了MGDG sn-2位的16:0脱饱和为16:4以及sn-1位的18：1脱饱和为18:3，也说明MGDG是脂肪酸脱饱和的重要底物。
2． 已有的资料（Ohnishi和Yamada，）指出PG及其sn-2位的16:1（3t）的合成是光依赖的，而本实验中，在衣藻的黄化细胞中含有相当量的PG及其特有的16:1（3t）（22.80%），且转绿过程中变化并不十分显著。这可能是由于黄化的y-1细胞中叶绿体的形状并没有发生很大变化，说明叶绿体被膜上的相应酶系统才是PG合成的必需因素。
3． 相比于脱绿的y-1细胞，光照12小时后，各种脂中18：2的百分含量有显著的增加，这来源于18：2是脂肪酸脱饱和的重要中间产物。
语种: 中文
URI标识: []&&
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胡朝辉.高温和光照对光系统I结构与功能的影响.[中科院植物所博士学位论文].2004.资料索取号:BS/:6/2004
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