原位杂交技术_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
评价文档：
3页免费152页1下载券35页免费7页1下载券5页1下载券152页1下载券2页免费23页2下载券7页1下载券4页免费
喜欢此文档的还喜欢5页免费54页1下载券2页免费
原位杂交技术|
把文档贴到Blog、BBS或个人站等：
普通尺寸(450*500pix)
较大尺寸(630*500pix)
你可能喜欢荧光原位杂交 -
荧光原位杂交
&&&&&荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH），用于特定核酸序列在不同组织结构中的定位，已经有20 多年的研究历史。荧光原位杂交 目前FISH 技术应用范围越来越广，技术不断完善改进。尽管FISH 技术的基本原理非常简单，但是高灵敏度的检测、多个物种间的同时检测、自动化数据获取和分析等技术都得到了很大的改进和提高。关键性检测环节的改进获得了低背景，同时也突破了对多个靶位点进行定位和分析的技术难题。FISH流程的完善和多色FISH 的多位点检测进一步扩大了FISH 技术检测核酸的范围。FISH技术操作程序的简化和检测灵敏度的提高，使得FISH技术从原先的一种次要检测手段日益转变成一种首要的生物学核酸检测技术。&&
荧光原位杂交 -
日一项有关产前诊断技术的研究课题，在历时三年后于通过了卫生部组织的结题验收。这意味着中国的产前诊断技术将更快、更准。 这一课题名为“荧光原位杂交技术在产前遗传性疾病检测中的应用研究”，由卫生部医药卫生科技发展研究中心承担，牵头，全国共有55家产前诊断中心参加。 据介绍，荧光原位杂交技术是一种、及技术相结合的原位杂交技术，已广泛应用于染色体数目异常、缺失、易位等所致疾病的诊断。荧光原位杂交技术采用荧光标记的DNA探针，探针与样本DNA杂交后，根据探针与被检测样本中DNA序列的互补性，在荧光显微镜下检测荧光信号而得出结果。 与传统的产前细胞遗传学诊断方法相比，荧光原位杂交技术具有简便快速、检测成功率高等特点，可以在获取标本后24小时至48小时出结果，比以往所需的10至14天时间明显缩短。 55家产前诊断中心已建立荧光原位杂交技术操作和分析程序平台，建成了全国快速产前诊断技术体系，并陆续开展临床服务。研究中使用的国产探针也已获准生产。 出生缺陷是影响人口素质的重大问题，我国每年有100余万新生儿带有出生缺陷。临床统计显示，70％的出生缺陷是由遗传因素所致，其中染色体异常较为常见。 副主任委员指出，目前没有可靠、有效的治疗方法，是降低发病率的主要途径。 产前诊断是在遗传咨询的基础上通过产前检测胎儿的健康情况，对患有遗传病、先天畸形的胎儿及早采取措施，以提高出生人口素质。
荧光原位杂交 -
技术的产生
1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术，但是没有得到广泛应用。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic&in&situ&hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性，从而开辟了间期细胞遗传学研究。
荧光原位杂交 -
荧光原位杂交技术原理是将DNA探针用生物素和毛地黄毒苷等荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合，通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。与其他原位杂交技术相比，荧光原位杂交具有很多优点，主要体现在：&①FISH不需要放射性同位素作探针标记，安全性高;②FISH的实验周期短，探针稳定性高;&③FISH能通过多次免疫化学反应，使其杂交信号明显增强，从而提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交;④FISH的分辨率高达3-20Mb;⑤FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针，再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子，因此可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到它们的相关位置和顺序，从而大大加速生物基因组和功能基因定位的研究。
荧光原位杂交 -
技术的发展
在20世纪90年代，FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber-FISH的发展趋势，灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。3.1&多色荧光原位杂交(M-FISH)多色原位杂交(M-FISH)，“M”分别代表“Multicolor”、“Multiplex”和“Multitar&get”&3种类型。M-FISH的最大特点是：可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在一次FISH实验中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双色FISH&技术。1990年Nederlof等提出用3种荧光素探测3种以上的靶位DNA序列，创建了多色FISH方法。以下五种方法是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术：染色体描绘(chromosome&paint&ing)、比较基因组杂交(comparative&genomic&hybridization,CGH)、光谱染色体自动核型分析(spectral&karyotyping,&SKY)、交叉核素色带分析(cross-species&color&banding,&Rx-FISH)、多彩色原位启动标记(multicolor&primed&in&situ&labeling,&multicolor&PRINS)&[5]。3.2&DNA纤维荧光原位杂交技术(DNA&fiber-FISH)Wiegant等和Heng等首先利用化学方法染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA&作为载体进行FISH，使FISH的分辨率显著提高，就是最初的纤维-FISH。Parra和Windle(1993)，Heiskanen等(1994)，Florijn等(1995)，进一步改进了伸展DNA纤维的方法，使DNA纤维的伸展程度从最初的80kb/μm达到了现在的2.5-3.5kb/μm，这一数值与Watson-Crick建立的DNA双螺旋模型中B-DNA分子的理论值2.97kb/μm十分接近，因此可以说现在得到的DNA纤维基本上是裸露的双螺旋DNA分子。纤维-FISH的关键就在于何制备高质量的线性DNA纤维纤维-FISH具有高分辨率,能进行定量分析，模板要不高，只需分析少量的DNA分子(&10个)，灵敏度高等优点由于纤维-FISH的这些优点使得它在染色体图谱绘制，基因重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起着十分重要的作用。3.3&组织微阵排列技术(tissue&microarray)Microarray可以在1次实验中检测出数百个基因在1个细胞中的表达情况(包括降低和增高)。Tissue&array则在1次实验中能检测出1个基因在数百个细胞中的表达情况。Tissue&microarray是由Tissue&microarray区域中500-1000单个肿瘤组织联合筒状活检构成的，将活检组织切成200多片用于DNA、RNA探针。单个杂交提供单个载玻片上所有样本的信号，以后的切片可以用其他探针或抗体分析。同一个组织样本切片的多重叠区域可以形成数千张切片。组织和cDNA微阵排列技术相结合提供一种有力的体内鉴定基因的方法，可以对癌或其他疾病的分子改变做出重要评估。3.4&荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学(fluorescence&immunophenotyping&and&interphase&cytogenetics,&FICTION)FICTION是1种将免疫核型分析和原位杂交相结合的方法，这种方法可以同时显示异种细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因改变。FICTION形态学有关，可以对档藏材料作回顾性研究。FICTION诊断快速，可以再现，适合FISH分析前或后没有所需以前细胞标本的细胞学样本。FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱以获得对肿瘤病理组织更好的了解。
荧光原位杂交 -
为本词条添加和相关影像
互动百科的词条（含所附图片）系由网友上传，如果涉嫌侵权，请与客服联系，我们将按照法律之相关规定及时进行处理。未经许可，禁止商业网站等复制、抓取本站内容；合理使用者，请注明来源于。
登录后使用互动百科的服务，将会得到个性化的提示和帮助，还有机会和770多万专业认证智愿者沟通。
您也可以使用以下网站账号登录：
此词条还可添加&
编辑次数：13次
参与编辑人数：10位
最近更新时间： 10:55:32
贡献光荣榜
扫描二维码用手机浏览词条
保存二维码可印刷到宣传品
扫描二维码用手机浏览词条
保存二维码可印刷到宣传品荧光原位杂交方法是一种绘制方法，使用标记，以检测探针和分裂中期的或的的杂交。
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在的基础上发展起来的一种非放射性细胞遗传技术,以取代而形成的一种新的方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过过程连接上.FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA切片上,再用与荧光素分子的与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.
对于利用rRNA的荧光原位杂交来说，如下原因可导致较低的荧光信号强度：
较低的糖体含量
较低的周边的通透性
较低的目标序列可接触性（由于rRNA的折叠产生的，有些位置与rRNA分子内其他链或其他rRNA或紧密接触，从而使探针无法和目标序列杂交）
为检验细胞中的目标序列是否容易被探针杂交，及测试最佳杂交温度，可利用“克隆荧光原位杂交”(clone-FISH)进行试验：将rRNA结合入，转化至中表达，构成，再用荧光标记的探针杂交。
FISH可与流式细胞术联用，对特定荧光标记的细胞进行计数或者分离。
荧光原位杂交（FISH）技术简介
1974年Evans首次将和联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。
FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的探针是互补的，二者经变性-退火-，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如、，可利用该报告分子与荧光素标记的特异之间的反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
2．实验流程
FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（）→检测→结果分析。
原位杂交的探针按标记分子类型分为和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、的使得空间分辨率不高、及操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。
该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或及的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。　　
1 FISH 技术检测数目及检测目标的发展
在FISH 技术基本确立之后，FISH 不仅用于单基因或核酸检测，FISH 技术的进一步发展扩展到多色FISH 位点同时检测，从基因检测发展到、染色体、活细胞中转录产物mRNAs 原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。早期的探针较大，是通过载体的、法、体外法和随机DNA 合成法来制备以获得特异性杂交克隆。然而大片断的探针通常带有造成高荧光背景，采用未标记的核酸进行使其与非特异性位点结合用于抑制非特异性杂交可以克服上述问题，同时也使得研究者扩大了检测目标，实现了整条染色体。在细胞遗传学上FISH 技术在方面也因此得到了显著的提高。如通过比较基因组杂交（Comparativegenomic hybridization）用于检测染色体区域的缺失和重复。大片段探针一旦和样品非特异性结合就会形成一个信号，混淆染色体上基因的检测，就需要剪切成小片段＜200核苷酸。现在检测手段的提高以及检测软件的不断发展使得FISH技术的检测要求越来越低，灵敏度越来越高。精确的计算机图片处理算法的不断改进形成了亚显微水平的探针高分辨技术。随着检测目标越来越小，FISH技术已用于隐蔽的亚基因重排和精确的染色体作图及单拷贝mRNA的检测。
FISH 检测范围的扩大，使得FISH 技术的应用在20 世纪90 年代急速增长。由FISH 技术应用而形成的分支技术实现了越来越多的不同类型位点同时检测。首先是采用不同的荧光素来检测多位点，如双色荧光用于检测特异的核酸序列，每一条染色体、基因或者分别由一种可以分辨的荧光信号来表示。之后是采用两种色彩译码方案进一步扩大了FISH 应用范围。译码方案主要是针对色彩比例，即每一种颜色在总颜色中所占的比例来描绘多位点。前述的每一种方法，或是两种方法的结合都已经将可检测位点多达12 个。采用计算机翻译的五色方案可同时检测出人类所有染色体代表着FISH 技术多位点检测的里程碑。尽管可以采用多种方法观测到mRNAs，但是FISH 对整个转录产物的原位分析似乎更有应用前景。色彩译码技术已经实现了对整个组织的检测。
2 FISH 技术的定量分析阶段
Pinkel 等（1986）首次将荧光图像定量分析用于基本检测，采用双色激发块装置照相机检测荧光信号，而且定量分析技术很快用于了mRNA 检测。荧光检测的关键是信号的重现性、无规律性及背景的。不仅不同的样品之间荧光不同，而且同一上的材料或者同样的细胞都有可能显示出不均衡的荧光。目前已有多种方法用于消除一些组织中的自发荧光：如样品制备过程中，采用的消除自发荧光试剂包括硼或者采用光照进行预处理以消除非特异性背景信号。这些消除自发荧光的方法并不完全有效，通常在进行图像分析时通过计算机算术除去自发荧光信号。荧光图像的数据包括真正的信号和许多杂噪，分别进行分析并且通过单独的光谱组分分析除掉杂噪数据。多色FISH 有自身的限制，包括不同的荧光强度和颜色重叠。但是通过计算机算法分析平衡了多色图像，包括强度变化和自动纠正信号重叠。
FISH图像自身的限制并没有影响到自动破译算法的发展。采用序列较大探针进行DNA 位点检测和多色数算法辅助病理学家实现了自动化分析。此外，检测探针和点计数方法的应用为便捷的检测结果提供了一个。尽管多种方法已经用于分析或优化自动细胞检测系统，人工的细胞病理检测仍是可信度高的组织分析方法。然而，细胞制备、鉴别、固定介质上细胞样品计算机化检测在未来的医学诊断中的高效益性不容忽视，快速检测细胞内的分子信号只有通过计算机辅助方法进行检测。现在，自动化检测程序已经扩展到采用多基因转录模型检测特异的DNA 簇和转录位点以确定功能细胞的状态。
3 FISH 技术检测领域的发展
鉴于FISH 起始阶段的发展主要是探针类型和检测位点的扩展，荧光检测技术将来的发展可能包括检测领域的扩展。荧光图像应用需要在检测体系上进一步提高，如探针的结合，照相和分析的自动化，因此避免了不同操作间的误差。样品厚度是荧光显微镜检测样品类型的一个限制因素。近来的和光学X摄影技术要求样品厚度达到1~2mm。一种改进的光学投射X 显微断层摄影技术可以获取到15mm 厚样品的图像扩大了和诊断样品的检测范围。活细胞的RNAs FISH 技术检测也有报道。既可以采用体内释放的荧光集团也可以采用杂交后探针的荧光素进行检测。这两种新方法都可以降低非特异性标记探针存在时的高背景（如活细胞），可以用于追踪mRNA 的合成和转移途径。这些方法较绿色（Green fluorescence protein, GFP）更易于检测不同靶分子。相对于GFP 活检测，FISH 易受到细胞内合成探针的影响。FISH 需要进一步的改进以降低活体检测时的干扰背景，避免细胞内自身杂交物的干扰。其实完全可以不必考虑FISH 检测和荧光检测蛋白技术的差异，将FISH 技术和荧光蛋白技术结合起来可以同时检测目的核酸和蛋白。
多的应用进一步扩大了荧光图像的应用范围。采用多光子，激光块可以发射光子于显微镜两到三次激发目的荧光素。采用近红外激发光可以更深层次穿透生物样品，比可见光对活体样品造成的低。这种新方法的应用已将荧光图像用于活体系统的检测，甚至整个动物体。由于还不能合成生物体标记探针，因此目前生物体内荧光图像的应用只限于检测荧光分子或生物体自发荧光。生物组织在正常的或者生理过程中产生的自发荧光信号可以作为一种重要的诊断信号。一旦生物体探针成为可能，将会成为鉴别特异核酸序列，进行非入侵诊断，获取诊断图像的一种有力辅助手段。
出自A+医学百科 “荧光原位杂交”条目
转载请保留此链接
关于“荧光原位杂交”的留言：
目前暂无留言 下载
 收藏
该文档贡献者很忙，什么也没留下。
 下载此文档
正在努力加载中...
滤泡树突状细胞肉瘤的形态学及分子细胞遗传学变异的研究
下载积分：1980
内容提示：滤泡树突状细胞肉瘤的形态学及分子细胞遗传学变异的研究,树突状细胞,树突细胞,树突轴突,轴突和树突,浆细胞样树突状细胞,滤泡性咽炎,淋巴滤泡,淋巴滤泡增生,咽后壁淋巴滤泡增生
文档格式：PDF|
浏览次数：1|
上传日期： 14:43:31|
文档星级：
该用户还上传了这些文档
下载文档:滤泡树突状细胞肉瘤的形态学及分子细胞遗传学变异的研究.PDF
官方公共微信}