孕早期沙眼衣原体宫内感染的检测--《中国优生与遗传杂志》1997年02期
孕早期沙眼衣原体宫内感染的检测
【摘要】：本研究利用PCR技术和地高辛标记的DNA探针对59例早孕绒毛组织中的沙眼衣原体感染进行研究。结果发现2例绒毛组织有沙眼衣原体感染，其感染率为3．4％，研究证实沙眼衣原体可引起孕早期的胎儿宫内感染。建议对沙眼衣原体感染的孕妇进行宫内感染的产前诊断。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R446.5【正文快照】：
由沙眼衣原体（Chlamychiatrachomatis，CT）引起的人类生殖道感染已引起了人们的广泛重视［l。，j。CT所致生殖道感染可造成新生儿围产期感染及其它问题‘““。但CT是否可以引起孕期胎儿宫内感染，尚缺乏充分的证据。［‘］本研究利用聚会前链反应技术（PCR）和地高辛标记的
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京公网安备75号宫内感染早期诊断
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宫内感染早期诊断
临床上，宫内感染的早期发现、早期预防及治疗对改善母儿预后至关重要。目前常用的诊断方法使许多亚临床感染的孕产妇得不到及时诊治而错失最佳干预时机。研究证实，羊水白细胞计数、C-反应蛋白、白介素-6、白介素-8、基质金属蛋白酶-8等对宫内感染有一定的预测价值，而蛋白质组学的发展则为早期有效诊断羊膜腔炎症创造了机遇。
关键词：宫内感染；白细胞计数；C-反应蛋白；细胞因子；蛋白质组学
宫内感染(intrauterine infection,IAI)是严重的妊娠并发症，可导致死胎、早产、新生儿感染和败血症，明显增加新生儿肺疾病和脑损伤等的发病率和死亡率。大部分IAI表现为亚临床感染，仅凭临床表现难以识别；临床症状又多出现在IAI的晚期，缺乏敏感性，出现症状时往往已失去最佳诊治机会。因此，寻找早期有效诊断IAI的检查手段已成为产科医师的研究热点。本文将对IAI早期诊断的相关进展进行探讨。
一、IAI的发病过程
目前依据微生物定植部位不同，可将IAI简单分为羊膜腔外感染和羊膜腔内感染。Romero等[1]则将上行性IAI分为4期。Ⅰ期：阴道或宫颈微生物群紊乱或宫颈管内出现病原微生物。细菌性阴道炎可能是该期的早期表现。Ⅱ期：微生物进入宫腔，定植在蜕膜组织而引起蜕膜炎症，进而发展为绒毛膜炎。Ⅲ期：微生物继续入侵，在绒毛膜及羊膜中定植。之后，感染有可能侵入胎儿血循环引起绒毛膜血管炎和(或)脐静脉炎或穿透羊膜(羊膜炎)进入羊膜腔(羊膜腔内感染)。Ⅳ期：胎儿直接接触或吸入、吞入受污染的羊水而被感染，导致耳炎、结膜炎、脐炎、先天性肺炎等。以上部位的细菌播散到血循环后将可能进一步引发菌血症及败血症。也有学者提出在此基础上将胎儿的系统性感染(如败血症、脑膜炎)归为Ⅴ期。阴道内病原体的致病性与母婴结局密切相关，如革兰阴性菌感染较革兰阳性菌(包括引起细菌性阴道病的细菌)更易引起胎膜早破、自发性早产、产后子宫内膜炎。因此，预防用药的原则是依不同的致病菌使用敏感的抗生素治疗以减少IAI的发生。一旦进展到Ⅱ期，原则上应立即给予抗生素治疗直至分娩。围产期母体抗生素治疗优于产后治疗，可降低新生儿感染发生率并改善母体结局。目前没有足够的证据表明哪种抗生素治疗方案疗效最佳，一般推荐联合使用β-内酰胺类和氨基糖苷类。对选择剖宫产结束妊娠的产妇要注意加用抗厌氧菌的药物以降低产后子宫内膜炎的风险。对青霉素过敏的孕产妇也可选用第2、3代头孢菌素类抗生素[2]。母体急性炎症可不伴有胎儿的炎症，但胎儿受侵则通常是母儿感染，并且提示感染可能已经存在了较长时间。因此，早期发现IAI对提高新生儿存活率及降低新生儿患病率具有重要意义。然而，临床上缺乏有效手段明确IAI，不易在出现临床症状前做出母儿的风险评估，使得临床的早期诊断及决策十分困难。
二、IAI的发病过程
2.1IAI的临床表现
IAI的诊断主要依据临床症状，包括母体发热(体温≥38℃)，兼有下列一种以上的情况：母体心动过速(&100次/min)、胎心过速(&160次/min)、子宫紧张有压痛、羊水有臭味，末梢血白细胞计数&15×109/L[2]。据文献资料显示，表现为临床绒毛膜羊膜炎者仅占IAI患者约12.5%，其余大部分表现为亚临床感染，仅凭临床表现难以识别。以上指标也可能出现在其他情况，缺乏特异性，当出现临床症状时往往需要仔细的评估排除其他可能的病因。例如母体脱水或其他器官系统的感染也会发热；早产、药物、心律不齐、缺氧、宫缩等都会导致胎心过速；分娩时产妇的血液中白细胞数也会增高，但一般不高于20×109/L，尤其当白细胞计数明显升高并出现“核左移”时应怀疑感染。此外，子宫紧张及羊水臭味仅出现在4%~25%的病例中，且多出现在IAI晚期，缺乏敏感性，出现症状时往往妊娠结局不良。排除其他病因后，同时出现3个临床表现对IAI的诊断准确性较高。当出现IAI的高危因素尤其是胎膜早破更能支持诊断[3]。
2.2IAI的实验室诊断
序列方法学已经应用于检查羊水中微生物印记，但目前IAI的诊断金标准仍是基于传统标准的培养技术分离出病原微生物。普遍认为，羊水培养结合产后胎盘胎膜组织学检查是诊断IAI的可靠依据。绒毛膜羊膜培养出致病菌也有一定的诊断价值，但胎盘胎膜通过产道时有可能受到阴道菌群的污染而出现假阳性。对组织性绒毛膜羊膜炎的病理学研究证实，浸润在绒毛膜和羊膜局部的炎性细胞均来自母体[4]。通过研究阴道、宫颈局部炎性改变对母体局部炎症反应(蜕膜炎期)进行监测，对早期发现亚临床IAI有重要意义。而在羊水中分离的白细胞则来自胎儿血循环，表明胎儿对羊水感染的反应。胎儿炎症反应的激活对预测胎儿预后及新生儿败血症、脑损伤等有重要价值。如果病理证实为脐带急性炎症，提示胎儿感染且预后不佳。可见，胎盘胎膜和脐带的组织学检查对诊断绒毛膜羊膜炎、确定IAI分期及预测胎儿预后有重要意义，推荐下列情况应行组织学检查[5]：怀疑或确诊感染；早产(尤其&34周)；母体发热；羊水粪染或颗粒状；胎膜早破&24 h；新生儿入住NICU；胎死宫内；围产儿死亡；新生儿脐带动脉血pH&7.0；新生儿Apgar 5 min评分&6；新生儿正压通气&10 min；新生儿气管插管；新生儿抽搐。
三、IAI的早期诊断
3.1羊水白细胞计数
羊水检查能直接反映羊膜腔内的微生物及炎症状态，但由于羊水微生物培养及涂片革兰染色分析假阴性率高，故对羊水中炎性介质的检测更有意义。由于羊水中的中性粒细胞主要来自胎儿，所以羊水的白细胞计数被认为是胎儿炎症反应的间接指标，提示羊膜腔内炎症的“金标准”，但对IAI的早期阶段(如蜕膜炎)没有预测价值。研究发现，胎盘炎症反应只局限在绒毛膜蜕膜时，羊水中白细胞数量与无炎症反应的羊水中白细胞数相近；发生自发性早产但羊水白细胞计数正常的患者，仍有25%在产后胎盘病理检查证实存在绒毛膜蜕膜炎症[6]。羊水白细胞计数操作简便，临床上开展广泛，但仅依靠羊水白细胞计数诊断羊膜腔内炎症是不可靠的，应推荐与其他快速检测方法联合使用，理由如下：(1)不同实验室确立的阈值不统一影响了结果的正确判读。(2)羊水中的细菌对细胞的溶解作用也会降低中性粒细胞绝对值。(3)在获取标本时，母体血液的污染也会影响读数。
3.2C-反应蛋白
C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是由肝脏产生的急性时相蛋白，是反映各种原因引起的炎症和组织损伤的敏感指标之一。CRP在炎症发生后6~8h内合成并分泌增加，并在24~48h达到高峰，其上升的速度和持续时间与患者的病情和组织损害程度密切相关。 母体血CRP目前在临床产科中被广泛应用，作为亚临床型绒毛膜羊膜炎的鉴别指标，但必须排除引起CRP升高的其他因素。Wei等[7]认为母体血清标本中CRP浓度与IAI有关，但相关性并不明显(OR 1.53；95%CI 1.22~1.90)。Buhimschi等[8]也得到相似的结论(OR 2.0)。因此，不推荐CRP作为独立的指标诊断IAI，且目前对母体血清CRP和IAI的相关研究得到的参考值范围差异较大，临床上应谨慎判读。已有大量的研究表明，羊水CRP浓度升高与IAI之间有很强的相关性[7,9]。目前认为羊水CRP来自于胎儿，相关证据如下[9]：(1)当受到炎症攻击时，胎儿的肝脏具有产生急性时相蛋白的能力。在脐血中能检测到CRP，在羊水感染、脐炎和先天性新生儿败血症时其浓度升高。(2)CRP是大分子质量(106 ku)蛋白并不能透过胎盘屏障。(3)羊水中的CRP浓度与母体血清CRP浓度无关。若妊娠早期即出现羊膜腔内炎症，胎儿也能启动亚临床的炎症反应，产生CRP，对宫内炎症及早产有预测作用。但目前仍不清楚胎儿肝脏合成的CRP是如何到达羊膜腔，学者们提出了以下几种猜测：(1)在妊娠早期，胎儿的肾脏发育未成熟，能透过分子量较大的蛋白质。(2)亚临床肾脏炎症改变了胎儿肾脏的过滤功能。(3)胎儿血循环中的CRP可能通过肺泡的滤过功能到达羊膜腔中[9]。对羊水中CRP在宫内炎症反应中的功能尚无非常明确的认识，普遍认为CRP是非特异性免疫机制的一部分，主要通过调节中性粒细胞的趋化及吞噬功能起抗炎作用。
3.3细胞因子
正常妊娠时，胎盘和蜕膜细胞能合成和分泌少量细胞因子。IAI时，病原微生物及其产物如脂多糖、肽多糖、多聚糖等均刺激胎盘组织和子宫肌层释放多种细胞因子，如白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等，过多的活化的细胞因子会使胎儿失去部分防御能力而容易被免疫系统损害，同时增加前列腺素的合成和释放，诱发分娩。目前普遍认为IL-6及IL-8诊断IAI及预测早产的应用价值最高。
3.3.1 IL-6
IL-6是一种多效性前炎症细胞因子，被认为是IAI后蜕膜、绒毛膜最早产生的细胞因子，具有多种生物活性，能激活T细胞及自然杀伤细胞，是感染、组织损伤及急性应激蛋白CRP产生时的主要炎症介质之一。它以自分泌或旁分泌方式作用于花生四烯酸代谢途径，促进蜕膜和羊膜上皮产生前列腺素，引起子宫收缩，宫缩使胎膜细胞变性产生IL-6，形成“宫缩-IL-6-前列腺素”的循环，大量的炎性细胞也产生更多IL-6，使羊水中的浓度不断升高，诱导分娩发动。有学者推测作为前列腺素的刺激因子IL-6参与了分娩的启动和维持。 羊水中的IL-6可以作为预测IAI的早期敏感指标，并对早产、羊水穿刺术与分娩的间隔时间、新生儿的发病率与死亡率有良好的预测价值。IL-6的浓度越高，敏感性与特异性越高。Romero等[10]对146例胎膜完整的早产病人经腹羊膜腔穿刺取羊水检测IL-6浓度，同时行羊水培养和产后胎盘病理检查，发现IL-6≥11.3 μg/L诊断IAI敏感度为93.3%(14/15)，特异度为91.6%(120/131)；羊水培养阴性但羊水中有高浓度的IL-6(&11.3 μg/L)的病例产后组织学检查均诊断为绒毛膜羊膜炎。目前，羊水IL-6诊断IAI价值已得到普遍认可并被广泛应用于临床判断先兆早产或胎膜早破妊娠妇女是否存在羊膜腔内感染，指导临床处理[7-8]。此外，还有证据表明，胎膜完整的先兆早产羊水与阴道分泌物的IL-6的浓度成明显的正相关，监测宫颈中IL-6的浓度变化有助于宫内炎症的诊断，预测早产[8,11]。
3.3.2 IL-8
IL-8是惟一的中性粒细胞趋化和活化因子，又称中性粒细胞激活肽，是一个重要的炎性介质和免疫调解因子，具有重要的生物学功能。IL-8使中性粒细胞在炎症介质局部聚集，吞噬病原体；诱导或激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)，并减少基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的合成，从而降解细胞外基质及各种类型胶原，加之白细胞吞噬过程中释放的胶原酶及弹性蛋白酶引起宫颈软化和扩张，导致胎膜破裂。妊娠和非孕期宫颈组织都能自发合成释放IL-8，子宫肌层、蜕膜、胎膜、羊水等部位的IL-8水平随孕周的延长而增长。而羊水及宫颈分泌物中IL-8水平明显升高都对IAI、炎症及早产有较好的预测价值[8,12-13]。
3.3.3 基质金属蛋白酶-8
基质金属蛋白酶-8(matrix metalloproteinases-8，MMP-8)是在骨髓中性粒细胞成熟阶段合成，储存在中性粒细胞特异颗粒中，直至中性粒细胞被激活才释放出来，故又称为中性粒细胞胶原酶，其分解胶原的能力达其他间质胶原酶的3倍以上，从而参与发育、炎症、肿瘤等多种生理和病理过程。MMP-8优先分解Ⅰ型胶原，是Ⅰ型胶原最重要的胶原酶。目前研究表明，IAI易导致早产、胎膜早破。胎膜早破发生前多存在IAI，其机制在于：当羊膜腔内发生炎症时，活化的中性粒细胞释放MMP-8，TNF、IL等炎性细胞因子，增加MMP-8的基因表达，Ⅰ型胶原作为维持羊膜弹性与张力强度的主要成分被大量分解，使胎膜组织结构弱化，从而导致胎膜早破的发生。此外，MMP-8还具有活化其他基质金属蛋白酶从而加重基质溶解作用，并调节细胞因子的表达而加重炎症反应。正常妊娠时，MMP-8会少量出现在各孕期的宫颈分泌物中，但不会在羊水中出现。阴道内的病原体可以穿透宫颈黏液栓侵犯绒毛膜蜕膜间隙，诱发母体产生由细胞介导的免疫反应，中性粒细胞局部浸润后合成、释放多种蛋白水解酶，包括基质金属蛋白酶。发生上行性感染时，当羊水中发现微生物侵入时，宫颈局部常常已出现炎症反应，分泌物中的MMP-8显著升高。而羊水中升高的MMP-8是羊膜腔内炎症的产物，提示宫内炎症的激活；同时作为Ⅰ型胶原主要降解酶，MMP-8升高是未足月胎膜早破及早产的原因之一。目前主要观点认为，MMP-8水平的测定，对早期发现IAI有重要意义，可在炎症的早期(包括妊娠早期及中期)预测未足月胎膜早破及早产是否会发生[6,14]。但Rahkonen等[14]发现宫颈分泌MMP-8水平与早产无关，而宫颈分泌物中低水平的MMP-8与不伴宫缩的未足月胎膜早破相关联。他们认为，宫颈局部的MMP-8经由不同的分子途径在不同类型的早产(自发性早产和未足月胎膜早破)发生过程中起截然不同的作用。可见，羊水及宫颈分泌物中的MMP-8(即母体和胎儿炎症反应所产生的MMP-8)与未足月胎膜早破的复杂关系仍需要进一步研究。
蛋白质组学与IAI蛋白质组学是指应用各种手段来整体、定量、动态研究蛋白质组成、功能及相互关系的新兴学科，其研究对象是一种细胞(或组织)所表达的全部蛋白质的特征。许多疾病的早期出现病理生理变化前，细胞内的蛋白质在数量或组成上都已经有了相应程度的改变，通过体液中蛋白质水平反映出来。近年来蛋白质组学已被应用于寻找羊膜腔内感染、炎症的生物标记物。Buhimschi等[15-16]利用SELDI蛋白质芯片技术(SELDI-TOF-MS技术)将正常妊娠、早产及羊膜腔内感染3组的羊水进行对比分析，得出4种蛋白生化标记物：中性粒细胞防御素-1、-2(neutrophil defensins-1 and-2，HNP-1 and -2)和钙粒蛋白A、C(calgranulins A and calgranulins C)；以是否表达这4种蛋白为依据计算MR(Mass Restricted)评分(MR=0~4)，用于判断是否存在羊膜腔炎症，还与早产、组织性绒毛膜羊膜炎、早发性的新生儿败血症相关。MR评分还能为评估炎症严重程度提供依据(其中0分为无炎症，1~2分为轻度炎症，3~4分为重度炎症)；其中，MR&2对检测羊膜腔炎症的敏感度和特异度分别为92.9%和91.8%。IAI的发生及进展涉及多种细胞因子、转录因子、细胞凋亡调节因子等的活化及代谢。近年来，对羊水、宫颈分泌物、母体血清等生物标记物的研究已大大加深了对IAI发病机制的认识。然而因许多生物标记物并不具有IAI的特异性，检测因操作复杂、费用高等使其临床应用受到了限制，临床上往往一种指标很难同时满足快速、实用、敏感、特异的要求，往往需联合检测多种标记物预测IAI。展望未来，还需进一步认识IAI的发病机制及致病机制，寻找新的检测指标，实现IAI的风险评估、早期诊断和有效干预。此外，如何改革检测方法学使科研成果高效转化成临床诊断手段也将是今后研究的重点。
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宫内感染患者的临床诊断分析
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