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海洋抗菌活性物质产生菌的筛选及系统分类研究
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具有促进污水生物处理系统中有益微型动物生长功能的生物活性物质探索
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大型真菌抗细菌和抗真菌活性研究
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3秒自动关闭窗口茄科植物内生细菌对几种病原真菌的作用及抗性物质分析-博泰典藏网
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茄科植物内生细菌对几种病原真菌的作用及抗性物质分析
导读：茄科植物内生细菌对几种病原真菌的作用及抗菌物质分析，内生菌产生的抗生素存在植物体内，挥发性抗菌物质和脂肪氨基酸氮氧衍生物等，同时也是具有广泛用途的生物活性物质，表现出抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和抗真菌活性以及一定程度的抗细菌活性，Ｂａｃｏｌｙｓｉｎ、Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ、Ｆｅｎｇｙｃｉｎ、Ｉｔｕｒｉｎｓ、磷脂类，伊枯草菌素（Ｉｔｕｒｉｎ）是一类小分子环脂肽类物质，其中以ＩｔｕｒｉｎＡ对真菌具有强烈茄科植物内生细菌对几种病原真菌的作用及抗菌物质分析１．４．２．１非核糖体合成的抗生素抗生素是一类异源小分子化合物，在低浓度下可以对微生物的生长或代谢产生影响（Ｔｊａｍｏｓ，１９９２）。内生菌产生的抗生素存在植物体内，有利于转运，提高防病效果（Ｃｈａｎｗａｙ，１９９６）。非核糖体合成的抗生素包括脂肽抗生素（ｔｉｐｏｐｅｐｔｉｎ），多肽抗生素，挥发性抗菌物质和脂肪氨基酸氮氧衍生物等。（１）脂肽类（１ｉｐｏｐｅｐｔｉｎ）脂肽类抗生素具有极高的生物工程利用价值。不仅是具有工业应用价值的高活性生物表面活性剂，同时也是具有广泛用途的生物活性物质，表现出抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和抗真菌活性以及一定程度的抗细菌活性。Ｂａｃｏｌｙｓｉｎ、Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ、Ｆｅｎｇｙｃｉｎ、Ｉｔｕｒｉｎｓ、磷脂类抗生素Ｂａｃｉｌｙｓｏｃｉｎ和抗菌枯草菌素Ｍｙｃｏｓｕｂｔｉｌｌｉｎ、Ｅｃｏｍｙｃｉｎ等都属于脂肽类物质。Ｆｅｎｇｙｃｉｎ是一种研究得比较深入的脂肽类抗真菌素，包括ＦｅｎｇｙｃｉｎＡ和Ｂ，对丝状真菌有极好的抑制效果（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，１９８６）。伊枯草菌素（Ｉｔｕｒｉｎ）是一类小分子环脂肽类物质，由７个氨基酸和１个Ｂ２氨基脂肪酸（ＢＡＡ，Ｂ．ａｍｉｎｏｆａｔｔｙａｃｉｄｓ）组成，其中包括伊枯草菌素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和芽孢菌素（ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ）Ｄ、Ｆ、Ｌ等（Ｂｅｓｓｏｎ，１９８７），其中以ＩｔｕｒｉｎＡ对真菌具有强烈的拮抗作用。Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ最初由Ａｒｉｍａ等（１９６８）鉴定和命名，通过Ｂ－羟基和羧基与７肽ｏｒＧｌｘ．Ｌｅｕ．Ｄ．Ｌｅｕ．Ｖａｌ．Ａｓｐ（Ａｓｎ）．Ｄ．Ｌｅｕ．Ｌｅｕ（ＩｌｅＶａｌ）末端基团形成内脂（Ｋａｋｉｎｕｍａ，１９６９），被称为标准表面活性素，它是已发现的最强的一类生物表面活性剂。刘静（２００４）等从ＪＡ菌株中获得３种对水稻纹枯病菌和小麦赤霉病菌均有抑菌作用的抗菌肽。ＳｔｒｏｂｅｌＧ．Ａ（１９９９）等从雷公藤（ＴｒｉｐｔｅｒｉｇｅｕｍｗｉＩｆｏｒｄｉｉ）ｔ；Ｉ勺茎中分离到一株内生真菌，能产一种肽类抗生素Ｃｒｙｐｔｏｃａｎｄｉｎ，它不但能抑制灰葡萄孢（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）等一些植物病原真菌，而且还能抑制白假丝酵母等人类病原真菌。（２）抗菌肽抗菌多肽，包括环状、线状和分支环状三种，分子量多在ｌｋＤ左右。抗菌肽具有分子量低、水溶性好、热稳定、强碱性和广谱抗茵等特点。目前对其研究已经深入到分子结构、作用机制等多个方面。山东农业大学硕士学位论文Ｓｕｂｔｉｌｉｎ，Ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ，Ｓｕｂｌａｎｃｉｎ都是抗菌肽类型。Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ和Ｅｄｅｉｎｅ是Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ产生的线状抗真菌短肽（Ｋｌｅｊｉｎｋａｕｆ，１９９０）。一些枯草芽孢杆菌菌株还能够产生一种环状１３肽Ｍｙｃｏｂａｃｉｌｌｉｎ（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，１９６３），结构为Ｄ－Ｐｒｏ―Ｄ―Ａｓｐ－Ｄ－Ｇｌｕ?Ｔｙｒ―Ａｓｐ―Ｔｙｒ―Ｓｅｒ－Ｄ?Ａｓｐ．Ａｌａ．Ｄ－Ｇｌｕ．Ｌｅｕ?Ｄ．Ａｓｐ。从ＴＧ２６菌株中分离出环状多肽Ｂ１分子量为１４．４９７Ｄ，Ｎ末端部分序列为Ｔｙｒ．Ｇｉｎ．Ａｌａ．Ｐｒｏ．Ｇｌａ．Ｔｙｒ．Ｉｌｅ．Ｔｙｒ（刘伊强，１９９４）。何青芳（２００２）等研究发现Ａ３０对多种植物病原真菌，例如水稻纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）、稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ）等有强烈抑制作用，纯化该菌株抗茵活性物质得到拮抗环状多肽Ｐ１。何红（２００３）等发现ＢＳ．２菌株分泌的抗菌多肽对热稳定并能抗紫外线照射，对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等多种植物病原真菌和细菌有强烈的抑制作用，对辣椒果炭疽病具有６９．７９％（９ｄ后）的防病效果。（３）其他抗生素根际拮抗内生细菌产生的抗生素物质包括双乙酰藤黄酚（ＰＨＬ），吩嗪羧酸（ＰＣＡ），藤黄绿脓素（ｐｙｏｌｕｔｅｒｉｎ），毗咯菌素（ｐｙｒｏｌｎｉｔｒｉｎ），和一类丁酰内酯（ｂｕｔｙｒｏｌａｅ．ｔｏｎｅｓ）等。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．能产生一些脂多肽类抗生素（１ｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ）对植物根部病害有显著的抑制作用。由Ｉ＇ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ和Ｂｕｒｈｏｌｄｅｒｉａ产生的Ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ对多种植物真菌性病原菌如Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ及一些革兰氏阳性细菌以及Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ具有很好的防治效果（Ｆｏｌｄｅｓ，２０００）。同样由多种Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株产生的拮抗物质ＤＡＰＧ，不仅可以防治多种植物真菌和细菌性病害，还可以防治植物线虫病害。１．４．２．２核糖体合成的抗菌蛋白（１）细菌素细菌素是细菌合成的对其他微生物具有抗生作用的小分子量的蛋白质，．大多含有一些稀有氨基酸分子结构，而且一般是环肽。内生枯草芽孢杆菌能够产生细菌素Ｓｕｂｔｉｌｉｎ和Ｓｕｂｔｉｌｏｓｉｎ，其中枯草菌素（Ｓｕｂｔｉｌｉｎ）是迄今为止研究较深的细菌素之一。枯草菌素的前体是５６个Ａａ小肽，其中２４个Ａａ为信号肽，经信号肽酶切除和一系列修饰如Ｔｈｒ脱水和Ｓｅｒ与Ｃｙｓ硫酯化可以形成３２个Ａａ的活性小肽，具有抗１７茄科植物内生细菌对几种病原真菌的作用及抗菌物质分析酸和抗热的特性。有不少关于枯草芽孢杆菌细菌素抑制革兰氏阳性细菌和真菌的报道，Ｚｈｅｎｇ（１９９９）等从枯草芽孢杆菌中分离出一种对食品病原细菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ和Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｔｕｍ有抑制作用的新‘细菌素，，它可以作为一种抗菌物质应用于食品保鲜。（２）细胞壁降解酶类内生菌另一个重要的生防机制就是产生几丁质酶、Ｂ．１，３．葡聚糖酶等水解酶类，可以降解真菌的细胞壁或其它致病因子如毒素等，可以消解病原真菌的细胞壁，抑制病原菌生长，达到抗菌防病的目的。分离自橡树的内生细菌有些能产生几丁质酶抑制病菌的生长（Ｂｒｏｏｋｓ，１９８８）。某些生防菌的几丁质酶基因已经被克隆，可以将此基因转化到内生细菌中，发挥内生细菌的优势，提高防病效果，用内生细菌防治棉花黄萎病，可能产生某些蛋白酶降解毒素或产生抑制物抑制病菌产生致病因子达到防病的效果（夏正俊，１９９６）。１．４．２．３其他抗菌蛋白国内外不断有分离内生菌产生新的抗菌蛋白的报道。何红（２００３）等从辣椒中分离了一株内生枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ），其产生的抗菌多肽对热稳定，１００℃３０ｒａｉｎ和１２１℃２０ｒａｉｎ活性基本不变，在中性ｐＨ范围较稳定，并抗紫外线照射，对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等多种植物病原真菌和细菌有强烈的抑制作用。黄绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）是存在于草本植物的叶子表面或组织内的一类产荧光细菌，由它产生的抗菌物质ｅ－ｅｏｍｙｃｉｎｓ是由几个新颖脂多肽组成，结构中除了含共同的氨基酸，。如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸之外，还含有稀有氨基酸、高丝氨酸和Ｂ．羟基门冬氨酸。它对植物病原菌微荚膜新隐球酵母（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）和ｃａ色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）具有抑菌活性（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９８）。还有一些未知蛋白在抑制植物病原菌方面也表现出强烈的作用－ｏ林东（２００１）等发现Ｓ０１１３菌株对水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）有强烈的抑菌作用，对中国各稻区的白叶枯病菌的７种致病型都有强烈的抑杀作用，它分泌的蛋白对水稻白叶枯病菌表现出良好的广谱抗性以及丰富的抗菌活性峰。山东农业大学硕士学位论文此外，植物内生菌产生的抗菌物质还有挥发性抗菌物质（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｖｏｌａｔｉｌｅｓ，ＡＦＶｓ）（Ｆｉｄｄａｍａｎ，１９９３）、嗜铁素（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ）（Ｒａｎ，２００５）、氢氰酸（ｈｙｄｒｏｃｙａｎｉｃａｃｉｄ）（闰小雪，２００４）、植物生长调节剂等十余种化合物，它们在抑制植物病原菌方面也发挥了重要作用。１．５植物内生细菌研究中存在的问题及应用前景在植物内生细菌的研究过程中，特别是在研究方法和手段方面仍存在一些问题：内生细菌的分离过程中，灭菌时间过轻或过重都会影响植物内生细菌调查的准确性，前者会扩大植物内生细菌的生物多样性，而后者会导致许多内生细菌的丢失；需要寻找一个切实可行的内生细菌标记和检测系统，才有利于其功能的研究；内生细菌在寄主植物中的数量是否足以保证其发挥生物学作用，现行对植物内生细菌的数量估计依赖于培养基，用哪些培养基才能反映内生细菌在寄主组织中的真实数量等等。由于植物本身就是一个复杂的微生态体系，要想将植物内生细菌应用到生产实践，需要解决很多问题，如内生细菌作为生化因子，必须考虑它的病理学作用，在正常条件下或恶劣环境下对寄主植物是否致病；内生细菌与植物建立的共生关系与其它微生物与植物建立的共生关系是否一致，相互作用如何等等（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，１９９２；Ｓｔｕｒｚ，１９９７）。只有通过对植物内生菌对宿主植物及其组织专一性的机理，内生菌的分布、定植规律等生态学问题，植物病害防治的机制，现代生物技术对内生菌遗传改良，以及内生菌发酵生产技术等问题进行全面系统的研究，才能推动植物内生菌研究的不断深入，促进其在生产实践中的广泛应用，充分发挥其生防作用。植物内生细菌的生境特殊性决定了其既有理论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力，是个潜力巨大、尚待进一步开发和利用的生物资源。从植物内生体内筛选拮抗细菌，寻找其代谢产物中的新型活性物质，开发生物源农药，实现农业生物防治，将是内生细菌的研究主流：从各个层次深入探讨内生细菌――宿主之间的相互关系，将有助于了解内生细菌的生物学本质及其未知的生态学作用；分子生物学手段将在内生细菌研究的各个方面发挥重要作用。随着人们对于自然环境保护意识的不断加强，现代农业逐步向生态型农业方向发展，茄科植物内生细菌对几种病原真菌的作用及抗菌物质分析研究和利用植物内生细菌是一条重要的思路：研究植物内生细菌对于重新建立植物体内细菌的多样性，保护植物减少来自外部环境和并虫害的压力，为植物提供氮肥和植物促生有重要作用；对于替代或减少化肥和农药的使用，改善农业生态系统，保持植物微生态系统的生物多样性，以及维护农田生态平衡实现农业可持续发展将起到重要作用（孔庆科，２００１；Ｗｕ，２００４）。可以说，研究和利用植物内生细菌，具有广阔而诱人的发展前景。１．６本研究的目的和意义随着保护地蔬菜的发展和种植制度的调整，茄科蔬菜病害的发生及危害有逐年加重趋势。除疫病、病毒病、青枯病等是危害性大的主要病害之外，黄萎病、灰霉病、猝倒病、立枯病、枯萎病、炭疽病、叶枯病、沤根等也是经常发生并造成局部流行的病害，每年给茄科蔬菜的生产造成严重的损失（何树海，２００３；王振学，２００３；吉用铨，２００６）。目前国内在对该类病害的防治方面，除了加强苗床管理和种子处理外，主要是采用化学药剂防治，但存在着易造成残留污染、诱发病原菌抗药性和伤害非靶标生物等不利影响（邱思鑫，２００４）。本研究旨在从茄科植物健康组织内筛选内生拮抗细菌，对拮抗活性强的菌株进行种的鉴定和内生性验证；研究其发酵液对供试植物病原真菌菌丝生长、孢子萌发的影响；分析其产生的抑菌代谢产物及部分性质。为以后生防资源的开发利用、菌株的遗传改良、多功能生防菌剂的研制提供理论依据。山东农业大学硕士学位论文２材料与方法２．１材料２．１．１标本来源采样地点在泰安、新泰、肥城、临沂、济南等７县（市），主要包括番茄、辣椒等茄科植物，在发病重的地块，选取发病较轻和不发病的植株，整株拔起带回实验室，供植物内生细菌分离与筛选。２．１．２培养基（１）肉汁胨培养基（ＮＡ）：牛肉浸膏３．０ｇ，酵母浸膏１．０ｇ，蛋白胨５．０ｇ，葡萄糖１０ｇ，琼胶１５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值６．８―７．０７（２）马铃薯葡萄糖培养基（ＰＤＡ）：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼胶１５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值７．０。（３）基本组合培养液：ＮＨ４Ｈ２ＰＱ４１．０ｇ，ＭｇＳ０４?７Ｈ２００．２ｇ，ＫＣｌ０．２ｇ，酵母膏０．２ｇ，溴百里酚蓝（１．６％酒精溶液）１ｍＬ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值７．２。每支试管装４．５ｍＬ培养液，湿热灭菌１２１。Ｃ２５ｒａｉｎ。将所测定的碳素化合物于１１５℃下灭菌１０ｒａｉｎ。测定方法：在无菌操作条件下加入灭菌的１０％碳素化合物Ｏ．５ｍＬ，使碳素化合物在培养液中最终浓度为１％。每试管接种０．１ｍＬ菌液（浓度１０８ｃｆｕ／ｍＬ），３次重复，并设无菌对照。２８℃条件下培养，每天观察一次，记录产酸、产气情况。。‘（４）淀粉水解培养基：牛肉浸膏３．０ｇ，蛋白胨５．０ｇ，葡萄糖２．５ｇ，淀粉２．０ｇ，琼脂ｌ８ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值７．２。（５）七叶灵水解培养基：蛋白胨５．０ｇ，酵母膏１．０ｇ，蔗糖５．０ｇ，七叶苷１．０ｇ，柠檬酸铁０．５ｇ，琼脂１７ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值７．Ｏ。（６）葡萄糖蛋白胨培养液：蛋白胨５．Ｏｇ，葡萄糖５．０ｇ，ＫＨ２Ｐ０４５．０９，蒸馏水１０００ｍＬ。（７）吐温８０培养基：蛋白陈１０ｇ，ＣａＣｌ２?２Ｈ２００．１ｇ，琼脂１７ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ值７．４。２ｌ．包含总结汇报、高中教育、自然科学、经管营销、出国留学、IT计算机、计划方案以及茄科植物内生细菌对几种病原真菌的作用及抗性物质分析等内容。本文共13页
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