狗粮是怎样生产出来的？告诉你一个真实的狗粮生产过程！
　　声明：访问者可将本人提供的文章用于个人学习、研究或欣赏，以及其他非商业性或非盈利性用途，但同时应遵守著作权法及其他相关法律的规定，不得侵犯本人的合法著作权。除此以外，将本文章或理论用于其他商业用途时，须征得本人的书面许可。
　　《关于宠物食品中维生素的研究》
　　节选自《宠物食品制造技术与应用》
　　作者简介 王天飞，宠物营养高级配方师，《宠物营养》杂志编委。“宠物食品适口性损害修复”理论倡导第一人。在国内最先提出了“关于宠物食品在生产制造过程中适口性损害修复性技术”的理论。此举引起了行业内的广泛关注。从事动物、宠物食品营养科学的研究十余年，具体负责产品营养技术配方、宠物食品诱食采食技术的钻研。
　　在宠物营养食品方面有着多年的研发制造经验和独到的见解，在国内诸多专业期刊发表技术论文，如：《宠物食品的适口性技术与研究》、《宠物食品的膨化技术利与弊》、《氨基酸在宠物食品中的促进生长作用》、《宠物食品的低脂化要求》、《宠物神经性诱食产品在宠物食品中的应用》等。现为多家宠物食品企业、狗粮制造企业的技术顾问和宠物食品技术创新多课题项目研发主要专家。
　　【维生素的发现与来源】
　　维生素vitamin的发现是20世纪的伟大发现之一。1897年,C.艾克曼在爪哇发现只吃精磨的白米即可患脚气病，未经碾磨的糙米能治疗这种病。并发现可治脚气病的物质能用水或酒精提取,当时称这种物质为“水溶性B”。1906年证明食物中含有除蛋白质、脂类、碳水化合物、无机盐和水以外的“辅助因素”，其量很小，但为动物生长所必需。1911年C.丰克鉴定出在糙米中能对抗脚气病的物质是胺类（一类含氮的化合物），它是维持生命所必需的，所以建议命名为“ Vitamine”。即Vital（生命的）amine（胺）,中文意思为“生命胺”。以后陆续发现许多维生素，它们的化学性质不同,生理功能不同;也发现许多维生素根本不含胺，不含氮，但丰克的命名延续使用下来了,只是将最后字母“e”去掉。最初发现的维生素B后来证实为维生素B复合体,经提纯分离发现,是几种物质，只是性质和在食品中的分布类似，且多数为辅酶。有的供给量须彼此平衡,如维生素B1、B2和PP,否则可影响生理作用。维生素B 复合体包括：泛酸、烟酸、生物素、叶酸、维生素B1（硫胺素）、维生素B2（核黄素）、吡哆醇（维生素B6）和氰钴胺（维生素B12）。有人也将胆碱、肌醇、对氨基苯酸（对氨基苯甲酸）、肉毒碱、硫辛酸包括在B复合体内。
　　脂溶性抗干眼病维生素(维生素A)，亦称美容维生素 由Elmer McCollum和M. Davis在1912年到1914年之间发现。并不是单一的化合物，而是一系列视黄醇的衍生物(视黄醇亦被译作维生素A醇、松香油)，别称抗干眼病维生素 鱼肝油、绿色蔬菜
　　水溶性 硫胺素(维生素B1) 由卡西米尔·冯克在1912年发现（一说1911年）。在生物体内通常以硫胺焦磷酸盐（TPP）的形式存在；
　　水溶性 烟酸(维生素B3) 由Conrad Elvehjem在1937年发现。也被称为维生素P、维生素PP、包括尼克酸（烟酸）和尼克酰胺（烟酰胺）两种物质，均属于吡啶衍生物。
　　　　水溶性 吡哆醇类(维生素B6) 由Paul Gyorgy在1934年发现。包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺；
　　　　水溶性 生物素(维生素B7) 也被称为维生素H或辅酶R ；
　　　　水溶性 叶酸(维生素B9) 也被称为蝶酰谷氨酸、蝶酸单麸胺酸、维生素M或叶精；
　　　　水溶性 肌醇 环己六醇、维生素B-h；
　　　　水溶性 抗坏血酸(维生素C) 由詹姆斯·林德在1747年发现。亦称为抗坏血酸；
　　脂溶性 钙化醇(维生素D) 由Edward Mellanby在1922年发现。亦称为骨化醇、抗佝偻病维生素，主要有维生素D2即麦角钙化醇和维生素D3即胆钙化醇；
　　　　脂溶性 萘醌类(维生素K) 由Henrik Dam在1929年发现。是一系列萘醌的衍生物的统称，主要有天然的来自植物的维生素K1、来自动物的维生素K2以及人工合成的维生素K3和维生素K4。又被称为凝血维生素；
　　【各种维生素对宠物生命的作用及意义】
　　维生素是一种对宠物体质代谢必需的并且是需要量很少的低分子有机化合物，体内一般不能够合成，主要依赖于宠物食品提供，除了个别的几种维生素以外，大部分要求在宠物食品的生产制造中额外添加。维生素不是形成机体的组织器官原料，也不是能源物质，主要以辅酶和催化剂的形式广泛参与体内的代谢，从而保证机体组织器官的细胞结构和正常功能、维持宠物的健康和各种生产活动。在宠物食品中根据宠物不同品种、不同生理阶段、发育状况等具体因素要求非常严格的进行添加，不可采取以其他动物所需维生素进行替代，正常量与非正常量之间往往会引起宠物的敏感变化，切勿随意添加。不同的种类维生素对宠物有着不同的作用与意义，例如：
　　Va（抗干眼症维生素、视黄醇）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vk（抗出血症维生素）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vb1（硫胺素）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vb2（核黄素）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vb3（泛酸、遍多酸）；□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　烟酸（尼克酸、维生素PP）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vb6：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vb12（钴胺素）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vd（抗佝偻症维生素）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Ve（抗不育症维生素、生育酚）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　生物素（维生素H）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　叶酸：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　胆碱：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　Vc（抗坏血酸）：□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□；
　　有一些维生素是可以通过宠物自身机体合成的部分，在宠物食品制造与生产时不需额外添加，既增加了生产成本又没有实际的意义，但是有些维生素是必须要求在宠物食品中添加的，因为，宠物自身无法合成又很难从其他途径获得，唯有从食品中获取。
　　不同种类的维生素对宠物均有着不同的生理作用与特性，缺乏与过量都会给宠物带来较大的影响，因此，这就要求在宠物食品的生产配方设计中严格掌握宠物对不同维生素的需求量。
　　【各种维生素在宠物食品中的严格用量】
　　Va（抗干眼症维生素、视黄醇）：□□%；
　　Vk（抗出血症维生素）：□□%；
　　Vb1（硫胺素）：□□%；
　　Vb2（核黄素）：□□%；
　　Vb3（泛酸、遍多酸）；□□%；
　　烟酸（尼克酸、维生素PP）：□□%；
　　Vb12（钴胺素）：□□%；
　　Vd（抗佝偻症维生素）：□□%；
　　Ve（抗不育症维生素、生育酚）：□□%；
　　生物素（维生素H）：□□%；
　　Vc（抗坏血酸）：□□%；
　　【维生素缺乏与过量的不良后果】
　　目前已经确定的维生素有14种，按其溶解性既分为上述两大类：水溶性、脂溶性。不同的维生素在其用量上有着严格的要求，恰当的添加对于宠物的健康生长发育、提高产品适口性、提高体质免疫力、预防疾病等都能够起到积极的作用。缺乏与过量都会给宠物的机体带来严重的不良后果。
　　维生素添加量不准确一旦缺乏或超量添加，会给宠物带来诸如中毒、器官退化、脱毛、行动困难、无法站立、溶血、食欲不振、心肌炎、肌肉萎缩、生长停滞、失明、贫血、痉挛、缺氧甚至死亡等严重的后果，因此，在宠物食品中必须严格按照宠物所需的量来添加。
　　【维生素在宠物食品原料中的来源】
　　　　在宠物食品生产与制造过程中，往往会额外添加一些食品级或者饲料级的维生素，同样，在广泛的宠物食品原料中也蕴含着丰富的维生素营养，具体为：
　　维生素A：动物肝脏、蛋类、乳制品、胡萝卜、南瓜、香蕉、橘子和一些绿叶蔬菜中；
　　　　维生素B1：葵花籽、花生、大豆、猪肉、谷类中；
　　　　维生素B6：肉类、谷类、蔬菜和坚果中；
　　　　维生素B12：猪牛羊肉、鱼、禽、贝壳类、蛋类中。
　　　　维生素C：柠檬、橘子、苹果、酸枣、草莓、辣椒、土豆、菠菜中；
　　　　维生素D：鱼肝油、鸡蛋、人造黄油、牛奶、金枪鱼中；
　　　　维生素E：谷物胚胎、植物油、绿叶；
　　维生素K：绿叶蔬菜中。
　　【在宠物食品中使用维生素应注意的事项】
　　宠物食品的制造过程是一个复杂的过程，有物理的变化、化学的变化甚至是微生物的变化，那么在生产制造过程中，对待维生素的使用同样要根据维生素物质的特殊特性进行调整，具体总结以下注意事项：
　　1、 根据宠物不同生理阶段、不同品种严格掌握添加量；
　　2、 充分考虑维生素在生产过程中的损失问题；
　　3、 利用好维生素的特性，强调生产工艺的变化；
　　4、 考虑维生素彼此之间和与其他营养物质之间的拮抗与禁忌；
　　5、 结合宠物食品制造特点具体分析，有些种类的维生素是宠物自身能够合成的既可以放弃选择，从而在不影响品质的前提下降低成本，维护企业利益；
　　维生素作为宠物食品中必须添加的营养成分，有着广泛和重要的意义，根据当前国内宠物食品的生产制造现状来看，部分地区还存在着用其他动物多维替代使用、使用剂量不严格、不准确、缺乏添加或者过量添加等落后现象，因此，提高掌握维生素在宠物食品营养学中专业应用知识是非常有必要的。

一种适用于hek293细胞的无血清培养基
1.本发明涉及培养基技术领域，尤其涉及一种适用于hek293细胞的无血清培养基。

2.从体外生化研究到制药和临床应用等各个领域都需要用到大量高质量的重组蛋白。生产具有复杂翻译后修饰的重组蛋白的技术代表了结构和功能研究的主要挑战。
3.可用于瞬时转染的哺乳动物细胞系的快速建立和高回收率解决了这一障碍。在最常用的哺乳动物细胞系中，人胚胎肾293(hek293)细胞因其生长速度快、相对易于操作和高转染效率等优点，而成为研究和规模生产的标准选择。
4.细胞培养基是决定细胞体外生长代谢最重要、最直接的环境因素。目前大多数合成细胞培养基均需要补充动物血清才能支持细胞的体外生长、增殖，而动物血清的使用带来了动物性病原微生物污染培养物的可能，因此推动了动物细胞无血清培养基的发展。
5.无血清培养基一般是由基础培养基和替代血清的补充因子组成的。无血清培养技术是细胞培养研究中的一个里程碑。由于无血清培养基全部是由已知成分组成的，不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的机制这一生命科学中的根本问题提供了有力的工具，而且为现代生物技术如基因工程、蛋白质工程、细胞工程和单克隆抗体等的应用奠定了基础。
6.为了使hek293细胞能够大规模应用于瞬时转染，常将其驯化为悬浮生长；然而在悬浮培养过程中hek293细胞极易结团，细胞团直接影响细胞活性，导致hek293细胞无法高密度扩增、连续传代。现有抗结团hek293细胞无血清培养基中的谷氨酰胺容易降解，并且影响细胞生长，因此急需研发既抗结团，又不影响细胞生长的hek293细胞无血清培养基。

7.有鉴于此，本发明提出了一种化学成分确定，无动物源，不含蛋白质或生长因子，支持多种hek293及其衍生型细胞的无血清培养基。
8.本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种适用于hek293细胞的无血清培养基，包括氨基酸、无机盐、维生素、抗结团剂和稳定剂；每1l培养基含氨基酸275
9.在以上技术方案的基础上，优选的，所述抗结团剂为f68，稳定剂为glutagro。
10.在以上技术方案的基础上，优选的，所述氨基酸组分及含量为：甘氨酸10
11.在以上技术方案的基础上，优选的，所述无机盐组分及含量为：无水氯化钙100
2mg/l、磷酸二氢钠
12.在以上技术方案的基础上，优选的，所述维生素组分及含量为：抗坏血酸10
13.在以上技术方案的基础上，优选的，所述添加剂组分及含量为：葡萄糖1000
14.在以上技术方案的基础上，优选的，所述核苷组分及含量为：腺苷5
15.在以上技术方案的基础上，优选的，所述培养基的ph值为7
16.更进一步优选的，一种适用于hek293细胞的无血清培养基在多种hek293细胞及其衍生型细胞中的应用。
17.本发明的一种适用于hek293细胞的无血清培养基相对于现有技术具有以下有益效果：
18.1、本发明的hek293细胞无血清培养基可明显减少细胞结团现象。
19.2、本发明的hek293细胞无血清培养基以glutagro替代谷氨酰胺，可提高细胞稳定性并最大限度延长保质期，可以在2
8℃条件下保存6个月。
20.3、本发明的hek293细胞无血清培养基可以在单位时间获得更高的蛋白产量。
21.4、本发明的培养基化学成分确定，无动物源，不含蛋白质或生长因子，支持多种hek293及其衍生型的细胞，用于快速增殖和高密度培养，支持高效的重组蛋白质表达，表达提高到g/l水平，支持慢病毒和腺病毒的生产，病毒滴度可达1e7tu/ml，易于放大培养规模，适用于平板、摇瓶、tpp管、wave及其他反应器。
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明的培养基抗结团效果图；
24.图2为重组蛋白在培养基中的表达量对比图；
25.图3为293f细胞在培养基中的生长曲线图。
26.下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基
于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
28.一种适用于hek293细胞的无血清培养基，包括氨基酸、无机盐、维生素、抗结团剂和稳定剂。每1l培养基含氨基酸720mg，无机盐29602.6mg，维生素33.93mg，添加剂2615mg，核苷183mg，f68600mg，glutagro 200mg，余量为水；具体成分及含量见表1。
29.将上述各组分依次溶于无菌去离子水中，并用hcl和naoh调节培养基的ph值为7。
31.一种适用于hek293细胞的无血清培养基，包括氨基酸、无机盐、维生素、抗结团剂和稳定剂。
33.将上述各组分依次溶于无菌去离子水中，并用hcl和naoh调节培养基的ph值为7.5。
35.一种适用于hek293细胞的无血清培养基，包括氨基酸、无机盐、维生素、抗结团剂和稳定剂。
37.将上述各组分依次溶于无菌去离子水中，并用hcl和naoh调节培养基的ph值为7.1。
39.一种适用于hek293细胞的无血清培养基，包括氨基酸、无机盐、维生素、抗结团剂和稳定剂。
41.将上述各组分依次溶于无菌去离子水中，并用hcl和naoh调节培养基的ph值为7.2。
43.一种适用于hek293细胞的无血清培养基，包括氨基酸、无机盐、维生素、抗结团剂和稳定剂。
45.将上述各组分依次溶于无菌去离子水中，并用hcl和naoh调节培养基的ph值为7.3。
cell 293无血清培养基为对比例。
48.表1培养基组分含量
备注：上述为配备1l培养基所含的组分及含量，单位mg/l，余量为无菌去离子水。
cell 293无血清培养基，将已经驯化好的hek293f细胞在50ml培养皿中连续培养6天，观察细胞生长并进行活细胞计数，结果见图1。
cell 293无血清培养基培养的hek293t细胞，可见细胞呈结团状；1
b可见hek293f细胞呈分散、悬浮形式正常生长，没有存在结团现象。图2中可以看出，与对比例相比，本发明实施例培养基接种的hek293f细胞，在37℃培养6天后，细胞密度达到9.6
106。表明稳定剂glutagro不仅不影响细胞生长，还具有促进细胞快速增长的作用。
1单抗3种蛋白在实施例和对比例培养基中培养，观察3种蛋白的表达量，实验步骤如下：
s1，复苏：取同一批次冻存的hek293细胞在培养基hek293里复苏。将细胞在37℃培养箱中(120rpm，8％co2)孵育准备转染并表达目的蛋白。
s2，细胞培养：当细胞活率≥95％且生长处于对数中期时，才开始进行驯化程序；直接将细胞接种到本发明的hek293细胞无血清培养基和ex
cell 293无血清培养基中进行培养。
3d进行一次传代操作，以保持细胞处于早期对数生长期。细胞接种密度为0.3
106细胞/ml。当细胞密度达到3
4d)时，再次传代培养细胞。细胞密度达到约3
106个活细胞/ml，活率≥95％时，准备转染质粒。
s4，质粒转染：转染前一天，将细胞按3
106细胞/ml细胞密度接种，并使细胞生长过夜。在第二天(转染当天)，获取包括细胞密度和存活率的数据。进行转染的细胞活率应≥95％。使用新鲜的培养基将细胞稀释至3
106细胞/ml。按照dna：1.5mg/l、pei：3mg/l的转染体系准备转染质粒和pei。用培养基稀释质粒dna。通过旋转和/或翻转试管混匀。
s5：将含有pei的试管轻轻翻转4至5次以充分混匀。并用培养基稀释pei。通过旋转和/或翻转试管来混合。将稀释后的pei加到稀释后的质粒dna中。旋转和/或颠倒试管或用移液器轻轻吹打2
3次进行混合。将复合物在室温下孵育约20min。将复合物缓慢添加至细胞摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将摇瓶放回37℃培养箱中按日常条件培养。在转染第二天，在转染后16
profeed，在添加过程中轻轻晃动摇瓶。将摇瓶放回37℃培养箱。在瞬时表达过程中，维持葡萄糖浓度在4g/l以上。当细胞活率低于60％时收获细胞和表达产物，检测细胞培养液中蛋白浓度。
蛋白表达结果见图3，图3可知，与ex
cell 293无血清培养基相比，本发明培养基可显著增加蛋白表达量，表达水平高于对比ex
表2培养基保存条件及时间
[0062] 实施例一实施例二实施例三实施例四实施例五对比例2
表2为本发明培养基保存时长，表中可以看出本发明培养基可以在2
193d，为对比例的2倍，由此说明glutagro不仅可以促进细胞生长，增加重组蛋白表达量，还可以延长保存时长。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。