分子标志物及其在检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤中的应用
1.本发明涉及一种用于疾病诊断的有用标志物，属于血液病检测技术领域，具体地涉及一种分子标志物及其在检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤中的应用。

2.血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)是外周t细胞淋巴瘤的一种，约占外周t细胞淋巴瘤的20％，其长期预后欠佳，5年生存率约为30
40％。病理学上，最典型的改变是滤泡结构破坏，高内皮静脉增生和树突细胞增生。但由于aitl的异常细胞往往比例很低，背景细胞丰富，多为大量正常的t淋巴细胞、b淋巴细胞、免疫母细胞，嗜酸性粒细胞或散在的rs细胞，仅通过病理学及免疫组化，有时候难以将aitl与反应性增生、霍奇金淋巴瘤、弥漫大b细胞淋巴瘤等相鉴别。因此，在疾病早期阶段或缺乏典型的形态学特征时，往往需要进行多次病理学活检才能最终确诊。且有少数病人，由于存在免疫性血细胞减少，无法进行淋巴结检查。以上均给疾病的早期诊断造成困难。
3.who及nccn指南均推荐chop方案作为aitl治疗的一线治疗方案，但此方案仍具有较高的复发率，目前亟需一种新的治疗方案提高疗效。随着靶向治疗及免疫治疗等新疗法的不断出现，细胞免疫治疗已成为新的研究方向。嵌合抗原受体t细胞(chimeric
cell，cart)通过基因改造t细胞实现对肿瘤相关抗原特异性识别，从而使效应t细胞充分发挥抗肿瘤作用，是目前细胞免疫治疗的重点，并且最早应用于急性b淋巴细胞白血病的治疗。随着cart疗法进一步研究的深入，发现抗cd5cart细胞也被应用于复发难治的t细胞淋巴瘤。实际上，cart治疗前，需要对靶向的抗原分子在异常细胞表面的抗原表达密度进行评估。抗原密度太低，靶细胞即肿瘤细胞不能有效被杀伤，且有可能造成脱靶，因此抗原表达密度的检测非常重要。将aitl患者的正常cd4+t淋巴细胞作为内对照，与肿瘤细胞表面的靶点抗原平均荧光强度对比，可以在一定程度上反应肿瘤细胞靶点抗原表达情况，属于相对定量检测，简单快速。联合聚乙烯藻红蛋白荧光定量试剂盒(pe phycoerythrin fluorescence quantitation kit)，可以对肿瘤细胞的抗原表达密度的进行绝对定量检测，进一步降低仪器状态、细胞大小、试剂和操作等造成影响，然而该试剂盒的市面定价并不便宜。
4.精确找到肿瘤细胞，对肿瘤细胞靶点抗原的平均荧光强度及抗原表达密度进行检测，目前仅能通过流式细胞仪才能做到。
5.多参数流式使用荧光抗体标记细胞，能够对单个细胞实现定量分析，具有高度的灵敏性，是目前最先进的细胞定量分析方法之一，已经被广泛应用于白血病、淋巴瘤的诊断及随访领域。然而目前多参数流式仅使用泛t标志物对血管免疫母性t细胞淋巴瘤进行初筛，泛t标志物包括胞膜的cd2、cd3、cd5、cd7、cd4、cd8等，典型的cd3
cd4+t淋巴细胞很容易被检出，但也存在少数cd3强度正常或稍低的患者，往往造成漏诊。对于骨髓样本，t淋巴细胞cd7的表达具有异质性，反应性的t淋巴细胞也可以显示cd7的丢失，故无法将肿瘤细胞与
多克隆反应性t淋巴细胞进行鉴别。嗜酸性粒细胞增高导致的淋巴细胞改变，也可以出现cd3
6.综上，现有的多参数流式存在以下问题：1、不适用于无泛t标志表达缺失的患者，此类病人往往无法通过常规设门方式找出异常细胞。2、若异常细胞仅有表达胞膜cd3表达强度稍弱，cd7的表达正常时，对于没有经验的人员来说，往往容易漏诊。3、目前的初筛手段无法判断t淋巴细胞的克隆性，无法对cd4+cd7
细胞群进行良恶性鉴定。4、使用tcr vβ进行t细胞克隆性鉴定，所需样本量多，成本较高，且操作费时费力。5、对于细胞量较少的穿刺物或骨髓样本，无法一次性确定肿瘤细胞的类型。6、若异常细胞需要使用多个泛t标记进行设门，后期加做成本较高。7、若无法瞄准肿瘤细胞，则无法对抗原平均荧光强度进行评估，从而影响后续治疗。

7.为解决上述技术问题，本发明提供了一种分子标志物及其在检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤中的应用。该分子标志物不仅可实现对aitl的早期筛选，同时还具备操作快速、简便、经济等优点，同时可以对靶点抗原进行免疫荧光强度的评估，进而指导治疗。
8.为实现上述目的，本发明公开了一种分子标志物，它包括cd4抗体、cd7抗体、cd45抗体、trbc 1抗体、cd5抗体、cd3抗体、cd10抗体、pd1抗体和cd8抗体。本发明设计采用的所有抗体均为胞膜抗体，样本损耗量小。同时，由于使用多种标志组合设门，相比于传统抗体组合，可以避免cd3表达强度正常或稍弱造成的漏诊，有助于提高诊断的敏感性；且该分子标志物主要用于检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤和/或骨髓微小残留病灶和/或有泛t抗原丢失的t细胞淋巴瘤。
9.进一步地，各所述抗体为单克隆抗体。
10.进一步地，各所述抗体均为荧光素标记的抗体，且所述cd4抗体为bv605标记，所述cd7抗体为v450标记，所述cd45抗体为v500标记，所述trbc 1抗体为fitc标记，所述cd5抗体为pe标记，所述cd3抗体为percp
cy7标记，所述pd1抗体为apc标记，所述cd8抗体为apc
12.此外，本发明还公开了一种试剂盒，它包括上述分子标志物及用于放置所述分子标志物的储存部件。这里的储存部件为常规储存部件。且该试剂盒主要用于检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤和/或骨髓微小残留病灶和/或有泛t抗原丢失的t细胞淋巴瘤。
13.进一步地，所述试剂盒还包括溶血素、缓冲液，以及与流式细胞仪配套使用的流式管。其中，所述缓冲液可为pbs缓冲液或其它缓冲液。且该试剂盒主要用于检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤和/或骨髓微小残留病灶和/或有泛t抗原丢失的t细胞淋巴瘤。
14.与此同时，本发明还公开了上述分子标志物在制备用于检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤和/或骨髓微小残留病灶的试剂盒中的应用。
15.此外，上述分子标志物还具备在制备用于检测有泛t抗原丢失的t细胞淋巴瘤的试剂盒中的应用。
16.与此同时，本发明还公开了一种用于检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤和/或骨
髓微小残留病灶和/或泛t抗原丢失的t细胞淋巴瘤的泛t抗原丢失的t细胞淋巴瘤的分子标志物，它为cd4抗体、cd7抗体、cd45抗体、trbc 1抗体、cd5抗体和cd3抗体、cd10抗体、pd1抗体和cd8抗体按照2:2:3:5:5:6:2:3:2的体积比的混合物。
17.进一步地，所述检测血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤和/或骨髓微小残留病灶的过程包括如下步骤：
18.1)将待检测样本加入到流式管中，使单个细胞呈悬液状态，并保证细胞量在1
107/管；若细胞量极少，则加入所有细胞；每管的样本体积不超过150ul，若体积超过150ul，可先用不含固定剂的1
19.2)将步骤1)所得样本与分子标志物混匀，室温避光孵育10～20分钟；
20.3)向步骤2)所得样本中加入1
溶血素，室温避光孵育5～15分钟；
21.4)对步骤3)所得样本离心去上清液；
22.5)向步骤4)所得样本中加入pbs缓冲液混匀，离心去上清，再用pbs缓冲液重悬细胞；
23.6)将步骤5)所得样本送入流式细胞仪中完成上机检测，并分析检测结果。
24.进一步地，步骤6)中，所述上机检测包括采用固定设门和多标志组合的设门方式，具体如下：
25.固定设门：去除黏连细胞门、活细胞门和血细胞门，其中，所述血细胞门通过cd45/ssc设置；
26.多标志组合设门：与所述cd45/ssc设门同步，使用cd3/ssc设置成熟t淋巴细胞门并查看cd4+t淋巴细胞的表达情况、cd8+t淋巴细胞的表达情况、以及cd3+t淋巴细胞trbc1的表达情况。
27.进一步地，步骤6)中，所述分析检测过程如下：
+，并进一步明确所述可疑细胞是否为异常表型和异常克隆，具体判断标准如下：
29.1)异常表型：泛t标志物表达强度的改变，如cd3的表达缺失或减弱，极少情况下表达增强；和/或cd7的表达增强、减弱或缺失；和/或cd4、cd5均呈阳性，伴有或不伴强度改变；且如果pd1强阳性和cd10阳性，可以判断为aitl；如果pd1强阳性，cd10阴性，则高度怀疑为aitl；
30.2)异常克隆：若trbc1阳性率大于85％，可以判断为单克隆性表达，确定为异常克隆；若trbc1阳性率小于15％，可怀疑为异常克隆；若trbc1阳性率为15～85％，可以判断为多克隆表达，为正常多克隆性t淋巴细胞。进一步地，步骤1)中，所述待检测样本包括骨髓、外周血、淋巴结、穿刺物、皮肤组织、胸腔积液、腹腔积液中任意一种的活细胞样本。故本发明不受样本类型影响。对于病情危重、免疫性血小板减少或无法取到足够组织样本的患者，应用于骨髓、外周血或体液样本，有利于早期诊断；并可以进行微小残留检测。
31.本发明的有益效果主要体现在如下几个方面：
32.1、本发明设计的分子标志物及相关试剂盒属于多种抗体的组合，不仅可以明确多种泛t标志物的表达，还可以利用trbc 1明确细胞的克隆性，可以同时进行免疫表型和克隆
性的鉴定，有利于提高准确度。
33.2、本发明设计的分子标志物还可以通过pd1的强表达，伴有或不伴cd10的表达，对t细胞淋巴瘤进行精确分型，有利于提高诊断的特异性，具体还可见文献1和文献2的辅助说明。
34.3、本发明设计的分子标志物及相关试剂盒较传统筛查方式更省样本、省成本，对细针穿刺物、脑脊液和骨髓样本仍可一次性确定肿瘤细胞的类型，即实现了微量检测。
35.4、本发明设计的分子标志物均为胞膜抗体，检测不受样本类型限制，适用于所有的活细胞样本，具有较广的应用范围，尤其对无法进行组织学检查的患者，可以用于确诊。
36.5、本发明设计的分子标志物及相关试剂盒使用简单，操作方便，省时省力。
37.6、本发明设计的分子标志物，其使用范围不仅仅局限于血管免疫母性t细胞淋巴瘤，对于有泛t抗原丢失的t细胞淋巴瘤均可筛查，且敏感度高。
38.7、本发明设计的分子标志物，使用pe荧光素测定异常细胞表面cd5分子的抗原表达荧光强度，实现相对定量检测，若联合聚乙烯藻红蛋白荧光定量试剂盒，可以进行绝对定量检测，精准的反应异常细胞表面该分子的抗原表达密度，为细胞免疫治疗提供支持。
39.8、本发明设计的分子标记物，可以应用于aitl微小残留病灶监测，且不受免疫治疗的影响。
40.图1为正常骨髓样本流式细胞术设门分析结果；
41.图2为正常骨髓样本流式细胞术设门分析结果；
42.图3为hes患者的骨髓样本流式细胞术设门分析结果；
cd4+t淋巴细胞的cml患者的骨髓样本流式细胞术设门分析结果；
44.图5、图6、图7、图8和图9为aitl患者的骨髓、淋巴结、外周血样本流式细胞术设门分析结果；
45.图10为aitl患者cd5平均荧光强度统计图及pd1平均荧光强度统计图。
血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤
t细胞受体β链恒定区1
60.各抗体的荧光强度表达含义
70.1、收集武汉地区，在2013年1月至2021年7月期间，临床诊断为aitl的患者208例，及关于该208例aitl患者活细胞样本，包括淋巴结样本98例，穿刺组织样本10例，皮肤组织样本1例，骨髓样本201例，外周血样本10例，腹水样本6例，胸水样本12例，其中，aitl患者的临床资料显示208例患者中，男性142例，女性66例，男女比例为2.15:1，年龄范围在19
82岁，平均年龄为58岁。＞60岁的99例，≤60岁的109例。通过以上病例总结aitl所有表型，是本抗体复合物设计的基础。实际使用本抗体复合患者有30名，标本为44例，其中，外周血样本7例，组织(包括穿刺物和淋巴结)样本12例，骨髓样本25例。
71.2、通过流式细胞术检测方法，检测aitl患者中各抗体表达情况，具体如实施例中记载。
72.3、主要实验试剂及仪器
74.抗体的种类、用量、厂家型号及荧光素的种类、厂家型号如表1所示；
75.表1分子标志物列表
4、本发明还公开了采用上述表1所示的分子标志物对血管免疫母t细胞淋巴瘤和/或骨髓微小残留病灶进行检测，具体过程如下：
1)将待检测样本加入到流式管中，使单个细胞呈悬液状态；其中，每个流式管中的细胞量为1
107个。若细胞量极少，如穿刺组织及脑脊液样本，则加入所有细胞；每管的样本体积通常不超过150ul，若体积超过150ul，可先用不含固定剂的1
2)将步骤1)所得样本与分子标志物混匀，室温避光孵育10～20分钟；
3)向步骤2)所得样本中加入1
溶血素，室温避光孵育5～15分钟；
4)对步骤3)所得样本离心去上清液；其中，离心力为300～450g，离心5分钟；
5)向步骤4)所得样本中加入pbs缓冲液混匀，离心去上清，再用pbs缓冲液重悬细胞；其中，所述pbs缓冲液的加入量约为500ul；
6)将步骤5)所得样本送入流式细胞仪中完成检测，并分析检测结果，具体使用diva 8.0软件分析数据。
5、本发明还公开了样本在流式细胞仪中的设门过程，具体如下：
(1)固定设门，包括依次去除黏连细胞门、活细胞门、血细胞门；
去除黏连细胞门：通过fsc
面积(area，a)/高度(height，h)可以去除粘连细胞，原理是细胞是球形，a与h成正相关。
活细胞门：一般临床检测标本常用的方法是fsc/ssc，原理是活细胞大小和颗粒性呈近正态分布，围绕一个中心聚集成团，与死细胞、凋亡细胞、碎片及背景噪音有明显界限。
血细胞门：其中，血细胞门包括淋巴细胞(lym)、单核细胞(mono)、中性粒细胞
通过cd45/ssc将各群血细胞进行大致区分，原理是根据造血细胞cd45表达荧光强度不同，其中成熟淋巴细胞＞单核细胞＞中性粒细胞＞有核红细胞，ssc大小差异，如图1所示的，中性粒细胞＞单核细胞＞成熟淋巴细胞＞有核红细胞。目的是防止在误诊或者肿瘤演化之后，漏掉大的肿瘤细胞群，以及设定内对照。
(2)多标志组合设门，与cd45/ssc设门同步进行，从淋巴细胞(lym)门开始。
在淋巴细胞门里，使用cd3/ssc设置成熟t淋巴细胞门，在cd3/ssc门内再进行以下检测：cd4+t淋巴细胞和cd8+t淋巴细胞的表达；cd3+t淋巴细胞trbc
根据观察标志组合精确锁定目的细胞：在淋巴细胞门里，使用多标志组合设门，寻找肿瘤细胞。由于多数情况下，肿瘤细胞会有cd3表达减弱或缺失，因此在多标志组合物设门时应先显示所有活细胞门，最后再选择显示所有淋巴细胞，以免漏掉特殊表型的肿瘤细胞。例如设置cd4/cd7、cd3/cd4、cd3/cd5、cd5/cd7、trbc1/cd3、cd10/pd1二维点图，需要在淋巴细胞门里圈出符合以下任意一种表型的细胞：cd3
+，此类细胞为可疑细胞。显示可疑细胞在本抗体复合物的各个抗体的表达情况，明确异常细胞是否存在异常表型和异常克隆。
异常细胞判断标准：1、异常表型：泛t标志表达强度的改变，最常见的改变为cd3表达缺失或减弱；cd7表达多变，可以表达增强、减弱或缺失，但是以缺失最为常见；cd4、cd5阳性；如果pd1强阳性，cd10阳性可以判断为aitl，如果cd10阴性，pd1强阳性，则高度怀疑。2、异常克隆：若可疑细胞trbc1单克隆性表达则为异常克隆，若trbc1不表达应结合免疫表型进行谨慎判定。若trbc1多克隆性表达则进一步排除。
具体的，若cd3强度不明显，圈出cd4+/cd7
细胞，明确cd10、pd1、trbc1、cd3的表达情况。由于aitl仅有部分病例表达tcr ab，因此若可疑细胞在trbc 1/cd3组合中为多克隆性可以排除其异常，但其不表达不能作为单克隆性的依据，此时应该结合免疫表型，看泛t标志物丢失的程度。若表达trbc 1，且其阳性率为85％～100％，不包括85％，可以判定其为单克隆性细胞，确定为异常克隆；若trbc1阳性率小于15％，可怀疑为异常克隆；若trbc1阳性率为15～85％，可以判断为多克隆表达，为正常多克隆性t淋巴细胞。由于正常骨髓中有比例不定的cd3+cd4+cd7
t淋巴细胞，这些反应性增生的t淋巴细胞会在受到其他因素刺激后比例明显升高，干扰判断，例如图1至图2所示的，cd4+cd7
细胞比例明显升高。而本发明设计的标志物组合，可以精确锁定目的细胞，通过使用trbc1排除反应性的多克隆性t淋巴细胞。
反应性情况下，如嗜酸性粒细胞升高导致的淋巴细胞改变，在做泛t标志物筛查时，可以出现cd3
cd4+的异常表型t淋巴细胞，容易误认为是肿瘤细胞，不熟悉的情况下极易误诊为t细胞淋巴瘤(t
cd4+的异常表型，其实质为嗜酸性粒细胞升高导致的淋巴细胞改变，又如图4所示的cd3
cd4+的异常表型，其实质为慢性粒细胞白血病中出现的极少量意义未明的t淋巴细胞，并非肿瘤性t淋巴细胞。
此外，由于aitl肿瘤细胞比例较低，反应性细胞数量远远高出肿瘤细胞，因此当肿瘤细胞小于0.01％的时候，所获取肿瘤细胞数应大于50个。否则需要提示临床，这是因为比例极低或者细胞数极少，结果仅供参考，建议随访。
与此同时，aitl并非100％骨髓侵犯，且结果分析受通道、细胞数、抗原分子、经验
等影响，因此当骨髓阴性时，不能直接排除aitl。
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
本实施例提供正常样本2例，反应性样本2例，aitl病例5例作为示例。其中，图1至图2为正常标本，除了常规设门，均使用cd4/cd7标志物组合圈出cd4+cd7
细胞进行免疫表型和克隆性鉴定。图3至图4均出现反应性的cd3
cd4+t淋巴细胞，可疑细胞不表达cd10和pd1
。图5至图9为aitl病例，检测出阳性结果的aitl病例，可以同时报告出异常细胞cd5的抗原平均荧光强度，且以下cd3均默认为胞膜cd3；图10为aitl患者cd5平均荧光强度统计及pd1平均荧光强度统计。
具体而言，结合图1，图2可知，对于正常骨髓标本。依次设置：fsc
a/h设置total为去黏连细胞门，得到total内为单个细胞；在total内显示fsc/ssc设置p1为活细胞门，得到p1内为单个活细胞；p1门内分别使用cd45/ssc和cd3/ssc设门。其中，cd45/ssc设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞(gran)、单核细胞(mono)、嗜酸性粒细胞(eo)细胞门；cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；使用cd4/cd7设置目的细胞门(p3)，得到目的细胞群。分别显示淋巴细胞cd3/cd4、cd3/cd5、cd5/cd7、trbc1/cd3(目的细胞)、trbc1/cd3(正常对照细胞)、pd1/cd10常用组合，将目的细胞置于顶层显示。目的细胞(cd4+cd7
)除了cd7表达丢失外，未见其他泛t抗原表达缺失，且trbc1呈多克隆性表达，pd1、cd10均未出现阳性。因此，本标本中即使出现cd7表达的丢失，也不能确定其为肿瘤细胞。
具体而言，如图3所示的骨髓样本，p1门内分别使用cd45/ssc和cd3/ssc设门。其中，cd45/ssc设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞(gran)、单核细胞(mono)、嗜酸性粒细胞(eo)；胞膜cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；淋巴细胞门出现cd3
cd4+t淋巴细胞，但pd1及cd10表达均为阴性，排除了aitl。而嗜酸性粒细胞比例偏高，临床病史无发热、淋巴结肿大及肝脾肿大，判断为hes，同时，皮肤病理结果回报为t区反应性增生，与上述判断结果保持一致。
具体而言，如图4所示的骨髓样本，p1门内分别使用cd45/ssc和胞膜cd3/ssc设门。其中，cd45/ssc设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞(gran)、单核细胞(mono)、嗜酸性粒细胞(eo)；胞膜cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；分别对cd4+cd7
cd4+t淋巴细胞圈门，进行表型和克隆性鉴定，均未出现cd10的表达及pd1的强表达。与此同时，cd4+cd7
细胞trbc1呈多克隆性表达。临床病史无发热、淋巴结肿大，遗传学及分子学检查提示费城染色体p210阳性，不支持淋巴瘤。
具体而言，如图5所示的骨髓样本，p1门内分别使用cd45/ssc和胞膜cd3/ssc设门。cd45/ssc设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞(gran)、单核细胞(mono)；胞膜cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；对cd3
+cd4+t淋巴细胞圈门，进行表型和克隆性鉴定，异常细胞表达cd3
、cd5、cd7，pd1的表达均一性增强，不表达cd10，trbc1未呈现多克隆性表达，尽管cd10表达阴性，仍提示其为异常成熟t淋巴细胞，高度怀疑为aitl。此群细胞在淋巴结样本中依然存在，病理回报为aitl。
具体而言，如图6所示的骨髓样本，患者已经通过组织病理确诊为aitl。进一步地p1门内分别使用cd45/ssc和cd3/ssc设门。cd45/ssc设置血细胞门，分别得到淋巴细胞(lym)、粒细胞(gran)、单核细胞(mono)；胞膜cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；在淋
t淋巴细胞，显示在cd3/cd5标志物组合中，出现两群细胞，在cd4+cd7
+细胞群，显示在其他组合门内，异常细胞表达cd3、cd4、cd5
，不表达cd7，此群细胞在trbc1中呈单克隆性表达，判断为骨髓累及。骨髓t细胞受体基因重排阳性，与我们的结果一致，进一步验证了我们结果的正确性。
具体而言，如图7所示的淋巴结样本，有核细胞以淋巴细胞为主。p1门内分别使用cd45/ssc和cd3/ssc设门。cd45/ssc设置血细胞门，得到淋巴细胞(lym)；cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；在淋巴细胞群内，pd1/cd10组合门内出现cd10+pd1
+淋巴细胞，显示在其他组合门内，异常细胞表达cd3、cd4、cd5、cd10、pd1
，大部分表达cd7，诊断为aitl。淋巴结活检提示aitl，与我们的结果一致，进一步验证了我们结果的正确性。
具体而言，如图8所示的骨髓样本，p1门内分别使用cd45/ssc和cd3/ssc设门。cd45/ssc设置血细胞门，得到淋巴细胞(lym)；cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；在淋巴细胞群，cd3/cd4组合门内出现cd3
cd4+t淋巴细胞，显示在其他组合门内，异常细胞表达cd4、cd5、pd1
+表型，不表达cd3、cd7，trbc1呈现单克隆性表达，判断为aitl骨髓累及。淋巴结活检提示aitl，骨髓受体基因重排阳性，与我们的结果一致，进一步验证了我们结果的正确性。
具体而言，结合图9所示的外周血样本，p1门内分别使用cd45/ssc和cd3/ssc设门。其中，cd45/ssc设置血细胞门，得到淋巴细胞(lym)；cd3/ssc设门查看cd4+及cd8+表达情况；在淋巴细胞群内，在cd3/cd4组合门内出现cd3
+cd4+t淋巴细胞，显示在其他组合门内，异常细胞表达cd3
，不表达cd10、cd7，trbc1呈单克隆性表达，判断为残留阳性。形态学及受体基因重排阳性，与我们的结果一致，进一步验证了我们结果的正确性。
具体而言，结合图10可知，aitl患者的异常细胞pd1表达呈强阳性，可以用来诊断aitl。异常细胞cd5也表达，且cd5的平均荧光强度与正常t淋巴细胞差别无统计意义，因此，cd5是合适的细胞免疫治疗靶点。
结合上述图5至图9可知，本发明设计的分子标志物一方面不仅可以明确多种泛t标志物的表达，还可以利用trbc 1明确细胞的克隆性，同时进行细胞表型和细胞克隆性的鉴定；另一方面可以通过pd1的强表达伴有或不伴cd10的表达，对t细胞淋巴瘤进行精确分型，有利于提高诊断的敏感性和特异性；此外，对细针穿刺物、脑脊液和骨髓样本仍可一次性确定肿瘤细胞的类型，即实现了微量检测，廉价监测，且不受免疫治疗的影响。尤其对无法进行组织学检查的患者，可以用于确诊；与此同时，如图5、图6、图7、图8、图9中的异常细胞cd5表达情况，结合图10可知，本发明设计的分子标志物，使用pe荧光素测定异常细胞表面cd5分子的抗原表达荧光强度，可以通过平均荧光强度和抗原表达密度对抗原表达进行相对和绝对定量检测，进而为cart细胞免疫治疗提供支持。
以上实施例仅为最佳举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。