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环状病毒感染的原因&环状病毒感染的病因
　　【病原学】　　环状病毒(orbivirus)是呼肠孤病毒科(Reaviridae)的一个属，该病毒为二十面体对称球形无包膜的RNA病毒，病毒颗粒含有双股RNA，RNA有10个不同大小的片段，每个基因片段都有专一的ORF。完整的病毒含有双屡壳，内壳古有环状病毒壳粒。病毒直径约68一80nm。根据病毒抗原性不同可分为19个血清型、150个以上的亚型。环状病毒主要包括非洲马病病毒(African horse sickness vi.rus，AHSV)、动物流行出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease，EHDV)和蓝舌病毒(bluetonguevirus.BTV)等。这些病毒具有相似的形态学和生物化学性质，但有不同的病理学性质及宿主范围。环状病毒有7个病毒结构蛋白。VPI具有RNA多聚酶活性;VP2是血清型特异性主要决定簇和中和抗原，VP2最易变异;VP3可能含有型特异性抗原表位.它是最保守的;VP4具有三磷酸核苷酶和鸟嘌呤转移酶活性;VP5与抗原变异性有关，能结合哺乳动物细胞;VP6具有鸟嘌呤转移酶活性;VP7高度保守，是主要的血清型特异性抗原，可能起宿主细胞吸附及膜穿入作用。除了VP2蛋白外.所有病毒结构蛋白均比非结构蛋白保守。通过逆转录原位PCR检测证明，病毒核酸位于有出血部位的血管内皮和组织白细胞的胞浆内。在接种病毒的培养细胞中，病毒颗粒多见于感染细胞胞浆的病毒包涵体，包涵体多忙于近核区。病毒在感染细胞胞浆中复制。BTV-NS2在病毒复制和核装配上起关键作用。牛、驴、羊均存在病毒血症，羊的BTV感染病毒血症可达11一41.3 日.而牛病毒血症可持续49日。　　环状病毒基因型变异对人类和动物致病性的影响尚不清楚。从澳大和J亚西南部新分离的Wallal病毒与过去在该国北部分离的Wallal病毒比较已发生了血清学和基因型序列变异。其他国家也发现了变异株。　　该病毒对酸和热敏感，56℃ 30分钟使病毒滴度降低2个对数，但抵抗5-脱碘氧尿苷和乙醚。　　【流行病学】　　环状病毒感染在世界上普遍存在。我国云南省的蚊、无名热病人及脑炎病人均分离到环状病毒，从西藏亚西等地区采集的蜱、鸟脑及鼠脑及从新疆、山西采集的蚊、蜱、蠓、白蛉重复地分离到环状病毒，说明我国部分地区存在自然保毒及病毒循环的客观条件。存在环状病毒感染的其他地区包括日率的南部、印度、北美洲、美国的西北部和东南部、中非、冈比亚、摩洛哥、南非的东北部、西班牙、葡萄牙南部、澳大利亚的东南部和西部、墨西哥东北部等。　　环状病毒宿主广泛，包括绵羊、山羊、野生大角羊、牛、鹿、马、斑马、驴、骡、黑熊、野生袋鼠、鸟、鼠和人。其中有的动物如驴和白尾鹿可作储存宿主。牛感染BTV多为无症状储主。牛感染BTV后1日，羊感染后3日即可检出BTV-RNA。　　该病存在隐性感染，且病毒持续时间长，具有重要流行病学意义。　　蠓(Culicoides)为传播媒介。蚊、蜱和白蛉体内也分离出病毒.也可能为传播媒介。蠓摄入病毒后病毒存在于蠓的唾液中，当叮咬宿主时可造成传播。蠓体内病毒复制受温度影响。在允许范围内温度降低，蠓寿命延长。病毒致病率下降，感染率下降。在10℃到感染后13天，所有蠓均无病毒。保持在该温度达35天的蠓然后移至允许温度达3天，感染率由0上升至15.5%。温度≤15%，AHSV不复制，但在某些蠓中可低水平存在。但温度升至允许温度，病毒复制。这也提示AHSV的越冬机制。BTV可在媒介昆虫中越冬。　　【发病机制和病理】　　病毒结构蛋白VP7是主要的血清型特异性抗原，起宿主细胞吸附及膜穿入作用。AHSV基因片段10编码非结构蛋白NS3/NS3,参与病毒从细胞释放。AHSV基因片段10的不同影响病毒从感染细胞中释放的时间。　　BTV急性感染广泛分布，但在免疫正常的动物病毒复制大受限制。除了病毒毒力因素外，免痤抑制在环状病毒感染的自然史中起一定的作用，免疫抑制的动物血内病毒量高，病毒血症持续时间长。BTV 2个外壳蛋白VP2和VP5参与活性核心进入靶细胞浆。病毒进入早期核内体，在此外壳与内核分离，BTV经历低pH诱导穿人。BTV外壳蛋白VP2一VP5足以触发细胞凋亡引起哺乳动物细胞迅速死亡。　　环状病毒不同血清型的致病性及引起疾病类型均不同。抗原分布类型研究表明环状病毒某些血清型有特殊的亲组织性。AHSV抗原主要分布在心、肺和脾，位于小血管内皮细胞、大单核细胞内。Chuzan病毒对哺乳鼠不成熟的神经细胞有亲和性，引起脑软化和脑膜炎。而waual病毒引起袋鼠的脉络膜视网膜炎。但是EHDV则引起全身多系统的损害。与BTV一11相比。感染BTV-3的动物血内病毒量高且病损严重。　　在AHSV感染，心肌血管内皮细胞感染最常见，其次为肺血管，而肝脾血管内皮细胞感染罕见。肺血管内巨噬细胞激活，释放化学炎症介质使肺微血管内中性粒细胞增加、血小板聚集、纤维素性微血栓形成及内皮细胞损害。　　接种灭活BTV的牛、接种AHSV的驴、骡均可检测到中和抗体应答。BTV感染引起血清IgE水平的增加，IgE可能参与临床疾病的发病机制。驴接种AHSV后35—60天免疫细胞显著增加，而免疫抑制的动物特异性中和抗体滴度和免疫细胞数量较免疫正常者低。羊的CTL可识别BTV的非结构蛋白NSI和结构蛋白VP2、VP3、VP5、V：P7，但羊的CTL识别类型有相当大的差别。　　EHDV感染病损是全身多系统的，包括严重水肿、充血、急性血管坏死和出血。哺乳鼠的Chuzan病毒实驻感染引起局灶性脑软化和脑膜炎症，坏死可发展至中脑、小脑及脊髓。BTV感染新生鼠使整个大脑、小脑发生坏死性病损。AHSV感染驴的尸检为浆膜腔有液体聚集。特别是腹腔，肝左韧带有瘀点和瘀斑。死后尸检表明牛感染BTV病理重于临床症状，而羊感染BTV病理和临床症状相一致。小血管内皮损伤是羊BTV感染的主要病理表现。BTV感染反刍动物主要病理改变是显著的肺水肿和肺微血管血栓。
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＞＞＞(选做题)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体..
(选做题)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：
请回答：(1)过程①代表的是_________。(2)过程②构建A基因表达载体时，必须使用_______和_______两种工具酶。(3)过程③采用的实验技术是________，获得的X是________。(4)对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的________所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行______比较；或用图中的________进行特异性结合检测。
题型：读图填空题难度：中档来源：山东省高考真题
(1)逆(反)转录(2)限制性核酸内切酶(限制酶)&&&& DNA连接酶(注：两空顺序可颠倒)(3)细胞融合&&& 杂交瘤细胞(4)A蛋白&& 核酸(基因)序列&&& 抗A蛋白的单克隆抗体
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据魔方格专家权威分析，试题“(选做题)人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体..”主要考查你对&&基因工程的基本操作程序，基因诊断与基因治疗，生物技术药物与疫苗，DNA重组技术的基本工具，单克隆抗体&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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基因工程的基本操作程序基因诊断与基因治疗生物技术药物与疫苗DNA重组技术的基本工具单克隆抗体
基因工程的基本操作程序：1、目的基因的获取（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。2、基因表达载体的构建（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图：①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。（3）基因表达载体的构建过程：3、将目的基因导入受体细胞（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（2）常用的转化方法：
（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。4、目的基因的检测和表达（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。 （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。知识点拨：1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 2、PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因。 3、基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。 4、在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。 6、植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异中的基因重组。 知识拓展：1、基因文库的构建：（1）概念①基因组文库：含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因组文库。 ②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。 （2）构建过程
2、人工合成目的基因（1）反转录法：（2）人工合成目的基因3、PCR技术扩增目的基因①原理：DNA双链复制②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。基因诊断与基因治疗：1、基因诊断技术的原理（1）基因诊断：是用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测样本上的遗传信息，从而达到检测疾病的目的。（2）基因诊断的对象主要包括病原微生物的侵入，先天遗传性疾病和后天基因突变引起的疾病等方面。目前，基因诊断已在病毒性肝炎、艾滋病等传染病的诊断中发挥了不可替代的作用。（3）通过基因诊断的方法检测其发生突变的基因，对于临床诊断、了解发病机理和疾病治疗都具有重要的意义。（4）基因诊断的应用：传统诊断遗传疾病的方法是通过表现型来推测基因型。基因诊断则是从基因着手来推断表现型，这种方法不受细胞类型和发病年龄的限制，可用于一切遗传病的诊断。如半乳糖血症是一种先天性糖代谢缺陷症，通过基因诊断，发现病人缺少一个合成半乳糖转移酶的基因。如果把半乳糖转移酶的基因转入缺乏这一基因的人体中，便可以使他的缺陷症状得到改善。2、基因治疗的发展前景（1）基因治疗：就是把特定的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。（2）基因治疗恶性肿瘤的方案有两种：①杀死肿瘤细胞——将抑制癌细胞增生的基因转入到癌细胞内，不仅可以阻断癌细胞繁殖，还可以诱导它自杀死亡；或将一段可以抑制癌基因转录的DNA序列导入癌细胞，使癌基因不能表达，癌细胞也就不能增殖。②将提高人体免疫力的基因导入免疫系统，以提高人体防御功能，由人体免疫系统杀死癌细胞。（3）基因治疗的步骤：选择治疗基因→将治疗基因和运载体结合导入到患者体内→治疗基因在细胞内正常表达。知识拓展：1、基因芯片：是将大量特定序列的DNA片段有序的固定在尼龙膜、玻片或硅片上，从而能大量、快速、平行地对DNA分子的碱基序列进行测定和定量分析。2、基因芯片的应用：用于寻找和鉴定与疾病相关的基因；用于传染病的检测。例肿瘤细胞的检测、预测老年痴呆、糖尿病，艾滋病、前列腺癌等。生物技术药物与疫苗：1、生物技术药物：（1）概念：一般是指利用DNA重组技术或其他生物技术生产的药物。（2）内容：包括基因工程药物、酶工程药物、发酵工程药物、细胞工程药物等。2、基因工程药物（1）生产过程：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。（2）例子：大肠杆菌合成人胰岛素、干扰素等。3、细胞工程药物（1）制取过程：植物细胞株→固体培养→液体悬浮培养→收集细胞→提取纯化产物→药物制剂 。（2）例子：人参、甘草、红豆杉、黄连、隐形、紫草和长春花等植物药物已经细胞培养成功；乙肝疫苗狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗等，以及干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等动物细胞培养药物。4、生物技术疫苗：指基因工程疫苗。将病原体的某个或几个抗原基因转入适当的宿主细胞进行表达，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。5、DNA疫苗的应用前景广阔。（1）DNA疫苗：又称核酸疫苗，是将致病微生物中，能够编码引起机体免疫反应的抗原基因与适当的载体结合，通过基因工程方法导入宿主细胞，并与宿主染色体整合，通过宿主细胞的转录、翻译表达出抗原，诱导宿主产生免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。（2）DNA疫苗在某些肿瘤、艾滋病和肝炎等疾病的预防上可以发挥独特的作用。知识拓展：1、基因工程药物的生产中，最主要的环节是构建工程菌，即通过转基因技术将目的基因转入细菌中，形成基因重组工程菌。利用工程菌可以高效地生产出各种高质量、低成本的药品。2、在动物细胞培养中，培养的细胞通常取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物。3、生物技术疫苗的载体不仅可以是微生物、动物细胞，还可以是动物体和植物体。目前美国已经在14个州试种了300多种“制药”作物，如生产乙型肝炎疫苗的转基因药用西红柿、香蕉等。这种转基因植物为疫苗的接种和普及提供了方便。利用生物技术不仅可以生产抗原蛋白起到疫苗的作用，还可以利用生物技术敲除病原体中的某些致病基因，获得减毒更彻底、安全性更高的减毒活疫苗，如腺病毒疫苗等。DNA重组技术的基本工具：1、基因工程的概念：
2、基本工具：（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。即&当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况：a、沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端；b、在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端（之间可以根据碱基互补配对原则重组）限制酶的切口不都是一长一短的，一长一短的叫黏性末端，一样长的叫平末端。“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。如图：（2）“分子缝合针”——DNA连接酶
&（3）“分子运输车”——载体①载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒知识点拨：1、限制酶识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。2、获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。3、获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生 4个黏性末端或平末端。 4、限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。 单克隆抗体：1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。2、单克隆抗体的制备（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞 （2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。（3）克隆化培养和抗体检测（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取 3、单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于治疗疾病和运载药物。 血清抗体与单克隆抗体的比较：
知识点拨：1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。知识拓展：制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。
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【现代科技专题】（15分）人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疫苗生产和制备的流程之一如下图：（1）过程①代表的过程是。过程②代表的过程是（2）过程③构建A基因重组载体时，必须使用、 两种工具酶。（3）过程⑥发生的生理过程是、（4）过程⑦的实验技术名称是，过程⑦依据的原理是 。需用 促进X的形成。（5）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可以从疑似患者体内分离出病毒，与已知病毒进行比较；或用图中的进行特异性结合检测。
答案:（1）逆转录 复制 （2）限制性核酸内切酶 DNA
（3）增殖、分化（4）细胞融合技术；膜的流动性 ； 灭活的病毒（5）A蛋白 ； 核酸序列（或基因序列或RNA序列或核糖序列）；抗A蛋白的单克隆【解析】试题分析：本题涉及基因工程和细胞工程的相关知识。图中从病毒开始到产生A蛋白的过程为基因工程技术，而后面则是细胞工程中的四大技术之一即生产单克隆抗体。（1）以RNA为模板合成的过程叫做逆转录。（2）构建基因的表达载体时，首先要将目的基因从DNA上剪切下来，所以要用到限制性核酸内切酶，然后将用DNA 连接酶将目的基因与外源DNA连接起来。（3）B细胞通过增殖、分化产生浆细胞和记忆细胞 ，浆细胞产生抗体。（4）将两种不同的细胞融合在一起的技术叫做细胞融合技术；两个细胞融合的基础就是膜的流动性；将动物细胞融合最常使用的方法是用灭活的病毒（5）用A蛋白做为疫苗，当疫苗进入人体后可以引起机体产生特异性免疫 ；对比两种病毒的核糖核苷酸和脱氧核苷酸序列；单克隆抗体可以特异性的和抗原发生反应。考点：本题考查基因工程和细胞工程的相关内容。点评：在高考中常把基因工程和细胞工程综合考查，这道题目很典型。其中特别需要学生注意的是基因工程的四步曲及细胞工程的四大技术。
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病毒与病毒性传染病
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