仙鹤草黄酮及三萜组分多途径干预Ⅱ型糖尿病的研究--《重庆大学》2012年硕士论文
仙鹤草黄酮及三萜组分多途径干预Ⅱ型糖尿病的研究
【摘要】：根据国际糖尿病联邦组织调查统计表明：II型糖尿病（T2DM）已经成为了继癌症，心血管病后的危害人类健康、剥夺人类生命的第三大杀手。以“整体医学”理念为指导，综合考虑T2DM及其并发症发生、发展的各种因素，寻找高效、低毒、多靶点发挥作用的药物有望成为防治T2DM及其并发症的新策略。本课题以中医传统用于T2DM治疗的中药—仙鹤草为研究对象，基于其治疗T2DM物质基础不明、作用机制不清楚的现实，借鉴“中药药效组分”和“整体医学”理念，综合采用天然药物化学、药理学、生物化学和细胞生物学等多学科的理论和技术，以氧化应激、а-葡萄糖苷酶活性和胰岛素抵抗为靶点，研究阐明仙鹤草干预T2DM的药效组分的物质基础，并初步探讨其活性组分多途径干预T2DM的药理活性和作用机制。主要工作和结论如下：
⑴采用现代分离技术，建立仙鹤草的黄酮组分（FC）和三萜组分（TC）的分离制备工艺，利用分光光度法测定两个活性组分的总黄酮和总三萜含量，采用HPLC技术，对其活性组分的主要物质基础进行定位和表征。①采用硅胶柱和LH20分离柱，建立了仙鹤草的FC和TC的分离制备工艺；②分光光度法测得仙鹤草的FC总黄酮含量为316.53±6.37mg/g，TC的总三萜含量为415.97±5.15mg/g；③通过HPLC对其活性组分进行物质表征定位，发现FC中含有槲皮苷、银椴苷、杜荆苷、异杜荆苷、金丝桃苷、木犀草素、芦丁、芹菜素、山奈酚、花旗松素、儿茶素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷等；TC中含有熊果酸、4-羟基熊果酸、科罗羧酸、马斯里酸和齐墩果酸等；④对FC和TC中的单体的种类和各自的相对百分含量与仙鹤草95%和50%乙醇提取物进行了比较，结果表明该分离制备工艺基本能比较完整的保留仙鹤草全草提取物中的黄酮类和三萜类物质群。
⑵采用DPPH体系、H_2O_2-Fe~(2+)体系、ABTs+·体系和β-胡萝卜素/亚油酸体系，系统研究了仙鹤草FC和TC的清除自由和抗脂质过氧化的活性。①FC对DPPH、 OH和ABTs+·均具有较强的清除活性，其半数清除浓度（EC_(50)）分别为：7.73、3.64和5.90μg/mL；TC的自由基清除活性较弱，EC_(50)分别为：100、35.18和100μg/mL；阳性对照对此3种自由基的EC_(50)分别为：7.69、3.14和2.54μg/mL；②F C和TC具有一定的抗脂质过氧化的活性，二者抑制β-胡萝卜素淬灭的半数抑制浓度（IC_(50)）分别为41.77和98.54μg/mL，活性小于阳性对照BHT（IC_(50)=1.84μg/mL），差异显著（p0.05）。
⑶对FC和TC活性组分抑制а-葡萄糖苷酶活性和其酶动力学进行了评价。①FC和TC具有较强的а-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC_(50)分别为3.67和8.72μg/mL；②仙鹤草FC和TC配比为4:1、1:4和1:1时，配比组分均具有较好的а-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC_(50)分别为3.93、10.39和9.39μg/mL，仙鹤草中FC和TC的自然配比（4:1）具有更强的抑制а-葡萄糖苷酶的活性；③酶动力学研究表明FC为竞争性抑制剂，TC为非竞争性抑制剂，可以初步验证，仙鹤草FC和TC对а-葡萄糖苷酶的活性具有协同增效的抑制作用。
⑷以3T3-L1为模型，通过对细胞分化形态，三酰甘油含量和影响分化相关的因子的基因表达的检测，探讨了FC和TC两个活性组分对前脂肪细胞分化的影响。①从FC和TC对前脂肪细胞分化的形态和三酰甘油含量的累积的影响可以看出，TC比FC处理下生成的脂滴体积较大，且具有更强的促进胞内三酰甘油的累积的作用；②仙鹤草FC和TC的两个活性组分在一定的浓度范围内具有明显的促进PPARγ、Cebp-а、SREBP-1激活表达，且FC具有与阳性对照相当的较强地促进PPARγ表达的活性；FC和TC对于下游的促进脂肪过度累积和大脂滴形成的调控基因（AP2）和游离脂肪酸形成的调控基因（LPL）具有比阳性对照更好的抑制调控作用；而对于GLUT4和Adiponectin的表达在浓度达到一定的范围时，具有很好的增效作用。因此，可以初步的推论仙鹤草的活性组分是通过选择性地调控和激活PPARγ的表达，这有别于传统的激动剂的完全激活的形式，在对外周胰岛素敏感性进行改善的同时能相对的减少胞内大量脂肪滴累积造成的副作用，同时能避免了游离脂肪酸的形成而进一步造成胰岛素抵抗的危害；③根据配比复合组分结果分析，仙鹤草的FC和TC自然配比（4:1）物质基础在功效配比上具有较好的优势。
【关键词】：
【学位授予单位】：重庆大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：TQ461;R285【目录】：
摘要3-5ABSTRACT5-11缩略词11-121 绪论12-16 1.1 问题的提出和研究意义12-13 1.2 研究目的和研究内容13-15
1.2.1 研究目的13-14
1.2.2 研究内容14-15 1.3 技术路线15-162 仙鹤草 FC 和 TC 提取工艺和物质表征研究16-30 2.1 引言16 2.2 实验材料与方法16-20
2.2.1 实验材料16
2.2.2 仪器16
2.2.3 实验方法16-20 2.3 实验结果与讨论20-27
2.3.1 薄层显色合并20-21
2.3.2 仙鹤草 FC 总黄酮和 TC 三萜含量测定21-22
2.3.3 仙鹤草 FC 总黄酮和 TC 的 HPLC 物质表征22-27 2.4 小结27-303 仙鹤草 FC 和 TC 抗氧化活性检测30-38 3.1 引言30 3.2 实验材料与方法30-32
3.2.1 实验材料30
3.2.2 试剂30
3.2.3 实验仪器30-31
3.2.4 实验方法31-32 3.3 结果与讨论32-36
3.3.1 仙鹤草 FC 和 TC 清除 DPPH·的能力检测32-33
3.3.2 仙鹤草 FC 和 TC 清除·OH 的能力检测33-34
3.3.3 仙鹤草 FC 和 TC 清除 ABTS 的能力检测34-35
3.3.4 仙鹤草 FC 和 TC 抗脂质过氧化的能力检测35-36 3.4 小结36-384 仙鹤草 FC 和 TC 抑制 a-葡萄糖酶活性检测38-44 4.1 引言38 4.2 材料和仪器38-39
4.2.1 材料38
4.2.2 试剂38
4.2.3 仪器38-39 4.3 实验方法39
4.3.1 а-葡萄糖苷酶活性测定39
4.3.2 а-葡萄糖苷酶动力学检测39 4.4 实验结果与讨论39-42
4.4.1 а-葡萄糖苷酶活性39-41
4.4.2 а-葡萄糖苷酶动力学41-42 4.5 小结42-445 仙鹤草 FC 和 TC 对 3T3-L1 细胞分化的影响44-68 5.1 引言44-45 5.2 材料和仪器45
5.2.1 材料45
5.2.2 试剂45
5.2.3 仪器45 5.3 溶液的配制45-46 5.4 实验方法46-50
5.4.1 3T3-L1 前脂肪细胞的培养46
5.4.2 3T3-L1 前脂肪细胞增殖活力的检测46-47
5.4.3 3T3-L1 前脂肪细胞的分化诱导和药物处理47
5.4.4 3T3-L1 前脂肪细胞油红染色47-48
5.4.5 3T3-L1 前脂肪细胞三酰甘油含量的测定48
5.4.6 3T3-L1 前脂肪细胞的 mRNA 的提取48-49
5.4.7 荧光定量 PCR49-50 5.5 实验结果与讨论50-64
5.5.1 仙鹤草 FC 和 TC 对 3T3-L1 增殖活力的检测50-52
5.5.2 仙鹤草 FC 和 TC 对细胞分化形态的影响52-54
5.5.3 仙鹤草 FC 和 TC 对脂肪细胞分化的三酰甘油含量的检测54-57
5.5.4 仙鹤草 FC 和 TC 对脂肪细胞分化的相关基因表达的检测57-61
5.5.5 仙鹤草 FC 和 TC 不同配比组分对脂肪细胞分化的相关基因表达的检测61-64 5.6 小结64-686 主要结论及后续工作展望68-72 6.1 主要结论68-71 6.2 展望71-727 文献综述72-80 7.1 T2DM 的发病机制和治疗手段72-75
7.1.1 目前 T2DM 的严峻形势72
7.1.2 T2DM 的发病机制72-73
7.1.3 T2DM 目前的主要的治疗手段73-75 7.2 目前 T2DM 药物的主要的筛选模型和靶标75-77 7.3 天然药物干预 T2DM 的作用机制和研究进展77-78 7.4 结论78-80致谢80-82参考文献82-94附录94 A. 作者在攻读硕士期间科研成果94 B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目情况94
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仙鹤草和老鹳草的区别，跪求！！速速！！
临床的时候还有什么具体的不同呢
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提问者采纳
一般以仙鹤草较为常用，结果用错。尚可用于疮疖痈肿。功效祛风通络,并附上问题的连接。性味苦，大量可用至30～60g，为植物老鹳草等的全草，在临床由于有些医生在用老鹳草时，止痢。用法为水煎服，又名龙芽草。临床应用于多种出血证，将老鹳草错写成“老鹤草”，在配伍清热解毒药的条件下。用法为水煎服，拘挛麻木，平，在临床用于湿热泻痢或痈疮肿毒时。然而、脱力草等、涩，清热解毒，仙鹤草与老鹳草为两种不同的中药、痔疮肿痛，用量10～15g；泻痢。功效收敛止血，无论寒热虚实均可配伍应用。但是、老官草等，补虚。临床应用于风湿痹痛、辛；脱力劳伤及疟疾等；痈疽肿毒等，杀虫；跌打瘀肿疼痛，用量5～15g。还用于泻痢，以致配药人员常误以为是用仙鹤草。老鹳草始载于《本草纲目拾遗》,请发消息给我，又名五叶草，为蔷薇科植物龙芽草的全草，平，活血止痛，两药还是可以相互替代的。如果您还有什么不满意的仙鹤草与老鹳草的功用区别仙鹤草始载于《伪药条辨》。性味苦
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杏林医话汇编
仙鹤草妙用十则(转载)
摘自《石恩骏方药经验集》仙鹤草原名龙芽草，因在夏天开黄色小花，故又称金顶龙芽，俗称脱力草、石打穿、泻痢草等，属于蔷薇科多年生草本植物，全国大部分温暖地区都有出产，以全草入药，性平，味苦、涩，归肺、肝、脾三经，功效较多，临床运用较广，若能灵活掌握，多收满意疗效。（一）血证仙鹤草苦涩性平，有收敛止血之功，其所含仙鹤草素能缩短凝血时间，使血小板计数增加，为止血之圣药，无论寒热虚实皆可运用。如咯血，石教授每以本品30—50g，加水一大碗，浓煎频服，出血立止。青少年鼻衄，则常以本品30g、 玄参10g、茯苓10g、山药10g、白茅根15g、藕节15g、生地15g、牛膝10g、地骨皮15g、天花粉10g、甘草6g，水煎服，每日1剂，屡收佳效。消化道大出血，常以本品30g配伍归脾汤，疗效独特。曾治一消化性溃疡所致大出血者，共输血约3000ml，用洛赛克、立止血、垂体后叶素、云南白药等治疗，未见效，加上方1剂后出血停止，转危为安。血尿则常以本品30g，结合辨证汤药，取效较捷。血小板减少性紫癜更以本品30g，伍以生地、玄参、制首乌、女贞子、旱莲草、三七、连翘、紫河车等，随证加减，常可根治。（二）痢疾、《滇南本草》云其治“赤白血痢”，吾师石恩骏教授恒以本品30g配伍葛根芩连汤、芍药汤等治疗急慢性、急慢性痢疾，均疗效较好。一般认为本品有收涩之性，治疗慢性泻痢者为宜，其实不然，因其本身有解毒消肿之功，急性者用之，亦无闭门留寇之弊，可放心使用。[病案举例]陈某某，男，18岁，学生。发热，腹痛，里急后重，脓血便2日，小便短赤，苔腻微黄，脉滑数。大便镜检可见大量脓细胞及红细胞，此湿热痢，当清热解毒，调气行血为治。处方为：仙鹤草30g，白芍15g，黄连5g，黄芩9g，金银花15g，生大黄9g，木香6g（后下），枳壳9g，甘草5g，水煎服，每日1剂。连进3剂，诸症显减，继服2剂即愈。（三）各种类型心脏病《现代实用中药》谓仙鹤草“为强壮性收敛止血剂，兼有强心作用”。《施金墨对药》一书亦有“仙鹤草伍阿胶，善治各种心脏病变”的经验记载，认为阿胶以补血养心为主，仙鹤草以强心、调整心律为要，凡心脏病变有心阴不足见症者用之最宜。笔者试将其运用于临床，亦取得可喜之疗效。[病案举例]金某，男，35岁，机关干部。发病6载余，多在劳累及情绪紧张时出现阵发性心悸，多次住院治疗，均诊断为“阵发性室上性心动过速”，经用异博定及参松养心胶囊等治疗，均不能根治。某省城大医院建议手术治疗，因惧怕手术，故特邀余用中医治疗，以冀转机，目前患者心悸，胸闷，气短，口干，盗汗，睡眠欠佳，舌红苔少，脉细数而促。此系心阴不足之证，当养阴益气，宁心安神为治。处方为：仙鹤草30g，阿胶12g（烊化），人参10g（另煎兑入），麦冬 15g，五味子10g，玉竹15g，柏子仁15g，丹参15g，苦参15g，茯神30g，炙甘草10g，水煎服，每日1剂。上方连进3剂，心悸，胸闷，气短，口干减轻，盗汗、睡眠如前。继以上方加浮小麦30g，夜交藤30g，5剂后，上症基本消失。为求彻底治愈，遂予柏子养心丸、苦参碱片作善后巩固，经随访已痊愈。（四）自汗、盗汗自汗、盗汗系阴阳失调，腠理不固，营养失和所致，一般认为自汗多属阳虚，盗汗多为阴虚，然均以腠理不固，津液外泄为共同病机，因仙鹤草有良好的收敛固涩作用，故自汗、盗汗均可运用。一般病例仅以本品30-50g，大枣10-20枚煎服即可治愈。顽固病例，当结合辨证方药为妥。如阴虚者伍当归六黄汤、麦味地黄丸加减；气虚者伍补中益气汤加减；营卫不和者伍桂技汤加减；邪热郁蒸者伍龙胆泻肝汤加减等。[病案举例]陈某某，女，38岁，护士。盗汗10年，中西医屡治乏效 ，求余诊治。刻治：夜寐盗汗，醒时如浴，五心烦热，口渴，消瘦，舌红少苔，脉细数，此阴虚& 旺证也，当滋阴降火，敛汗固表为治，予仙鹤草伍当归六黄汤加减。处方为：仙鹤草30g，大枣10枚，当归12g，生熟地各12g，黄连3g，黄芩10g，黄柏10g，黄芪18g，煅龙牡各30g（先煎），浮小麦30g，麻黄根10g，水煎服，每日1剂。连服5剂，盗汗减少，继服4剂而愈。（五）久咳吾地民间习用本品30-50g水煎服，治疗久咳不已，取得较好效果，一般认为与本品具补虚收涩之功有关。盖气虚正亏，正不胜邪，余邪不清，则久咳不已；而久咳不已则又耗气伤正，肺脾气虚，津液凝聚，痰湿内生，肺失宣肃，导致咳嗽更重。仙鹤草补虚有“赛人参”之誉，兼有收涩之力，扶正而祛邪，收涩而镇咳，用治上证，颇为合拍，则久咳当愈。（六）腰痛腰痛是指腰部感受外邪或因外伤，肾虚而引起的气血运行失调，脉络绌急，腰府失养所致的以腰部一侧或两侧疼痛为主要症状的一类病证，临床多以补肾强腰、祛邪活血为治。考仙鹤草一药，本身有良好的补虚强壮作用，且《滇南本草》称其可治“腰痛”。《百草镜》谓其能“下气活血”。《本草纲目拾遗》言其可疗“闪挫”。《植物名实图考》云其“治风痰腰痛”。现代药理学亦研究证实，本品有显著的抗炎、镇痛效果，故时医用治腰痛，每有选用本品者。[病案举例]任某某，男，52岁，教师。反复腰痛2年余，近因劳累过度而腰痛发作加剧，不能俯仰转侧，右下肢麻木，脉沉细，舌红苔黄腻。CT示：腰椎间盘脱出症。此肾虚督损，经络瘀滞之证，当补肾壮督，活血化瘀，通络止痛为治。处方为：仙鹤草30g，熟地20g，桂枝10g，赤白芍各12g，骨碎补15g，当归12g，元胡30g，细辛6g，地龙12g，牛膝12g，制马钱子0.6g（分冲），制川草药各8g（先煎），甘草6g，水煎服，每日1剂。上方连进6剂，诸症大减，继服10剂，其病若失。嘱其注意功能锻炼，避免剧烈运动和重体力劳动，随访2年，未见复发。（七）流行性腮腺炎该病即中医之“痄腮”，属一种传染性疾病。以学龄儿童较易感染，四季均可发病，然以冬春两季为多见。该病以耳垂为中心的腮腺肿胀为其临床特征，一般认为风邪外乘，湿热内蕴，毒壅少阳是引起该病的重要原因，故治疗多以清肝利胆，祛风解毒，软坚消肿为法。仙鹤草一药，《本草求原》云其能“消肿”。《湖南药物志》谓其可“祛风散寒，解热，祛湿”。临证时笔者每以仙鹤草入药，伍以龙胆草、黄芩、大青叶、蒲公英、柴胡、僵蚕、蝉衣、夏枯草、甘草、随证加减，常1-2剂收显效。此外，鲜仙鹤草捣烂配陈醋少许外敷患处，则疗效更著。[病案举例]黄某某，男，8岁，学生。高热，两腮肿痛3天，咀嚼困难，神昏嗜睡，舌红苔黄，脉滑数。此乃痄腮，为风邪外乘，湿热内蕴，毒壅少阳所致，宜清利肝胆，祛风解毒，软坚消肿为治。处方为：仙鹤草30g，龙胆草9g，黄芩9g，大青叶15g，蒲公英15g，柴胡6g，僵蚕9g，蝉衣6g，夏枯草12g，甘草3g，水煎服，每日1剂。外用鲜仙鹤草捣烂配陈醋少许外敷患处，24小时换药1次，上方治疗3日，患儿症除病瘥。（八）《滇南本草》称其“治妇人月经或前或后，赤白带下”。吾师石恩骏教授每以本品30g炒炭，配伍藕节15g，乌贼骨30g，治疗经间期出血、崩漏；月经先期、后期或先后不定期则需结合中医辨证为妥。此外，对老妇行经，配伍旱莲草30g，女贞子15g，煅龙牡各30g（先煎），鹿衔草15g，大枣10枚等治疗，亦有佳效。对带下病，无论赤带、白带，均可选用。（九）巨幼细胞贫血该病系叶酸、维生素B12缺乏或其他原因引起DNA合成障碍所致的一类贫血。起病缓慢，以贫血、消化道症状和神经系统症状等为临床特征。现代医学除重视消除或纠正致病原因外，主要治疗方法是补充足够所缺乏的维生素--叶酸或B12。中医将其归为“虚劳”范畴，系脾肾两亏，精血不足所致，治疗以补肾填髓，健脾养血为主。仙鹤草一药，具补虚强壮作用，《文堂集验方》即有“龙芽草六钱，红枣五枚，水煎服”治虚损的记载，吾师石恩骏教授临证时每以本品入药，伍以人参、黄芪、紫河车、白术、鹿角胶、鸡血藤、连翘、熟地、附片等品，治验较多。[病案举例]罗某某，男，53岁，农民。2年前在省城某大医院确诊为“重度巨幼细胞贫血”，经补充维生素、多次输血等治疗，均不能治愈，求治于余。刻诊：面色萎黄，倦怠乏力，心悸气促，头晕耳鸣，食欲不振，四肢无力，舌淡苔白，脉细缓，此为虚劳证，乃脾肾两亏、精血不足所致，宜补肾填精，健脾养血为治。处方为：仙鹤草30g，人参10g（另煎兑入）， 炙黄芪30g，紫河车9g，白术15g，砂仁5g（后下），鹿角胶12g（烊化），鸡血藤25g，山药30g，制首乌15g，制附片5g，连翘15g，熟地20g，甘草6g，水煎服，每日1剂。上方连进10剂，诸症明显好转。为求彻底治愈，即改为丸剂缓投。丸方为：仙鹤草150g，人参150g，黄芪150g，紫河车150g，白术150g，砂仁80g，鹿角胶150g，鸡血藤150g，山药300g，制首乌150g，三七150g，当归150g，升麻80g，陈皮80g，麦冬150g，五味子 150g，甘草80g，制附片150g，连翘150g，共研末，炼蜜为丸，1日3次，每次服9g，服药3个月后，诸症悉除。嘱继服丸方3个月后即可停药，后经多次随访，已彻底康复。（十）癌肿“癌”之名称，始见于宋代《卫济宝书》，其发病原因多为外感邪毒，七情郁结，饮食起居失常，致脏腑气血失调或痰湿瘀毒等积聚而成，临床一般以清热解毒，培正固本，活血化瘀等综合疗法为治，亦有取效者。仙鹤草一药，有强壮补虚，清热解毒之功，已为患者共知，此外，尚具活血之力，如《百草镜》云其可“下气活血”，此一药之效，能囊括抗癌诸法于其中者，确不可多见矣！故时医治癌肿每有选用本品者。同时，现代医学亦研究证实，仙鹤草提取液对癌细胞有显著的抑制作用，此外，还能增加白细胞的数量，提高机体的免疫力。日本《汉方研究》亦认为：传统的化疗药既杀伤癌细胞也杀伤正常细胞，而仙鹤草既可杀伤癌细胞，又有利于正常细胞，实属一种罕见的抗癌中药。由此可见，仙鹤草的抗癌作用中西药理均甚相吻合，值得进一步发掘。&
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