抗生素6270及其盐类作为一种抗球虫病剂和饲料添加剂的应用的制作方法
专利名称抗生素6270及其盐类作为一种抗球虫病剂和饲料添加剂的应用的制作方法
技术领域本发明是一种新的抗生素6270及其制备方法，以及它作为一种抗球虫病剂或作为一种加速家畜或家禽生长的饲料添加剂的应用。
为了寻找新的抗生素和研究那些由所分离的微生物产生的抗生素起见，本发明者已经从各种土壤中分离了许多微生物。因此，他们已经发现一个合适的培养基中从日本北海道，网走市(Abashiri)采集的土壤中分离出的属于拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)属的微生物时，在培养基中就积累了一种对革兰氏阳性细菌具有高度抗菌活性的抗生素。该抗生素得到了分离且理化性质及生物学特性得到了检验，从而已作为一种新的抗生素得到进一步证实被命名为抗生素6270。
本发明是以这个发现为基础的，并提供这种新的抗生素6270及其制备方法，该方法包括培养属于拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)属的产生抗生素6270的微生物和从培养物中分离抗生素6270。
此外，本发明提供一种含有作为活性成分的抗生素6270的抗球虫病剂，和一种防治家畜和家禽球虫病的方法，该方法包括给家畜和家禽吃有效的抗生素6270。
另外，本发明提供一种家畜和家禽的生长加速和饲料功效增强剂，其含有作为活性成分的抗生素6270，并提供一种加速家畜和家禽生长及增强其饲料功效的方法，该方法包括给家畜和家禽吃有效数量的抗生素6270。因此，本发明提供一种家畜和家禽的饲料，这种饲料含有有效数量的抗生素6270。在这方面的有效数量通常是从0.5到200ppm，从1到100ppm则更好。
现在，将详细叙述本发明并给出最佳实施例。
在附图中，附图说明
图1是用溴化钾压片法测定的抗生素6270的红外吸收光谱。
图2是在重质氯仿中通过用四甲基硅烷作为内标准所测定的抗生素6270的1H-核磁共振光谱。
图3是在重质氯仿中通过用四甲基硅烷作为内标准所测定的抗生素6270的13C-核磁共振波谱。
可用来生产抗生素6270的微生物可能是属于诺卡氏菌(Nocardiopsis)属的任何微生物，只要它能够产生抗生素6270。不过，最好选用由本发明者重新分离的拟诺卡氏放线菌(Nocardiopsis)种的6270品系(作为FERMBP-717被存放在日本的发酵研究所里)。该微生物已于日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCCNo.0021。
在本发明中所用的拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)种的6270品系具有分支的菌丝体，并在空气中延伸的气生菌丝被分裂而形成长的孢子链。从整个细胞的水解产物中，内消旋-二氨基庚二酸(mcsodiaminopimericacid)和作为糖成分的半乳糖和核糖被发现了。然而，阿拉伯糖和madurose未被发现。此外，也没发现霉菌酸。维生素K2类合成物含有作为主要成分的MK-9(H6)和(H3)并且发现了作为痕量成分的MK-9(H4)。基内菌丝的宽度约为0.5微米。根据前述的特性，确定6270菌株是一种属于放线菌中拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)属的菌株。
拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)种6270菌株具有下列微生物学特性。
Ⅰ.形态学特征基内菌丝充分生长并分裂，从而每个菌丝的宽度约为0.4微米。在某些培养基，例如蔗糖-硝酸盐琼脂培养基(Difco.Czapeck溶液琼脂)，淀粉琼脂培养基(ISP-4Difco-无机盐淀粉琼脂)燕麦片琼脂培养基(ISP-8)或葡萄糖一天冬酰胺琼脂培养基中，气生菌丝充分地生长。气生菌丝或直或弯，并且作为一个整体来看，它们构成网状。成熟时，气生菌丝的宽度从0.4到0.6微米。从培养开始到结束的10天中，气生菌丝经过分裂并形成许多长的孢子链，每一孢子链至少含有10个孢子。孢子链不是螺旋形的，孢子的表面是光滑的且形状是圆筒形的。其大小约为0.4×1.2微米。未观察到孢子囊，菌核或菌丝束。
Ⅱ.培养特点按照E.B.Shirling等人所报道的试验方法(系统细菌学国际杂志，16，313-340(1966)进行了试验。另外，使用了已知的培养基和试验方法。
使用颜色调和手册，第4版(1958)作为颜色标准在氙灯的标准光源下测定了颜色。当看到相应的颜色标记时，它首先通过普通的名称显示出来，然后在圆括号中显示出颜色标记的代号。当同样的颜色重复出现时，就只显示出颜色标记的代号。
除另有规定外，下列资料表示在一个琼脂平板基上，在280℃下培养三个星期的生长状况。(a)项表示生长;(b)项表示气生菌丝的状态;(c)项表示一种可溶色素;(d)项表示其他特性。
(1)蔗糖-硝酸盐培养基(Difco-Czapeck溶液琼脂)a良好，接近灰色(2ba)b白色，粉状的c无(2)葡萄糖-天冬酰胺培养基a良好，淡琥珀色(3ic)到米色(3ge)b接近灰色(3ba)c无(3)甘油-天冬酰胺培养基a不好，2bab细长形c无(4)淀粉琼脂培养基a极好，3ic到贡岩(3ca)b粉状的，白色c无
d淀粉的水解，阴性(5)酪氨酸琼脂培养基a不好，3geb无c无(6)营养琼脂培养基(Difco.Bacto营养琼脂)a不好，淡白色(2ea)b无c无(7)酵母-麦芽提取物琼脂培养基a极好，裂缝，黄玉色(3ne)b白色c无(8)燕麦片培养基a良好，剥落的(2ca)b2bac无Ⅲ.生理学特点(1)生长温度范围(斜面淀粉琼脂培养基，温度梯度细菌培养器)6.5-38℃(在5℃以下或39.5℃以上未观察到生长)最适温度27℃-38℃。
(2)葡萄糖-蛋白胨-明胶的液化穿刺培养阳性。
(3)淀粉的水解物阴性(4)凝固蛋白胨化脱脂乳没有凝固和显著的蛋白胨化(37℃)。
(5)黑色素的形成ISP-酪氨酸琼脂培养基阴性。
ISP-triptone-酵母提取物肉汤培养基阴性。
ISP-蛋白胨-酵母-铁琼脂培养基阴性。
(6)氯化钠耐受性在4%或更高的浓度下不生长。
(7)黄嘌呤次黄嘌呤，腺嘌呤的溶解度阴性。
Ⅵ.碳源利用(Pridham和Gettlieb基础培养基)阳性D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，水杨苷。
弱阳性D-果糖，蔗糖。
阴性肌醇，L-鼠李糖，棉子糖，D-甘露醇。
已经鉴定6270菌株是属于放线菌中(Noeardiopsis)Meyer1076的一种菌株，因为在上述的各种特点中，它在气生菌丝上形成长的孢子链，并且整个细胞的水解产物含有内消旋-二氨基庚二酸(meso-diamiaepimericaeid)和半乳糖，但不含阿拉伯糖和madurose，此外未发现霉菌酸。
在实现本发明的过程中，产生抗生性6270的微生物可按照培养已知放线菌的常规方法进行培养。然而，从工业观点看，使用通气-搅动的培养方法是有利的。作为生产用的培养基，可使用通常用于放线菌培养的物质。即，各种碳源，氮源和有机或无机盐，如果必要的话还有消沫剂，可用适宜的合成形式。例如，作为碳源，可使用葡萄糖，淀粉，甘油，糊精，蔗糖以及动物或植物油。作为氮源，可使用黄豆粉，玉米浆、麦芽，和氨。此外，若有必要，可加入象碳酸钙，氯化钠，氯化钾，和磷酸盐这样的无机盐。也可加入那些具有促进微生物生长，从而促进抗生菌6270产生的有机或无机盐。培养温度通常在25到30℃范围内，最好在30℃左右。培养时间依条件的不同而不同。然而，所产生的抗菌素6270，通常在72到148小时之内到到最大积累值。
抗生素6270可以从培养基中分离，并利用其理化特性，通过常规的方法，如利用杂质溶解度不同的方法，利用对离子交换树脂或各种吸收剂的吸收作用不同的方法，用一种与水不相溶的有机溶剂萃取的方法或象沉淀、杂质的去除、透析、干燥和重结晶等各种方法的适当结合加以提纯。
例如，培养基里的抗生素6270可以按下述方法回收。当加入助滤剂如硅藻土或Radiolite700后，肉汁培养基被过波，滤液和微生物细胞分别被适当的溶剂，如乙酸乙脂和丙酮所萃取。然后将细胞萃取物与滤液萃取物合并。将溶剂从该萃取溶液中蒸馏出来，借此得到抗生素6270的粗晶体。为了从粗晶体中分离出抗生素6270，举例来说，粗晶体应用色层析分离法处理。洗脱液减压浓缩，残渣溶于适当的诸如乙酸乙脂溶剂，流后用稀盐酸处理。浓缩溶剂层，抗生素6270以游离酸状态(形式)结晶出来。
为了得到它的钠盐，上述用稀盐酸处理过的溶剂层用稀的碳酸钠溶液处理，然后浓缩溶剂层，由此可得到钠盐形式的抗生素6270。这样获得的游离酸型或钠盐型抗生素6270可从一适当的溶剂如正-己烷-乙酸乙酯中重结晶而获得纯晶体。这样得到的游离酸型抗生素6270具有下列特性。
(1)无色针状结晶，酸性物质。
(2)熔点115-118℃(3)元素分析(以%表示)c(碳)62.72%，H(氢)9.49%O(氧)27.78%(4)所旋光度〔a〕20D-11.5°(厚度1.0，甲醇)(5)紫外吸收光谱于甲醇溶液中测得，最大吸收波段不高于210nm(纳米)(6)红外吸收光谱中的特异吸收(厘米-1)(用溴化钾压片法)，，，，，，980，(吸收光谱示于图1)(7)溶解性溶于甲醇、乙醇，乙酸乙脂，氯仿，醚，丙酮，以及苯等不溶于水。
(8)颜色反应硫酸香草醛反应及Dragenderff反应为阳性;茚三酮反应阴性，与碘蒸汽反应显色。
(9)薄层层析(用硅胶GF245，Merck公司制造)溶剂系统RF值氯仿-甲醇(20∶1)0.49溶剂系统RF值正-己烷-乙酸乙脂(1∶1)0.08
苯-乙酸乙脂(1∶1)0.04苯-丙酮(1∶1)0.53氯仿-丙酮(2∶1)0.36正-己烷-乙酸乙酯(1∶3)0.13乙酸乙酯0.22(10)1H-核磁共振波谱在δppm3.39(3H)，3.49(6H)处观测到三个甲氧基的存在，在重质氯仿中用甲基硅烷做内标准于100MHz处测得。
(波谱示于图2)(11)13C-核磁共振波谱在重质氯仿中用四甲基硅烷做内标准于25MHz处测得的结果示于图3。按照这个结果，碳原子的全部数量为44个。
(12)抗菌谱示于表1(见下页)。
注a营养琼脂培养基。
b甘油琼脂培养基c土豆-蔗糖琼脂培养基表1试验微生物最低抑制浓度培养基mcg/ml夜后草杆菌(Bacillus
aIMA－1729)球状杆菌(Bacilluscircu-lans
3329)枯草杆菌(Bacillus
aPCI219)黄微球菌
(Micrococcus
flavus1.56
aIFO3242)藤黄八叠球菌(NIHJ)3.13a金黄色葡萄球菌(Staphylococcus6.25
PJC-1)金黄色葡萄球菌(Staphglococcus6.25
aaureus)(抗青霉素链霉素，氯霉素，四环素及卡那霉素)大肠杆菌(Eseherichiacoli&100aNIHJ
JC-2)大肠杆菌(Eseherichiacoli
)&100a(抗链霉素，卡那霉素，氯霉素和四环素)肺炎杆菌(Klebsiclla
pneu-moniae
表1(续)试验微生物
最低抑制浓度培养基(mcg/ml)普通变形杆菌(Proteusvul-gasis&100aOX-19)绿脓杆菌(Pseudomonas
ae-ruginosa
aIFO-3756)包皮垢分支杆菌(Mycoba-cterium1.56
bsmegmatisATGG
607鸟型结核分支杆菌(Mycobacte-rium1.56
3153)草分支杆菌(Mycobacterium
bNIHJ)产黄青霉(Penicillium
chry-sogenum
cQ－176)黄曲霉(Aspergillusflavus)
9643)(Gochliobolus
miyab-eanus)12.5c(Alternaria
c白色念珠菌(Gandida
albic-ans&100
表1(续)试验微生物
最低抑制浓度培养基(mcg/ml)啤酒酵母(Sacehasomycescerevisiae&100
按照上述理化和生物学特征，这种抗生素已被确定属于一类叫做聚醚的抗生素。
由1H-核磁共振波谱已知，该抗生素在一个分子中有三个甲氧基团。作为已知的在一分子中有三个甲氧基的抗生素，在聚醚类抗生素中被提到有C2012(日本未审查专利公告53919号，1983)，A-204B(微生物手册，410，第三卷，CRC出版)，T-42082(日本未审查专利公告79730号，1976)，T-40517(日本未审查专利公告10581号，1975)，38295(日本未审查专利公告125793号，1976)，6016号(日本未审查专利公告84576号，1979)，X-14868C(日本未审查专利公告120696号，1981)CP-47433(日本未审查专利公告154108号，1982)，47434(日本未审查专利公告154187号，1982)，以及LL-C23024β(日本未审查专利公告78598号，1983)。
然而，抗生素6270在熔点，比旋光度，元素分析值或红外吸收光谱上与已知抗生素不同，显然是一种新的抗生素。
抗生素6270对革兰氏阳性菌有极强的抗性，可作为抗菌剂使用。
此外，作为一种治疗家畜腹泻，增强饲料功率以及促进家畜和家禽生长的药剂，在低浓度下它具有抗球虫病杀螨及抗病毒等活性，并作为家禽和家畜的抗球虫病剂用于鸡、鹌鹑、鸭、鹅和火鸡，以及牛、猪、兔、水牛、山羊和绵羊等。
现在，本发明将根据实施例进一步描述其细节。但应该理解本发明决不仅限于这些具体实例。
例1拟诺卡氏菌(Nocardiepsis)6270菌株(FERMBP-717)接种于一升含有6.0%的葡萄糖，2.0%黄豆粉，1.0%串珠酵母，0.5%碳酸钙的培养基中(PH6.0)，于30℃培养48小时。该培养液接种在一个具有200升容量的罐中的100升含有同上组份的培养基中，在搅拌、通风下于30℃培养96小时，通风率为每分钟100升，搅拌转速为每分钟250转。加入助滤剂(Radielite700，注册商标)后，该培养液被过滤分离为滤液和细胞。然后，滤液用40升乙酸乙脂萃取，细胞用30升丙酮萃取。细胞的丙酮萃取液，用减压浓缩除去丙酮，并用20升乙酸乙脂萃取。该萃取液与滤液萃取液合并，混合液减压浓缩。残液在750克用氯仿填充的硅酸(Wako胶C-200，商品名)层析柱上吸附，并用氯仿和甲醇(100∶1)的混合液洗脱。活性组分在负压下被浓缩干燥，由此获得油状残液。此后，将残液溶于少量丙酮，吸附于一用丙酮填充的SephadexLH-20层析柱上，用丙酮洗脱。这样获得的活性组份浓缩即可得到抗生素6270的粗结晶体。该晶体溶于乙酸乙酯，与稀盐酸一起振摇。乙酸乙脂层在负压下浓缩。这样形成的晶体从正-己烷-乙酸乙脂中重结晶，可获得无色针状抗生素6270游离酸晶体23.4克。这样获得的抗生素6270游离酸表现出上述理化和生物学特征。
试验例1抗球虫病活性试验药剂和饲料
抗生素6270与鸡的完全混合饲料(东方酵母公司制造，QrientakYeastCo.)混匀以获得预定的比例。从卵囊接种前两天到试验结束(感染后八天)让鸡自由取食这样得到的饲料。
作为已知的抗球虫病剂，Monensin被用于作为对照药剂。
试验用鸡本试验用鸡为健康产卵鸡(SheverStarcro-ss)，这些鸡为七日龄(接种时为九日龄)并为在完全禁绝球虫病染的情况下孵出。每一组为五只。
卵囊接种及接种量感染用卵囊为对禽艾美球虫(Eimeria Tenolla)敏感的种类把完全成熟的卵囊(3×104)注射进每一只鸡的素囊，用金属探针口注。结果的判断药剂效果用抗球虫病指数(ACI)决定，其计算公式如下ACI＝(相关体重的净增+存活率)-(卵囊值+致病值)小于120作为抗球虫病剂无效。
小于160作为抗球虫病剂有效。
160-180作为抗球虫病剂效果较好。
180以上作为抗球虫病剂效果极好。
(1)相关体重的净增试验结束时，测量每一试验组体重的净增(即试验结束时体重-感染时体重)，并在对照组(100)体重的基础上计算出相关体重的净增对照组亦用含有抗球虫病剂的饲料喂养但不接种。
(2)卵囊指数盲肠中卵囊数量在接种八天后用匀化肠道的方法计数。卵囊指数表示如下肠道中发现的卵囊数卵囊指数0.0-0.1×.0×.0×-11.0×1×10640(3)肠道致病指数试验用鸡在试验结束时(感染八天后)解剖，肠道用肉眼检查以确定致病指数。致病指数表示如下，致病值定义为致病指数值的十倍。
0.(-)盲肠完全正常。如果发现血点，(一)改为(+)。
1.(+)盲肠形状正常。内含物为少量流质，淡黄色。部分盲肠粘膜发现轻微肿胀变白。
2.(++)盲肠形状一般不正常。整个粘膜表面可见肿胀。肠内可见无血。粘液稍黄且量少。在粘膜上可发现少量白色点状坏死或出血点。
3.(+++)盲肠明显萎缩变形，比直肠稍长。肠道完全变形，并充满凝血块或灰白色，奶酪状变性物质。盲肠完全肿胀、易破裂，有时仍有点出血。病变达到盲肠的主要部分，但未到直肠。
(4)(++++)盲肠显著变形萎缩。盲肠的形状看上去象一根腊肠并不再直肠长。病变几乎达到直肠的三分之一或四分之一。
(1)组到(3)组从卵囊接种前两天起就饲以含有预定比例抗生素6270的饲料。(4)组喂以含有作为对照的抗生素Mononsin饲料。(5)组是卵囊接种感染未处理对照组，并喂以无抗球虫病剂的基本饲料。(6)组为未感染、未处理对照组。
从这些试验结果中，显然抗生素6270具抗球虫病活性。
试验例2猪的饲养效果试验试验用猪Landrace种(兰德瑞斯种)基本饲料a)从试验开始到四周后60%谷物(玉米、小麦、大麦)，15%黄豆饼，15%动物性饲料(脱脂乳粉，鱼粉)，以及10%其他(酶，碳酸钙，磷酸钾)氯化钠等)。
b)4-12周78%谷物(玉米，miro，小麦)，13%黄豆饼，50%鱼粉及4%其它(碳酸钙，磷酸钙，氯化钠等)。
方法15只平均5日龄仔猪分为3组，每组5只，使平均体重在实际上相等。抗生素6270分别以百万分之零，125和25的量加入于基本饲料。然后3组猪分别用该饲料喂养12周。测出体重和饲料消耗。
此外，统计从试验开始的头四周内猪患腹泻的总天数。结果列于表3。
饲料需求指数通过饲喂含有抗生素6270的饲料而从5%增加到8%体重的净增(率)从5%增加到11%。而且观察到猪的腹泻实际上缓和。
试验例3反刍动物的饲养效果试验用牛Helstein种(哈尔斯蒂恩)高效饲料
71.5%谷物(玉米，mire，大麦)，11.5%谷壳和糖(麸质玉米饲料)麦麸，米糠油饼)，55%植物油饼(黄豆饼，亚麻子油饼)，以及11.5%其它(alphalpha饼粉，糖
浆，磷酸钙，氯化钠)。
方法15只八月龄阉牛分成3组，每组5只，实际平均体重应相等。抗生素6270分别以百分之一0，7.5和15的浓度加入于基本高效饲料中。3组阉牛分别用该饲料喂养。此外，每只牛喂以1公斤干稻草作为粗饲料，结果列于表4。
高效饲料需求指数通过饲以含有抗生素6270的饲料而从7%增加到10%，体重净增(率)从9%增加到11%。
1.一种抗球虫消剂，其特征在于含有抗生素6270或其盐类作为一种有效成分，抗生素6270具有以下理化性质(1)无色针状结晶；酸性物质(2)熔点115-118℃(3)元素分析(发现物%)C62.72%；H9.49%；O27.78%(4)比旋度[a]20D-11.5°(浓度1.0，甲醇)(5)紫外吸收光谱最大吸收带在210nm或更远处没有观察到，这是在甲醇溶液中测定的。(6)在红外吸收光谱中的特征吸收(Cm-1)(用溴化钾压片法进行)，，，，，，980(7)溶解度溶于甲醇，乙醇，乙酸乙酯，氯仿，乙醚，丙酮和苯，不溶于水。(8)颜色反应在香草醛-硫酸反应中和Drage-ndorff反应中呈阳性；在茚三酮反应中呈阴性；带最I2气体的颜色。(9)薄层层析(使用Merch公司制造的硅酸GF254′)溶剂系统，Rf值氯仿-甲醇(20∶1)
0.49正已烷-乙酸乙酯(1∶1)
0.08苯-乙酸乙酯(1∶1)
0.04苯-丙酮(1∶1)
0.53氯仿-丙酮(2∶1)0.36正已烷-乙酸乙酯(1∶23)
0.13乙酸乙酯
0.22(10)1H-核磁夫振波谱在δppm3.39(3H)，3.49(6H)下观察到三个甲氧基的存在，这是在重质氯仿中在100MHz下用四甲基硅烷作为内标准测定的。
2.一种防治家禽和家畜球虫病的方法，其特征在于，给家禽和家畜吃有效数量的，如权项1所限定的抗生素6270或其盐类
3.一种家禽和家畜的生长加速和饮料功效增强剂，其特征在于，含有如权项1所述的抗生素6270或其盐类作为活性组分。
4.一种加速家畜和家禽生长并提高饲料功效的方法，其特征在于给家畜和家禽吃含有有效数量的如权项1所述的抗生素6270或其盐类。
5.一种家畜及及家禽的饲料，其特征在于，含有如权项1所述的对家禽和家畜的球虫病有效量的抗生素6270或其盐类。
6.根据权项7所述的饲料，其特征在于含有大约0.5到200ppm浓度的抗生素6270或其盐类。
7.一种家禽和家畜的饲料，其特征在于，含有如权项1所述的抗生素6270或其盐类。对加速家畜或家禽的生长及提高饲料功效而言，其含量为有效量。
8.根据权项9所述的饲料，其特征在于，所含抗生素6270或其盐类的浓度大约0.5至200ppm。
一种新的抗生素6270的用途，它可用作一种抗球虫病剂或作为非加速家畜或家禽生长的饲料添加剂。
文档编号C12P1/06GK10298
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