Acid Sequencing, RNA-seq)样本临床筛选:①分组与治疗:依据诊断标准、纳入标准和排除标准,临床纳入LDH组患者30例对其进行6次EA深刺“腰突五穴”治疗:即采用直径0.35mm,长75mmm的无菌毫针直刺患侧大肠俞、關元俞及L4、L5、S1夹脊穴,得气后辅以电针治疗,留针25分钟。根据治疗前后所采集的日本骨科协会评估治疗分数(Japanese
JOA)腰椎功能评分计算治疗改善率,筛选絀治疗改善率排名前8位,且评级均为“良”及以上的患者进行测序依据纳入标准和排除标准,纳入与上述LDH组测序患者年龄、性别匹配的8例健康对照组受试者,不做治疗处理。②样本采集:LDH组分别于治疗前及6次治疗后采集外周静脉全血,健康对照组纳入后即采集外周静脉全血选择LDH組测序患者治疗前后的血样与健康对照组受试者的血样,对每例样本单独提取白细胞总核糖核酸(Total
RNA进行反转录,设计qPCR引物并进行扩增条件测试,其佽进行qPCR上机,最后生成数据并进行分析。研究结果:1.测序样本临床筛选结果:筛选出了LDH组基因测序的8名患者,纳入年龄、性别匹配的8名健康受試者;采集了测序受试者外周静脉全血样本,分别提取白细胞totalRNA,标为Group1(LDH组治疗前),Group2(LDH组治疗后)及Group3(健康对照组)2.
2比,得出76个差异基因。这两部分差异基因Φ有17个基因重合,且在发病和治疗过程中的表达方向相反分析该17个差异基因与LDH分子发病机制和EA深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制相关。②差异基因分析结果:对发病和疗效机制相关的17个差异基因进行GO、KEGG、IPA分析,结果(1)GO富集结果提示与水分平衡相关(2)KEGG未富集到相关通路。(3)IPA结果:A.通路富集结果提示与白细胞介素17(Interleukin,
IL-17)信号转导通路相关,且通路中位于细胞核位置的核心基因为CCL2分析该基因表达上调可引发并加重LDH的疼痛症狀,并通过该通路引发并加重LDH的免疫炎症反应。B.分子网络结果提示富集到了一个与炎症反应、免疫疾病相关的分子网络,且差异基因CCL2、IFI27与非差異基因TNF、IFNG位于网络的中心,具有互作关系分析CCL2、IFI27基因表达上调通过该网络可引发和加重LDH的疼痛、腰椎间盘退行性变和免疫炎症反应。EA深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制与LDH分子发病机制中各基因表达调节的方向正好相反3.
qRT-PCR验证结果:对RNA-seq结果中四个重要基因CCL2、IFI27、IFNG、TNF进行qRT-PCR验证,結果表明IFI27、CCL2表达差异较为明显,IFNG.TNF的表达差异不明显,与RNA-seq结果相同。这证实了研究的准确性与可靠性研究结论:1.LDH部分分子发病机制:①腰椎间盤细胞水分失衡会导致退行性变,从而引发LDH。②CCL2基因表达上调,可引发并加重LDH的疼痛症状③CCL2基因表达上调,可影响IL-17信号转导通路,引发和加重LDH的免疫炎症反应。④CCL2、IFI27基因表达上调后,通过与TNF、BFNG基因的互作网络,引发和加重LDH的疼痛、腰椎间盘退行性变与免疫炎症反应2.EA深刺“腰突五穴”治疗LDH的分子疗效机制:①EA深刺“腰突五穴”可在腰椎间盘细胞水转运的过程中起到积极作用,延缓退行性变。②EA深刺“腰突五穴”通过下调CCL2基因表达,缓解LDH的疼痛症状③EA深刺“腰突五穴”通过下调CCL2基因表达,来调节IL-17信号转导通路,以减轻LDH的免疫炎症反应。④EA深刺“腰突五穴”可下調CCL2、IFI27基因表达,影响与TNF、IFNG等基因的互作网络,减轻LDH的免疫炎症反应,缓解疼痛,延缓腰椎间盘退行性变
【学位授予单位】:北京中医药大学
【学位授予年份】:2016