EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR VARIANT
WIPO Patent Application WO/
Provided are a novel epidermal growth factor receptor variant - EGFRvA protein, a polynucleotide encoding the EGFRvA protein and a method of preparing the EGFRvA protein via recombination technology. Also provided is a use of the polynucleotide encoding the EGFRvA protein. The EGFRvA protein has a function of promoting tumor cell invasion or promoting tumor cell migration.
Inventors:
LI, Zonghai (25/Ln 2200 Xie-Tu Road, Shanghai 2, 200032, CN)
李宗海 (中国上海市斜土路2200弄25号, Shanghai 2, 200032, CN)
WANG, Hai (25/Ln 2200 Xie-Tu Road, Shanghai 2, 200032, CN)
王海 (中国上海市斜土路2200弄25号, Shanghai 2, 200032, CN)
ZHOU, Min (25/Ln 2200 Xie-Tu Road, Shanghai 2, 200032, CN)
周敏 (中国上海市斜土路2200弄25号, Shanghai 2, 200032, CN)
Application Number:
Publication Date:
08/04/2011
Filing Date:
01/26/2011
Export Citation:
SHANGHAI CANCER INSTITUTE (25/Ln 2200 Xie-Tu Road, Shanghai 2, 200032, CN)
上海市肿瘤研究所 (中国上海市斜土路2200弄25号, Shanghai 2, 200032, CN)
LI, Zonghai (25/Ln 2200 Xie-Tu Road, Shanghai 2, 200032, CN)
李宗海 (中国上海市斜土路2200弄25号, Shanghai 2, 200032, CN)
WANG, Hai (25/Ln 2200 Xie-Tu Road, Shanghai 2, 200032, CN)
王海 (中国上海市斜土路2200弄25号, Shanghai 2, 200032, CN)
ZHOU, Min (25/Ln 2200 Xie-Tu Road, Shanghai 2, 200032, CN)
International Classes:
C07K14/715; A61K38/17; A61P35/00; C07K16/30; C12N15/12; C12N15/36; C12Q1/02
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Other References:
DATABASE PROTEIN [Online] 01 January 2011 Database accession no. ADL28125
DATABASE PROTEIN [Online] 14 June 2006 Database accession no. XP_
Attorney, Agent or Firm:
SHANGHAI L & W INTELLECTUAL PROPERTY LAW OFFICE, LLC (Xing Di Commercial Building, Suite 301No. 1968 Yi Shan Road, Shanghai 3, 201103, CN)
权 利 要 求
1.一种分离的人 EGFRvA多肽， 其特征在于， 该多肽选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO : 2氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID N0 : 2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且具有促进肿瘤细胞侵袭或促进肿瘤细胞迁移功能的由（a)衍生的 多肽；
(c) 与 SEQ ID N0 : 2氨基酸序列有 95%同源性， 且具有促进肿瘤细胞侵袭或 促进肿瘤细胞迁移功能的由（a)衍生的多肽。
2.如权利要求 1所述的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。
3.—种分离的多核苷酸， 其特征在于， 它包含一核苷酸序列， 该核苷酸序列 选自下组：
(a)编码如权利要求 1所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求 3所述的多核苷酸，其特征在于， 该多核苷酸编码氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的多肽
更佳地， 该多核苷酸的序列选自下组:
-. (i) 具有 SEQ ID NO: 1中 44-3454位的序列；
(ii) 具有 SEQ ID NO: 1中 1-3763位的序列。
5.—种载体， 其特征在于， 它含有权利要求 3所述的多核苷酸。
6.—种遗传工程化的宿主细胞， 其特征在于， 它含有权利要求 5所述的载体。 7. 一种多肽的制备方法， 其特征在于， 该方法包含：
(a)在适合表达的条件下， 培养权利要求 6所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出人 EGFRvA多肽。
8.—种能与权利要求 1所述的人 EGFRvA多肽特异性结合且不结合于人表皮 生长因子受体的抗体。
9.一种药物组合物， 其特征在于， 它含有安全有效量的权利要求 1所述的多 肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体。
10. 一种确定测试化合物是否是 EGFRvA多肽的拮抗剂或激动剂的方法， 其 特征在于， 包括步骤： (a) 将测试化合物加入体外培养的肿瘤细胞的培养体系作为测试组； 并将体 外培养的相同的 中瘤细胞作为对照组，
其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物， 并且表达权利要求 1所述的 EGFRvA 多肽；
(b) 观察测试组和对照组中肿瘤细胞的迁移程度， 如果测试组的肿瘤细胞的 迁移程度大于对照组， 则表示测试化合物是 EGFRvA多肽的激动剂； 如果测试组 的肿瘤细胞的迁移程度着床数量小于对照组，则表示测试化合物是 EGFRvA多肽 的拮抗剂。
Description:
表皮生长因子受体变异体 技术领域
本发明属于生物技术和医学领域， 具体地说， 本发明涉及新的编码人表皮生 长因子受体变异体 EGFRvA(Epidermal growth factor receptor variant A， EGFRvA) 的多核苷酸， 以及此多核苷酸编码的多肽。 本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用 途和制备。 背景技术
表皮生长因子受体 (EGFR)是原癌基因 c-erb B 的 170 千道尔顿 (Kilodalton) 膜糖蛋白产物 (1)。 EGFR基因是最初在鸟类红细胞增多症病毒中识别的 erb B致 癌基因的细胞同系物 (1，2)。 己在各种人类肿瘤中观察到这种致癌基因通过基因放 大的活化 (3·6)。
已有文献表明， EGFR在多种类型的人类实体瘤中过表达 (7)。 这些肿瘤包括 肺癌、 结肠癌、 乳腺癌、 胃癌、 脑癌、 膀胱癌、 头颈部肿瘤、 卵巢癌、 肾癌和前 列腺癌 (7)。 v-erbB致癌基因和正常 EGFR基因之间的一个主要区别在于病毒致癌 基因是正常受体截断氨基的变型； 它们缺少大部分细胞质外结构域， 但保留了跨 膜和酪氨酸激酶结构域 (8·? υ。 这导致了它不能结合表皮生长因子 (EGF)， 但仍可 以磷酸化其它蛋白质 (14—15)。
各种基因变化都可以发生于病毒性 erb B致癌基因中， 例如， 基因的羧基末 端中发生氨基酸的取代和缺失。其中氨基端缺失对于致癌作用尤为关键。氨基端 缺失是大多 v-erb B致癌基因的一个特征， 包括由启动子的插入或逆转录病毒转 导引起的那些氨基端缺失 (13'1?)。相反， 羧基末端缺失似乎只与逆转录病毒转导引 起的肿瘤有关， 而且似乎决定于宿主范围和肿瘤类型的特异性 15)。 以氨基端 缺失的鸟类 c-erb B基因或人 EGF受体的转染实验表明该缺失可以使细胞转化 (16-17)。
EGFR基因的放大发生于.40%的恶性人类神经胶质瘤中 (3，7)， 受体基因的重 排在许多具有基因放大的肿瘤中较为明显。重排似乎更多地影响基因的氨基末端 (6,18)。
迄今已发现至少有八种 EGFR变体： l)EGFRvI缺少 EGFR的大部分细胞外结 构域。 2)EGFRvII由 EGFR的细胞外结构域中的 83aa框内缺失组成。 3)EGFRvIII由 EGFR的细胞外结构域中的 267aa框内缺失组成。 4)EGFRvIV含有 EGFR的细胞质 结构域中的缺失。5)EGFRvV含有 EGFR的细胞质结构域中的缺失。6)EGFR.TDM/2-7 含有 EGFR的细胞外结构域中的外显子 2-7的重复。 7)EGFR.TDM/18-26含有 EGFR 的细胞外结构域中的外显子 18-26的重复。 8)另外，存在第二种更为罕见的具有在外 一】一
确认本 显子 11 和 14 之间的连接点引入新颖组氨酸残基的缺失的 EGFRvIII 突变体 (EGFRvIII/ Δ 12-13)(24)。
EGFRvIII是在人类癌症中表皮生长因子 (EGF)受体最常见发生的变体 (24)。在 基因放大的过程中，在胞外区发生 267个氨基酸缺失，产生新的连接点 (甘氨酸)。 已知 EGFRvIII未表达于任何正常组织 (19' 2&))。 然而， EGFRvIII在许多肿瘤细胞 中有表达， 例如， 27-76%乳腺癌活检组织检查表达 EGFRvIII(21),50-70%神经胶质 瘤表达 EGFRvIII(19' 22)， 16%非小细胞肺癌表达 EGFRvIII(23)， 75%卵巢癌表达 EGFRvIII(22)。 此外， 本发明者所在实验室在最近也发现了肝癌中有 EGFRvIII的 存在 (25)。
然而，迄今为止，人们对于癌症侵袭和转移的原因和机理的了解还不够深入， 因此本领域迫切需要开发与癌症侵袭和转移相关的蛋白。 发明内容
本发明的目的是提供一种新的、与癌症侵袭和转移密切相关的表皮生长因子 受体变异体 EGFRvA多肽以及其片段、 类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用 途。 在本发明的第一方面， 提供新颖的分离出的 EGFRvA 多肽， 它包括： 具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段、 或其活 性衍生物。
较佳地， 该多肽选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个 (较佳地 1-10个)氨基酸残基的 取代、缺失或添加而形成的， 且具有促进肿瘤细胞侵袭和 /或促进肿瘤细胞迁移功 能的由 (a)衍生的多肽；
(c) 与 SEQ ID N0 : 2氨基酸序列有 95%同源性， 且具有促进肿瘤细胞侵袭或 促进肿瘤细胞迁移功能的由（a)衍生的多肽。
更佳地， 该多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示。
该 EGFRvA突变体缺失了表皮生长因子的胞内区末端的 120个氨基酸，并且 在末端又增加了如 SEQ ID NO : 2中第 位所示的 46个氨基酸构成的氨 基酸序列。 .
在本发明的第二方面， 提供编码分离的这些多肽的多核苷酸， 该多核苷酸包 含一核苷酸序列， 该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少 80% (较佳 地至少 90%， 更佳地至少 95%)相同性：（a)编码上述人 EGFRvA多肽的多核苷酸； 和 (b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO: 2 所示氨基酸序列的多肽。 更佳地， 该多核苷酸的序列是选自下组的一种： （a)具有 SEQ ID NO: 1中 44-3454位的序列； (b) 具有 SEQ ID NO: 1中 1-3763位的序列。
在本发明的第三方面， 提供了含有上述多核苷酸的载体， 以及被该载体转化 或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面， 提供了制备具有人 EGFRvA蛋白活性的多肽的方法， 该方法包含：（a)在适合表达人 EGFRvA蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的 宿主细胞； （b)从培养物中分离出具有人 EGFRvA蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面， 提供了与上述的人 EGFRvA多肽特异性结合的抗体。 在本发明的第六方面， 提供了模拟、促进、 拮抗人 EGFRvA多肽活性的化合 物， 以及抑制人 EGFRvA多肽的表达的化合物。 还提供了筛选和 /或制备这些化 ：合物的方法。较佳地， 该化合物是人 EGFRvA多肽的编码序列或其片段的反义序 列。
在本发明的第七方面， 提供了检测 (尤其是非诊断地体外检测)样品中是否存 在 EGFRvA蛋白的方法， 它包括： 将样品与 EGFRvA蛋白的特异性抗体接触， 观察是否形成抗体复合物， 形成了抗体复合物就表示样品中存在 EGFRvA蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与人 EGFRvA多肽异常表达相关的疾 病或疾病易感性的方法， 该方法包括： 检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在 突变。
在本发明的第九方面， 提供了本发明多肽和编码序列的用途。 例如本发明多 肽可被用于筛选促进人 EGFRvA 多肽活性的激动剂， 或者筛选抑制人 EGFRvA 多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指紋图谱鉴定。本发明的人 EGFRvA蛋白的编 码序列或其片段，可被作为引物用于 PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应， 或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面， 提供了一种药物组合物， 它含有安全有效量的本发明 的人 EGFRvA多肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗乳 腺癌、 脑胶质瘤等病症。
在另一优选例中，所述的拮抗剂是特异性结合于 EGFRvA多肽且不结合于人 表皮生长因子受体的抗体。
在本发明的第十一方面，提供了一种确定测试化合物是否是 EGFRvA多肽的 拮抗剂或激动剂的方法， 其特征在于， 包括步骤：
(a) 将测试化合物加入体外培养的肿瘤细胞的培养体系作为测试组； 并将体 外培养的相同的肿瘤细胞作为对照组，
其中所述的肿瘤细胞来自于哺乳动物， 并且表达本发明的 EGFRvA多肽； (b) 观察测试组和对照组中肿瘤细胞'的迁移程度， 如果测试组的肿瘤细胞的 迁移程度大于对照组， 则表示测试化合物是 EGFRvA多肽的激动剂； 如果测试组 的肿瘤细胞的迁移程度小于对照组， 则表示测试化合物是 EGFRvA 多肽的拮抗 剂。
在另一优选例中， 所述的肿瘤细胞来自于人。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开， 对本领域的技术人员而言是显而 易见的。 附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案， 而不用于限定由权利要求书所界 定的本发明范围。
图 1 : . EGFRvA与 EGFR的差异显示图。
图 2A: EGFRvA在各个正常组织中的 RNA水平检测。
图 2B: EGFR在肿瘤细胞系中的表达 (RT-PCR)。
图 2C: ' EGFR在肿瘤细胞系中的表达 (Western印迹法)。
图 2D: EGFRvA在肺癌组织中的表达， T是肿瘤组织， N是癌旁组织。
图 3 : EGFRvA稳定表达细胞系的建立及分析。其中， 3A: Western B 3B: 流式分析。
图 4: EGFRvA促进细胞的体外增生。
图 5 : EGFRvA促进细胞在体外的侵袭和迁移。
图 6: EGFRvA促进 U87细胞在体内的肺转移， 其中 A显示了荷瘤小鼠的体 重； B 显示了荷瘤小鼠的体重变化； C 显示了荷瘤小鼠的肺重。 *: P&0.05 , ** : P&0.01。
图 7: EGFRvA与 EGFR相比， 其稳定表达细胞系对针对 EGFR的抑制剂 Erotinib的敏感性要低。
图 8: shRNA的特异性检测， 表明所选的 shRNA可特异干扰靶序列。 其中， mock为随机引物对照， blank为空白对照。
图 9: 在 H1299细胞内， 所选的 shRNA可有效抑制相应的 EGFR mRNA表 达。 其中， mock为随机引物对照。
图 10:在 MDA-MB-468细胞内，所选的 shRNA可有效抑制相应的 EGFR 多 肽的表达。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次发现并分离了一种新的 EGFR变异体 (EGFRvA), 它有如下几个特征： 1)在表皮生长因子受体的胞内区末端出现 120 个氨基酸的缺失， 而增加了 46个新的氨基酸序列。 2)它在多种正常组织和肿瘤组 织中存在， 在某些肿瘤组织中过表达。 3)该变异体在体外能够明显促进肿瘤细胞 的侵袭， 迁移。 4)该变异体在体内,能够明显促进肿瘤细胞的转移。 5)与野生型 EGFR(EGFRwt )相比， 它对小分子激酶抑制剂的敏感性更低。 6)RNA干扰该变异 体可导致某些细胞死亡。 7)该变异体在一些肺癌病人中也存在 19号外显子或 21 号外显子的突变。 在此基础上完成了本发明。
此外， 本发明人还开发一些检测这个基因的方法： 1)用 RT-PCR检测该基因 及该基因在 19号及 21号外显子的突变。 2)筛选了一些单克隆抗体用于 EGFRvA 禾口 EGFRwt 的蛋白水平检测。 3)找到了能特异针对 EGFRvA的 shRNA。
： 在本发明中， 术语 "EGFRvA蛋白" 、 "EGFRvA多肽"或 "表皮生长因子 受体变异体 EGFRvA"可互换使用，都指具有人表皮生长因子受体变异体 EGFRvA 氨基酸序列 (SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的表 皮生长因子受体变异体 EGFRvA。
如本文所用， "分离的" 是指物质从其原始环境中分离出来 (如果是天然的 物质， 原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽 是没有分离纯化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物 质中分开， 则为分离纯化的。
如本文所用， "分离的 EGFRvA蛋白或多肽" 是指 EGFRvA多肽基本上不 含天然与其相关的其它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。 本领域的技术人员能用标 准的蛋白质纯化技术纯化 EGFRvA蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺獰 胶上能产生单一的主带。 EGFRvA多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 本发 明的多肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从原核 或真核宿主 (例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞)中产生。 根据 重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人 EGFRvA蛋白的片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语 "片段"、 "衍生物"和 "类似物"是指基本上保持本发明的天然人 EGFRvA蛋 白相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是 (i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多 肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的， 或 (ii)在一 个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或 (iii)成熟多肽与另一个化合物 (比 如延长多肽半衰期的化合物， 例如聚乙二醇)融合所形成的多肽， 或 (iv)附加的氨 基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此 多肽的序列或蛋白原序列， 或与抗原 IgG 片段的形成的融合蛋白）。 根据本文的 教导， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语"人 EGFRvA多肽"指具有人 EGFRvA蛋白活性的 SEQ ID NO: 2序列的多肽。该术语还包括具有与人 EGFRvA蛋白相同功能的、 SEQ ID NO: 2序列的变异形式。这些变异形式包括 (但并不限于)：一个或多个 (通常为 1-50个， 较佳地 1-30个， 更佳地 1-20个， 最佳地 1-10个)氨基酸的缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个 (通常为 20个以内， 较佳地为 10个以 内， 更佳地为 5个以内)氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸 进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C末端和 /或 N末端添加 一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人 EGFRvA蛋白 的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变 体、 诱导突变体、 在高或低的严紧度条件下能与人 EGFRvA DNA 杂交的 DNA 所编码的蛋白、 以及利用抗人 EGFRvA多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明 还提供了其他多肽， 如包含人 EGFRvA多肽或其片段的融合蛋白（如 SEQ ID NO: 3所示的融合蛋白）。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人 EGFRvA多肽的 可溶性片段。通常， 该片段具有人 EGFRvA多肽序列的至少约 10个连续氨基酸， 通常至少约 30个连续氨基酸， 较佳地至少约 50个连续氨基酸， 更佳地至少约 80 个连续氨基酸， 最佳地至少约 100个连续氨基酸。
发明还提供人 EGFRvA蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人 EGFRvA 多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差 异， 或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。 诱导变异体可以通 过各种技术得到， 如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变， 还可通过定点诱 变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然 L-氨基酸的残 基 (如 D-氨基酸)的类似物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸 (如 β、 Υ -氨 基酸)的类似物。 应理解， 本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰 (通常不改变一级结构)形式包括： 体内或体外的多肽的化学衍生形式如 乙酰化或羧基化。 修饰还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一步加 工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。 这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖 基化的酶 (如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。 修饰形式还包括具有磷 酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸)的序列。 还包括被修 饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中， "人 EGFRvA蛋白保守性变异多肽" 指与 SEQ ID NO: 2的氨 基酸序列相比， 有至多 10个， 较佳地至多 8个， 更佳地至多 5个， 最佳地至多 3 个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最 好根据表 1进行氨基酸替换而产生。
本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、 基因组 DNA或人工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是 编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID ΝΟ: 1所示的编码 区序列相同或者是简并的变异体。 如本文所用， "简并的变异体"在本发明中是 指编码具有 SEQ ID NO:2的蛋白质，但与 SEQ ID ΝΟ: 1所示的编码区序列有差别 的核酸序列。
编码 SEQ ID Ν?:2的成熟多肽的多核苷酸包括： 只编码成熟多肽的编码序 列； 成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列； 成熟多肽的编码序列 (和任选的附 加编码序列)以及非编码序列。
术语 "编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸， 也可以是 还包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列 的多肽或多肽的片段、 类似物和衍生物。 此多核苷酸的变异体可以是天然发生的 等位变异体或非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变 异体和插入变异体。 如本领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入， 但不会从实质上改变其编码的 多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50%，较佳地至少 70%, 更佳地至少 80%相同性的多核苷酸。 本发明特别涉及在严格条件下与本发 明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。 在本发明中， "严格条件" 是指： （1)在较 低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱， 如 0.2 X SSC , 0.1%SDS， 60 °C ; 或 (2) 杂交时加有变性剂， 如 50%(v/v)甲酰胺， 0.1%小牛血清 /0.1% Ficoll， 42°C等; 或 (3)仅在两条序列之间的相同性至少在 90%以上,更好是 95%以上时才发生杂交。 并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生 物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。 如本文所用， "核酸片段"的 长度至少含 15个核苷酸， 较好是至少 30个核苷酸， 更好是至少 50个核苷酸， 最好是至少 100个核苷酸以上。 核酸片段可用于核酸的扩增技术 (如 PCR)以确定 和 /或分离编码 EGFRvA蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供， 更佳地被纯化至均质。 本发明的人 EGFRvA核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、 重 组法或人工合成的方法获得。对于 PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷 酸序列， 尤其是开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA库或按本领域技 术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列 较长时，常常需要进行两次或多次 PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确 次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常 是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。
此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。 通 常， 通过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白 (或其片段， 或其 衍生物)的 DNA 序列。 然后可将该 DNA 序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子 (或如载体)和细胞中。 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白 序列中。
应用 PCR 技术扩增 DNA/RNA 的方法（Saiki , et al. Science ： )被优选用于获得本发明的基因。 特别是很难从文库中得到全长的 cDNA时， 可优选使用 RACE法 (RACE-cDNA末端快速扩增法)， 用于 PCR的引 物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择， 并可用常规方法合成。 可 用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 EGFRvA蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞， 以及经重组技术产生本发明 所述多肽的方法。
通过常规的重组 DNA技术 (Science, 1984； 224： 1431)， 可利用本发明的多 聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的 EGFRvA多肽。 一般来说有以下步骤： (1) .用本发明的编码人 EGFRvA 多肽的多核苷酸 (或变异体)， 或用含有该多 核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3) .从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。
本发明中， 人 EGFRvA多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。 术语"重组 表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳 动物细胞病毒如腺病毒、 逆转录病毒或其他载体。 在本发明中适用的载体包括但 不限于： 在细菌中表达的基于 T7的表达载体 (Rosenberg, et al. Gene, 1987， 56： 125)；在哺乳动物细胞中表达的 pMSXND表达载体 (Lee and Nathans, J Bio Chem. 263： )和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。 总之， 只要能在 宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以用。 表达载体的一个重要特征是通 常含有复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人 EGFRvA编码 DNA序列和合 适的转录 /翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合 成技术、 体内重组技术等 (Sambroook , et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。 所述的 DNA序列可有 效连接到表达载体中的适当启动子上， 以指导 mRNA合成。这些启动子的代表性 例子有：大肠杆菌的 lac或 trp启动子； λ噬菌体 PL启动子；真核启动子包括 CMV 立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、 早期和晚期 SV40启动子、 反转录病毒 的 LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动 子。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以 及绿色荧光蛋白 (GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于 转化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞； 或是高等真核细胞， 如哺乳动物细胞。 代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属； 鼠 伤寒沙门氏菌的细菌细胞； 真菌细胞如酵母； 植物细胞； 果蝇 S2或 Sf 的昆虫 细胞； CHO、 COS, 293细胞、 或 Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。 本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时， 如果在载体中插入增强子序列 时将会使转录得到增强。 增强子是 DNA的顺式作用因子， 通常大约有 10到 300 个碱基对， 作用于启动子以增强基.因的转录。 可举的例子包括在复制起始点晚期 一侧的 100到 270个碱基对的 SV40增强子、 在复制起始点晚期一侧的多瘤增强 子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细 胞。
用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。 当宿 主为原核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCl2。 如 果需要， 转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA 转染方法： 磯酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的多肽。 根据 所用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细胞 生长的条件下进行培养。 当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法 (如 温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段日寸间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞 外。 如果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯 化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并 不限于： 常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法)、 离心、 渗透破菌、 超 处理、 超离心、 分子筛层析 (凝胶过滤)、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层 析 (HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人 EGFRvA蛋白或多肽有多方面的用途。 这些用途包括 (但不限于)： 直接做为药物治疗 EGFRvA蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或 对抗 EGFRvA蛋白功能的抗体、 多肽或其它配体。 用表达的重组人 EGFRvA蛋 白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人 EGFRvA 蛋白功能的多 肽分子。
另一方面， 本发明还包括对人 EGFRvA DNA或是其片段编码的多肽具有特 异性的多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。 这里， "特异性"是指抗 体能结合于人 EGFRvA基因产物或片段。.较佳地， 指那些能与人 EGFRvA基因 产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发明中抗体包 括那些能够结合并抑制人 EGFRvA蛋白的分子，也包括那些并不影响人 EGFRvA 蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人 EGFRvA基因 产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆'或多克隆抗体， 而且还包括具有免疫活性.的抗 体片段， 如 Fab'或 (Fab)2片段； 抗体重链； 抗体轻链； 遗传工程改造的单链 Fv分 子 (Ladner等人， 美国专利 No. 4,946,778); 或嵌合抗体， 如具有鼠抗体结合特异 性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。 例如， 纯化的人 EGFRvA基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多 克隆抗体的产生。 与之相似的， 表达人 EGFRvA蛋白或其具有抗原性的片段的细 胞可用来免疫动物来生产抗体。 本发明的抗体也可以是单克隆抗体。 此类单克隆 抗体可以利用杂交瘤技术来制备 (见 Kohler等人， Nature 256:495 & 1975; Kohler 等人， Eur.J.Immunol. 6： 511， 1976; Kohler等人， Eur.J.Immunol. 6； 292, 1976; Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.， 1981)。 本发明的抗体包括能阻断人 EGFRvA 蛋白功能的抗体以及不影响人 EGFRvA蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人 EGFRvA基因产物的片 段或功能区， 通过常规免疫技术获得。 这些片段或功能区可以利用重组方法制备 或利用多肽合成仪合成。与人 EGFRvA基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用 原核细胞 (例如 Co/ )中生产的基因产物来免疫动物而产生； 与翻译后修饰形式 结合的抗体 (如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)， 可以用真核细胞 (例如酵母或昆虫 细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人 EGFRvA蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人 EGFRvA蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人 EGFRvA蛋白相关的疾病。给予适当 剂量的抗体可以刺激或阻断人 EGFRvA蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人 EGFRvA蛋白 高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素 (如白喉毒素， 蓖麻蛋白， 红豆碱等) 共价结合。 一种通常的方法是用巯基交联剂如 SPDP, 攻击抗体的氨基， 通过二 硫键的交换， 将毒素结合于抗体上， 这种杂交抗体可用于杀灭人 EGFRvA蛋白阳 性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人 EGFRvA蛋白或多肽免疫动物， 如家兔， 小鼠， 大 鼠等。 多种佐剂可用于增强免疫反应， 包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法， 可筛选出与 EGFRvA蛋白发生相 互作用的物质， 如受体、 抑制剂、 激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、 抑制剂、 激动剂、 拮抗剂或受体等， 当在治疗上进行 施用 (给药)时， 可提供不同的效果。 通常， 可将这些物质配制于无毒的、 惰性的 和药学上可接受的水性载体介质中， 其中 pH通常约为 5-8，较佳地 pH约为 6-8， 尽管 pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。 配制好的药物 组合物可以通过常规途径进行给药， 其中包括 (但并不限于)： 肌内、 腹膜内、 静 脉内 、 皮下、 皮内、 或局部给药。
抗本发明 EGFRvA蛋白的抗体用于疾病治疗，例如， 用于抑制肿瘤细胞的侵 袭或抑制肿瘤细胞的迁移。 在使甩本发明的抗体时， 还可同时使用其他治疗剂， 如抗肿瘤的化疗剂等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明 EGFRvA多肽 或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括 (但并不限 于)： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 药物制剂应与给药方 式相匹配。 本发明的药物组合物可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡 萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。 诸如片剂和胶囊之类的药物组 合物， 可通过常规方法进行制备。 药物组合物如针剂、 溶液、 片剂和胶囊宜在无 菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约 1 微克 /千克体重- 约 5.毫克 /千克体重。 此外， 本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时， 是将安全有效量的 EGFRvA蛋白或其拮抗剂、激动剂施 用于哺乳动物， 其中该安全有效量通常至少约 10微克 /千克体重， 而且在大多数 情况下不超过约 8毫克 /千克体重， 较佳地该剂量是约 10微克 /千克体重-约 1毫 克 /千克体重。 当然， 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都 是熟练医师技能范围之内的。 '
人 EGFRvA蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于 治疗由于 EGFRvA蛋白的无表达或异常 /无活性的 EGFRvA蛋白的表达所致的细 胞增殖、 发育或代谢异常。 重组的基因治疗载体 (如病毒载体)可设计成表达变异 的 EGFRvA蛋白， 以抑制内源性的 EGFRvA蛋白活性。 来源于病毒的表达载体 如逆转录病毒、 腺病毒、 腺病毒相关病毒、 单纯疱疹病毒、 细小病毒等可用于将 EGFRvA基因转移至细胞内。构建携带 EGFRvA基因的重组病毒载体的方法可见 于已有文献 (Sambrook,et al.)。另外重组人 EGFRvA基因可包装到脂质体中， 然后 再转移至细胞内。
抑制人 EGFRvA mRNA的寡聚核苷酸 (包括反义 RNA和 DNA)以及核酶也在 本发明的范围之内。 核酶是一种能特异性分解特定 RNA的酶样 R A分子， 其作 用机制是核酶分子与互补的靶 RNA 特异性杂交后进行核酸内切作用。 反义的 RNA和 DNA及核酶可用已有的任何 RNA或 DNA合成技术获得，如固相磷酸酰 胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。 反义 RNA 分子可通过编码该 RNA的 DNA序列在体外或体内转录获得。 这种 DNA序列已整合到载体的 RNA 聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰， 如增加两侧的序列长度， 核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二 酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括： 将多聚 :酸直'接注 λ'·到体内组 织中； 或在体外通过载体 (如病毒、 噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中， 再将细胞移植到体内等。
, 能与人 EGFRvA 蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸 结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时， 必须对人 EGFRvA蛋白分子进 行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人 EGFRvA蛋白水平的诊断试验方法。这些试 验是本领域所熟知的， 且包括 FISH 测定和放射免疫测定。 试验中所检测的人 EGFRvA蛋白水平，可以用作解释人 EGFRvA蛋白在各种疾病中的重要性和用于 诊断 EGFRvA蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在 EGFRvA蛋白的方法是利用 EGFRvA蛋白的 特异性抗体进行检测， 它包括： 将样品与 EGFRvA蛋白特异性抗体接触； 观察是 否形成抗体复合物， 形成了抗体复合物就表示样品中存在 EGFRvA蛋白。
EGFRvA蛋白的多聚核苷酸可用于 EGFRvA蛋白相关疾病的诊断和治疗。在 诊断方面， EGFRvA蛋白的多聚核苷酸可用于检测 EGFRvA蛋白的表达与否或在 疾病状态下 EGFRvA蛋白的异常表达。 如 EGFRvA DNA序列可用于对活检标本 的杂交以判断 EGFRvA蛋白的表达异常。杂交技术包括 Southern印迹法， Northern 印迹法、 原位杂交等。 这些技术方法都是公开的成熟技术， 相关的试剂盒都可从 商业途径得到。 本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列 (microarray)或 DNA 芯片 (又称为 "基因芯片"）上， 用于分析组织中基因的差异 表达分析和基因诊断。 用 EGFRvA 蛋白特异的引物进行 RNA-聚合酶链反应 (RT-PCR)体外扩增也可检测 EGFRvA蛋白的转录产物。
检测 EGFRvA基因的突变也可用于诊断 EGFRvA蛋白相关的疾病。 EGFRvA 蛋白突变的形式包括与正常野生型 EGFRvA DNA序列相比的点突变、 易位、 缺 失、 重组和其它任何异常等。 可用巳有的技术如 Southern印迹法、 DNA序列分 析、 PCR和原位杂交检测突变。另夕卜，突变有可能影响蛋白的表达，因此用 Northern 印迹法、 Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。 简而言之， 根据本发明 EGFRvA 蛋白的 cDNA制备 PCR引物 (优选 15-35bp)， 可以将序列定位于染色体上。然后， 将这些引物用于 PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应 于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置， 此序列在染色体上的物理位置就可以 与基因图数据相关联。'这些数据可见于例如， V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man (可通过与 Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得）。然后可 通过连锁分析， 确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。 在本发明的一个实例中， 提供了一种分离的多核苷酸， 它编码具有 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。 其序列如 SEQ ID NO: 1所示， 它包含的多核苷酸 序列全长为 3763个碱基， 其开放读框位于 44-3454位， 编码全长为 1136个氨基 酸的人 EGFRvA蛋白（SEQ ID NO: 2)。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。 实施例 1: 采用 PCR方法获得 EGFRvA的序列
材料方法： 正常组织 RNA 样品购自 Clonted 涉及组织包括： 脑 (货号 636530)、 结肠 (货号 636553)、 肾脏 (货号 636529)、 肝脏 (货号 636531)、 肺 (货号 636524)、 卵巢 (货号 636555)、 胰腺 (货号 636577)、 胎盘 (货号 636527)、 脾脏 (货 号 636525)、 胃（货号 636578)、 前列腺 (货号 636550)、 乳腺 (货号 636576)。
运用巢氏 PCR对上述样本进行扩增。
短链扩增 序列 SEQ ID
NO: 上游引物， 第一轮 5'- TCCCCTCCTGAGCTCTCTGAG -3' 3 扩增 EGFRwt的下游引物， \第 -一轮 5'- TGACTTGATACAGTACCGATCCGG-3" 4 扩增 EGFRvA的下游引物， 第一轮 5'-TGTACACACATCATGAACACTCACACA-3' 5 上游引物， 第二轮 5'-AGTGCAACCAGCAACAATTCCA-3' 6 扩增 EGFRwt的下游引物， 第:二轮 5'-GGAATCAAGCATCCTCTGGAAGAC-3' 7 扩增 EGFRvA的下游引物， 第二轮 5'-CAACAGAGGTACAGCAAACAACCAG-3' 8 长链扩增
上游引物， 第一轮 5'-GTATTGATCGGGAGAGCCG-3' 9 扩增 EGFRwt的下游引物， 第- 轮 5'-TGACTTGATACAGTACCGATCCGG-3' 10 扩增 EGFRvA的下游引物， 第.一轮 5'-TGTACACACATCATGAACACTCACACA-3' 1 1 上游引物， 第二轮 5'-ATGCGACCCTCCGGGACG-3' 12 扩增 EGFRwt的下游引物， 第:二轮 5'-GGAATCAAGCATCCTCTGGAAGAC-3' 13 扩增 EGFRvA的下游引物， 第.二轮 5'-CAACAGAGGTACAGCAAACAACCAG-3' 14 实验结果： 所有组织中均能扩增到野生型 EGFR。 但是， 在肝脏、 肺、 胃、 结肠和乳腺中， 均不能扩增得到明显的 VA条带。 其中， 在胎盘和前列腺正常组 织中获得一个全长的 EGFRvA序列（图 2A)。 实施例 2: 在肿瘤细胞和组织中检测 EGFRvA的 mRNA表达水平 本实施例所用的细胞来源如下:人上皮癌细胞： A431(ATCC, Manassas, VA， USA), 人乳腺癌细胞： MDA-MB-468(ATCC， Manassas, VA， USA), 人脑胶质 瘤细胞： U87MG(ATCC， Manassas, VA， USA), 人肝癌细胞： Bel-7402 (中国科 学院， 上海， 中国）， 人前列腺癌细胞： PC-3(ATCC， Manassas, VA， USA), 人 肺腺癌细胞： H1299(ATCC， Manassas , VA， USA) , 人卵巢癌细胞 SKOV-3 (ATCC, Manassas, VA， USA).。 细胞用含 10%胎牛血清和抗生素的 DMEM培 养基 (Gibco, Grand Island, NY)培养。 本实施例所用的肺癌及癌旁组织来自上海 市胸科医院。本实验所用的肝癌及癌旁组织来自江苏启东肝癌研究所。这些标本 ; '的获得都有知情同意书。 这些研究都经过相关伦理委员会的许可。 ' 实验结果 i几乎所有肿瘤细胞系以及大部分癌和癌旁组织中均存在 EGFRvA RNA水平的表达（图 2B和 2D)。 实施例 3: 识别 EGFRvA或 EGFRwt 的单克隆抗体制备
分 另 1J 合 成 EGFRwt 胞 内 区 和 EGFRvA 胞 内 区 的 多 肽 CSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA(EGFRwt)(SEQ ID NO: 15) 和 CPSQVLPPASPEGETVADKQTQ (EGFRvA) (SEQ ID NO: 16)。然后将多肽与铜蓝 蛋白 (KLH)以 1 : 1 的质量比交联。 将 100 ug peptide-KLH与弗氏完全佐剂以 1 : 1 混合， 免疫小鼠， 4周后用 100 μ§ 多肽 -KLH与弗氏不完全佐剂 1 : 1混合， 免疫 小鼠， 2周后再重复免疫 1次。 单克隆抗体采用传统的杂交瘤技术进行筛选， 用 EGFRwt 和 EGFRvA 稳定表达的细胞系鉴定其特异性。 这些抗体可以用于 EGFRwt和 EGFRvA的 ELISA, Western Blot (WB), immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHQ检测。
结果， 获得了能特异识别 EGFRvA的单抗 1F3-52, 能特异识别 EGFRwt的 单抗 1C5。
实施例 4: 在肿瘤细胞和组织中检测 EGFRvA的蛋白表达水平
用 BCA Kit(Pierce, Rockford, IL)对组织和细胞裂解物 (Lysates)进行定量。 将 30 蛋白在 10% SDS-PAGE进行电泳分离，然后电转到硝酸纤维素膜 (Millipore Billerica, MA),用 5%脱脂牛奶封闭，然后与一抗孵育， 4°C过夜。小鼠抗 GAPDH 抗体购自康成生物技术有限公司 (上海， 中国）。 兔抗人 EGFR抗体， SC-03购自 Santa Cruz生物技术有限公司（Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)。 1F3-52单抗 为特异性识别 EGFRvA的单抗， 1C5单抗为特异性识别 EGFRwt的单抗， 均由 本实验室制备。 免疫复合物与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体 （Immu-Club Labs , Sunnyvale , CA)在室温下孵育 1小时后用化学发光试剂 (Pierce, Rockford, 1L)进行检测。
实验结果： 在一些肿瘤细胞系如 A43 1， MDA-MB-468存在 EGFRvA蛋白质 水平的表达 (图 2C)。 在肺癌组织中也检测到了 EGFRvA的广泛表达。 实施例 5: 制备慢病毒及建立稳定转染细胞：
EGFRwt和 EGFRvA序列分别从 A43 1细胞系中扩增。测序后插入 pWPT载 体（可购自 Addgene 公司）并替换掉 GFP， 从而产生. pWPT-EGFRwt 和 pWPT-EGFRvA。 将 pWPT-EGFRwt或 pWPT-EGFRvA分别与包装质粒 psPAX? 及 G-protein of vesicular stomatitis virus (VSV-G) 胞膜质粒 MD2.G (可购自 Addgene公司)磷酸钙共转染到 293T细胞 (中国科学院， 上海， 中国）。 用病毒感 染 MH/3T3细胞及 U87MG细胞 （1 & 105)，感染时添加 6 μ^η Polybrene (Sigma Chemical , USA). Western blot鉴定混合克隆后， 取 100个细胞铺板， 各挑取 6 个单克隆， 再次进行 Western blot鉴定， 挑取表达丰度一致的克隆进行下一步实 验。 .
实验结果：获得了表达水平相对一致的 U87MG EGFRwt和 U87MG EGFRvA 细胞株。 NIH/3T3 EGFRwt和 NIH/3T3 EGFRvA细胞系的总 EGFR表达水平也基 本一致 (图 3A)。 实施例 6: 流式检测
取 NIH/3T3 EGFRwt NIH/3T3 EGFRvA 以及 U87MG EGFRwt/U87MG EGFRvA候选克隆各 1X106细胞数。 l Ommol EDTA消化重悬后分别与 EGFR抗 体 (单克隆鼠抗 M225， 稀释倍数 1 : 100)以及同型无关抗体孵育， 室温 lh。 之后 加入二抗 (羊抗鼠 -FITC , 稀释倍数 1 : 50)室温孵育 30min。 收集样品， 选用 BD FACSCalibur流式操作仪分析样品。用 winMDI2.9软件对所得数据进行处理并绘 图。
实验结果： 我们发现 U87MG EGFRwt和 U87MG EGFRvA的总 EGFR表达 水平基本一致。 NIH/3T3 EGFRwt和 NIH/3T3 EGFRvA细胞系的总 EGFR表达水 平也基本一致。 4株细胞均为单克隆 (见图 3B)。 实施例 7: 细胞增殖实验
材料： CCK-8 试剂盒购自 Dojindo Laboratories
取对数生长期的细胞， 计数后种 6块 96 孔板， 每孔 300 个细胞， 每块板 上每种细胞种 5个复孔， 每隔 24 h 取 1块板， 将原有培基更换为含 10% CCK-8 的培养基， 继续孵育 2 h测定 0D450 值， 总共 6天， 绘制细胞生长曲线。 结果见图 4:从第 5天开始，相对于对照 U87MG GFP细胞，过表达 EGFRwt 和 EGFRvA的 U87MG细胞均显示了更强的细胞增殖能力 (p & 0.01)。 而 U87MG EGFRwt和 U87MG EGFRvA细胞两.者之间的增殖的能力无明显差异 (/? & 0.05)。 NIH/3T3系列细胞也显示了同样的结果。 ' 实施例 8: 细胞迁移和侵袭实验
材料： Tmnswell小室 (孔径： 8.0 μπι)及基质胶均购自 BD Bioscience公司。 方法：
' 划痕实验： 为了初步检测 EGFRvA对细胞迁移能力的作用， 选用 NIH/3T3 稳转细胞系进行了划痕实验。 取对数生长期的细胞， 计数后种 6 孔板， 每孔 1 X 106的细胞。 培养细胞至 100%的融合度后， 用无菌的黄 Tip在细胞层上划出宽 度约 1 mm 的划痕， 无血清培养基洗细胞 3次， 去除划痕时掉下来的细胞， 然后 分别于 24 h， 48 h和 72h时在显微镜下拍照， 计数迁移的细胞。
Transwell 迁移实验 （Transwell migration assay)： 为了更籍确地检测 EGFRvA对细胞迁移能力的作用，进行了 Trasnwell迁移实验。将 5 X 104的细胞， 重悬于 200 μ?无血清培基，加入 Transwell上层小室，下层加入 600 μ? 含 10% FBS 的培基， 培养 12h(NIH/3T3 GFP,NIH/3T3 EGFRwt,NIH/3T3 EGFRvA)或 24 h(U87MG GFP,U87MG EGFR,U87MG EGFRvA)后， 4%多聚甲醛固定 1 h， 用棉 签拭去 Transwell上层小室内未迁移的细胞， 0.1 % 结晶紫染色 30 分钟， 显微 镜下拍照 (放大 100倍)， 计数。
细胞侵袭实验 （Transwell invasion assay) ： 为了检测 EGFRvA对细胞侵袭 能力的作用，进行了细胞侵袭实验。在 Transwell上层小室平铺稀释为 1 μ§/μ1 的 Matrigel 100 μ1， 37 ° C孵育 4 h， 用无血清培养基轻洗 Matrigel两次。 计数 1 X 105的细胞， 重悬于 200 μ?无血清培基， 加入已铺好 Matrigel的 Transwell上层小 室， 下层加入 600 μ1 含 10% FBS的培基， 培养 24 h后， 4%多聚甲醛固定 l h， 用棉签擦去 Transwell上层小室内的细胞， 0.1 % 结晶紫染色 30 分钟， 显微镜 下拍照 (放大 loo倍: )， 计数。
结果： 从划痕后 24小时到 72小时， 相对于 NIH/3T3 GFP对照细胞， 可见 NIH/3T3 EGFRwt 细胞与 NIH/3T3 EGFRvA 细胞有明显的细胞迁移能力， 而 NIH/3T3 EGFRvA的细胞迁移能力相对更强 (p&0.05)。而 Transwell实验显示了更 明显的结果， 无论是在小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 还是在人脑胶质瘤细胞系 U87MG, EGFRvA均具有比 EGFRwt更强的促进细胞迁移和侵袭的能力（表 2和 图 5)。 表 2. EGFRvA具有比 EGFRwt 更强的促进细胞迁移和侵袭的能力 迁移的细胞 侵袭的细胞
EGFRwt /GFP EGFRvA/EGFRwt EGFRwt /GFP EGFRvA/EGFRwt U87MG 1.93 - & 2.42 4.40 1.81 NIH/3T3 2.68 1.61 2.91 1.98 实施例 9: 体内转移实验：
取 6-8周龄裸鼠， 分为 3组， 每组 10只。 以 1 X 106细胞 的接种量对三组 小鼠尾静脉注射 U87MG-GFP、 U87MG EGFRwt以及 U87MG EGFRvA细胞系。 18天后进行 microCT扫描。 小鼠于种瘤及处死前两次测量体重。 体重测量完毕., 后处死小鼠，取肺脏称重，并对组织进行组化检测。数据处理软件选用 SPSS 11.0， 先通过 lenvene检验证明各组之间方差齐性， 接着用方差检验验证各组之间总体 上是否存在显著性差异， 最后用 LSD检验在组间进行两两比较。 结果： 观察到 EGFRvA有较之野生型 EGFR更强的促进肿瘤转移的能力。 这体现在小鼠的肺部变化以及体童变化中。 U87MG-GFP接种的小鼠肺部偶有结 节， 但基本维持了肺脏的基本形态。 而 EGFRwt以及 EGFRvA接种的小鼠肺部 均出现了相当多的肺部结节。 通过观察比较以及组化鉴定， 发现 EGFRvA接种 组的小鼠肺部肿瘤侵润的程度高于 EGFRwt接种组。 事实上， EGFRwt(P=0.001) 和 EGFRvA(P&0.001)接种组小鼠的肺重都明显超过 U87MG-GFP组，而 VA接种 组的肺重又超过了 EGFRwt接种组 (P=0.018)。 VA接种组的小鼠的身体状况在 3 组中也是最差的。体重数据表明， VA组的小鼠体重较之 GFP组和 EGFRwt组明 显更轻 (P&0.001)。而体重变化程度也能得出同样的结论 (P&0.001)。 以上证据都有 力地表明： EGFRvA比野生型 EGFR具有更强的促进肿瘤细胞侵袭的能力（图 6)。 实施例 10: EGFR小分子抑制剂抑制细胞生长实验
材料： AG1478购自 Calbiochem 公司, Erlotinib可购自罗氏制药公司。
方法： 取对数生长期的细胞铺 96孔板， 每孔 3000个细胞。 培养 24 h后， 加入不同浓度的 Erlotinib或 AG1478, 继续培养 72 h， 更换为含 10% CCK-8试 剂的培养基孵育 2 h， 测定 0D450 值。
实验结果： EGFR小分子抑制剂 Erlotinib和 AG1478作用于 EGFRvA 的 IC50 值是野生型 EGFR的 3倍以上， 说明 EGFRvA对 EGFR小分子抑制剂有更强的 抵抗能力 (表 3和图 7)。 表 3. EGFRvA对 EGFR小分子抑制剂有更强的抵抗能力
AG1478 Erlotinib
U87MG EGFRwt 0.89 0.23
U87MG EGFRvA 4.06 0.84
IC50比值 (EGFRvA/EGFRwt) 4.56 3.65 实施例 11 筛选 EGFRvA多肽的拮抗剂
按实施例 8所述方法， 将以下两组物质施用于 U87-EGFRvA细胞系，' 然后 观察对细胞迁移的影响： 〈a)候选物质； （b)空白对照。
如果组 (a)的细胞迁移在统计学上显著低于组 (b)的细胞迁移， 则表明该候选 物质是 EGFRvA 多肽的拮抗剂； 如果显著高于组 (b)， 则表明该候选物质是 EGFRvA多肽的激动剂。
类似地，按实施例 8所述方法，将以下两组物质施用于 MDA-MB-468细胞 (表
EGFRvA), 然后观察对细胞侵袭能力的影响： （a)候选物质； （b)空白对照。
如果组 (a)的细胞侵袭能力在统计学上显著低于组 (b)的细胞侵袭能力， 则表 明该候选物质是 EGFRvA 多肽的拮抗剂。 如果显著高于组 (b)， 则表明该候选物. 质是 EGFRvA多肽的激动剂。 实施例 12 EGFRvA蛋白重组表达和纯化
挑 NIH3T3-EGFRvA阳性克隆扩大培养,用 pH7.4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层 细胞两次， 加入缓冲液 A (2% Triton X-100 lOOmM NaCl, 50mM Hepes, ImM EGTA， 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf pH=7.4), 溶液冰浴 15min， 刮下单层细 胞， 4°C 10 000g 5min离心， 收集上清。 上清用 0.22mm滤膜过滤后， 过 CNBr 活化的 Sepharose 4B 抗 EGFRvA 抗体 (1F3-52)亲和层析柱， 经缓冲液 B ( 0.5% Triton X-100 lOOmM NaCl, 50mM Hepes, 20uM pmsf, ImM EGTA， pH=7.4) 充分洗涤后， 加入缓冲液 C ( 0.5% Triton X-100 lOOmM NaCl, lOOmM Citrate, 20uM pmsf, ImM EGTA, pH=3.0) 洗脱， 收集洗脱液， 加入 1/10体积 1M Tris Hcl( pH9.6)溶液中和， 即得到人 EGFRvA蛋白。 实施例 13 抗 EGFRvA蛋白抗体的产生
将实施例 12中获得的重组人 EGFRvA蛋白用来免疫动物以产生抗体， 具体 方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用 SDS-PAGE凝胶电泳法进 行分离， 将电泳条带从凝胶中切下， 并用等体积的完全 Freund's 佐剂乳化。 用 50-100μ§/0.2πι1乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。 14天后，用非完全 Freund's 佐剂乳化的同样抗原， 对小鼠以 50-10(^g/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免 疫。 每隔 14 天进行一次加强免疫,， M少进行三次。 获得的抗血清的特异反应活 性用它在体外沉淀人 EGFRvA蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现， 抗 体可特异性地与本发明蛋白发生结合。 实施例 14 shRNA干扰实验
针对 EGFR-WT和 EGFR-VA的 3'末端特异序列分别设计特异序列:
特异性干扰 EGFR-WT的序列：
GCTTTTT-3' o (SEQ ID NO: 17)
. 特异性 '干扰 EGFR-VA的序列：
5'-GAGCAGCCAGTCTCCAGT(
GGCTGCTTTTT-3'(SEQ ID NO: 18)
Mock对照序列 (；随机引物)：
5'-GTCTCCGAACGT
TTT-3*(SEQ ID NO: 19)。
所有 DNA序列经人工合成， 克隆进 pLV-THM质粒。 克隆成功后的载体与包 装质粒 psPAX2以及 pMD2.G共转 293T细胞。 收集病毒上清， 感染目的细胞。 由于 pLV-THM带有 EGFP基因， 因此感染成功的细胞可观察到绿色荧光。 干扰 结果通过逆转录 PCR和 Western Blot验证。 实验结果：
如图 8所示， 以 U87MG EGFR-WT和 U87MG EGFR-VA作为模式细胞， 分 别检测 shRNA-antiWT和 shRNA-antiVA的有效性和特异性。 实验结果表明， 在 模式细胞内， shRNA-antiWT以及 shRNA-antiVA均能有效地敲除目的基因， 且 彼此之间不存在交叉干扰。
如图 9所示： 对 H1299细胞对 EGFR-WT和 EGFR-VA分别进行基因敲除， 结 果发现在 mRNA表达水平上， shRNA-anti WT以及 shRNA-anti VA在敲除靶向基 因的同时， 也造成了另一种形式 EGFR的 mRNA水平的显著下调。
如图 10所示： 为了验证上述结果， 对 MDA-MB-468细胞也进行了同样的基因 敲除， 并直接在蛋白水平上通过 Western Blot进行检测， 最后得到了与 H1299 细胞类似的结果， BP : 两种 shRNA干扰都能同时造成除靶基因以外的另- -形式 EGFR的表达下调。 鉴于我们已通过模型细胞系的基.因敲條实验 ^排除了干扰序列 存在脱靶效应的可能性， 那么必然存在其他机制造成了 H1299和 MDA-MB-468 细胞内 EGFR-WT和 EGF -VA的同步下调。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。 参考文献
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