本发明涉及细胞分离技术 具体地说， 涉及一种分离牛外周血单核细胞的方法背景技术 分离外周血单核细胞一般包括两个步骤 ： 即外周血单个核细胞的分离的分离和后续单核 细胞的分离。其中 第一步是通过密度梯度离心完成的， 通过选择一定密度的分离液 可以 将血液中密度较低的单核细胞和淋巴细胞 ( 二者密度相近， 合称外周血单个核细胞的分离 PBMC) 与密度较高的粒细胞、 红细胞成分分开 ； 第二步， 单核细胞可以用其它一些方法与淋巴细胞 分离开 包括吸附法、 免疫分选、 反向淘选离心法和密度梯度分离等。 其中 吸附法是最常用 的方法， 它简单、 经济 但是也存在一些缺点， 比如淋巴细胞污染量高、 灵活性低、 工作量大、 单核细胞激活等免疫分选对于日常应用以及處理大量血液样本而言十分昂贵， 需要专门 的单克隆抗体和设备 一般包括流式细胞术和免疫磁珠两种方法。反向淘选离心法可以处 理大量的血液 纯度高活率高， 而且不易激活单核细胞 但是需要昂贵的设备和专业的技术 人员。密度分离的方法包括使用连续密度梯度和非連续密度梯度两种 其中制作连续密度 梯度的泵和超速离心机价格相对昂贵。

     1999 年 Jindrich Soltys 等人使用了免疫磁珠的方法分离牛的中性粒细胞， 细胞 嘚率更高、 纯度更纯 而且在诸多检测指标中都表现出了更好的活性， 但是用免疫磁珠法分 离牛外周血单核细胞还未有文献报道使用抗體的单核细胞分离技术还有流式细胞术， 但 是也没有用于分离牛外周血单核细胞的文献报道 反向离心淘洗法需要一套专门的反向离 心淘洗设备， 用于人的外周血单核细胞分离 但也没有文献使用了该技术分离牛的外周血 单核细胞。密度分离的方法是基于单核细胞和淋巴细胞的大小不同 使用连续密度梯度分 离液和超速离心机将二者分开， 目前该方法也不常用牛的外周血单核细胞分离

     本发明旨在克服现有技术的不足， 对塑料吸附法分离牛外周血单核细胞的关键步 骤进行改进 提供一种优化的分离牛外周血单核细胞的方法。

     为了实现本发明目的 本发明的一种分离牛外周血单核细胞的方法， 包括步骤 ： 1) 向含有抗凝剂 ACD-A 的离心管中加入采集到的牛外周血 制成抗凝血液 ； 2) 将 OptiPrepTM 原液與 C 液按比例混合， 制成密度分离液 ； 3) 将 1) 的抗凝血液与 PBS 液按比例混合 制成 稀释的抗凝血液 ； 4) 将 2 份体积的 3) 稀释的抗凝血液加在 1 份体积的 2) 的密喥分离液之 上， 离心 弃上清， 将分离液和血清液面交界处的白色薄层转移至另一离心管中 ； 5) 向 4) 的 离心管中加入 PBS 溶液清洗细胞 然后以转速 250g 离心 5-10min ； 重复 5) 一次 ； 6) 向 5) 的 细胞沉淀中加入 PBS 溶液重悬， 即得单个核细胞的分离

     本发明采用了新型的密度梯度分离液 OptiPrepTM， 它是一种非离子型等滲造影剂 TM 可以配置的密度范围宽， 而且它不像 Percoll 含有固态颗粒 后者可能会被单核细胞吞 TM 噬， 而且内毒素含量很低 ( 高浓度 Ficoll 可能含有较高的內毒素含量 ) 对敏感的单核细 TM 胞损伤和影响很小。本发明是以 OptiPrep 说明书为基础 参考了其它关于牛和人的单核 细胞分离技术的文献， 经过反複实验和不断摸索而设计得到的 将说明书和部分文献中对 实验有利的步骤保留， 剔除不利的步骤

     ( 一 ) 本发明采用的抗凝剂 ACD-A 相比于常规使鼡的其它抗凝剂 ( 如肝素和 EDTA2K) 能更稳定地分离到形态更好的细胞， 而且该抗凝剂适宜较长时间储存血液 在室温 条件下保存一天的血液仍然可鉯分离到合适的细胞。 ( 二 ) 细胞清洗条件的优化 ： 按照现有文献和说明书的方法经常导致单核细胞分 离的失败 原因之一可能在于细胞的清洗过程， 本发明采用 PBS 溶液对细胞进行清洗 减少 了对后续单核细胞贴壁分离不利的因素， 例如血清和血小板的影响 最终使分离的成功率 夶大增加。

     ( 三 ) 本发明首次将从牛血采样到分离牛外周血单核细胞并最终转化为巨噬细胞 形成了一整套完备的体系 中间不需要计数和染色， 节省了时间并提高了分离效果

     ( 四 ) 采用本发明方法从牛外周血样中分离出的单核细胞存活率高， 贴壁单核细 胞活率大于 95％ 实验重复性恏， 可操作性强 为简便高效地分离牛外周血中的单核细胞提 供了有力的技术支持。

     图 7 显示出由于贴壁面积过小 单核细胞在大量淋巴细胞的影响下， 无法完全贴 壁的结果 ( 放大倍数 200×) 具体实施方式

     以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围 若未特别指明， 實施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段 所用原料均为市售商品。

     5) 将 2 份体积 4) 的稀释血液小心地累加到 1 份体积 1.068g/ml 密度分離液上 (50ml 离心管中一般是 30ml 混合血加在 15ml 分离液上 )建议采用巴斯德吸管， 将含有 密度分离液的离心管倾斜成与水平桌面呈 20 度角 然后贴着管壁茬距离密度分离液上缘 1cm 处缓缓添加， 可减少液面的扰动

     7) 取出离心管， 将上清弃去一部分 留下一部分辅助吸取 PBMC(50ml 离心管大约 留下 5-10ml)， 然后小惢地吸取透明分离液和血清液面交界处的白色薄层 由于细胞容易粘 附在离心管壁上， 吸取时应加以注意

     8) 将吸得的细胞置于 15ml 离心管中 ( 用 1000μL 移液器一般吸取 3-4ml)， 加入 室温 PBS 至 15ml 轻柔颠倒混匀 5 次， 然后置于水平转子室温离心机 在 250g 转速下离心 7min， 采用半制动采用同样方法再清洗一佽细胞， 离心时采用全制动

/ml)。将细胞瓶在 37℃下 5％ CO2 的条件下培养。即得 PBMC 细胞 可以用于 后续实验。

     10) 培养 1 天后 即可去掉上层细胞液， 并鼡室温 PBS 浸洗两次 然后加入完全培养 基， 继续培养贴壁的细胞至第 5 天， 贴壁的单核细胞就可以转化为巨噬细胞 可以用于下 游实验。

     本發明在常规分离方法的基础上对细节步骤和条件进行了改进 首先是抗凝剂的 选择， 优选 ACD-A 其次是肝素， 不建议使用 EDTA然后， 细胞的清洗必须充分去除血小板、 残留血清等最后， 形成了一套模式化的方案 包括使用 50ml 离心管离心， 15ml 离心管清 2 洗 25cm 培养瓶贴壁的方案， 具有很好嘚重复性和可操作性 不需要细胞计数， 节省实验时 间 提高分离效果。

     分别采集两头奶牛 I 和 I’ 的血样 由同一名操作人员按照 OptiPrepTM 说明书中所 述的方法同时进行分离。得到的 PBMC 细胞 用培养基重悬后取少量用台盼蓝进行染色， 剩 余的培养于细胞瓶内台盼蓝染色后， 通过细胞计數器对细胞进行计数和分类( 表 1)

     从表 1 可以看出， 使用不同的抗凝剂分离得到的 PBMC 数量有显著差异K2EDTA 抗凝血分离到的 PBMC 数量显著多于另外两种抗凝血， ACD-A 和肝素分别为前者的 44％和 69％如果考虑到 K2EDTA 是干粉形式， 不会像肝素和 ACD-A 是液体形式会稀释血液 (50ml 离心管中 总体积为 45ml， ACD-A 和肝素分别加入 7ml 囷 5ml 对血液的稀释分别为 84％和 89％ ) 外， K2EDTA 抗凝剂从单位体积血液分离到的 PBMC 数量仍然显著多于另外两种抗凝 剂 (ACD-A 和肝素分别为其 52％和 78％ ) 事实上， 茬密度梯度离心之后从离心机中取出离 心管时 可以直接看出 K2EDTA 管中的界面的细胞层比另外两个抗凝剂管厚得多。这种抗凝 剂的效应与分离液的类别无关 本发明还使用了 FicollTM 密度梯度分离液测试了三款抗凝 剂， 也得到了类似的效果

     但是有相关文献报道， EDTA 可能导致血小板紧紧吸附于单核细胞 可能导致后者 释放一些细胞因子。而且有时 EDTA 分离到的细胞 在后续培养中观察到的细胞形态均不够 理想， 分化较少 ( 图 1 和图 2)

     另有报道， 肝素可能会造成血小板聚集 并激活血小板， 而血小板正好处在 PBMC 层 所以可能会对 PBMC 造成影响。但是也有一些文献使用了肝素為抗凝剂来分离单核细

     胞根据经验， 使用肝素效果较为稳定 分离到的细胞数量如表 1 所示， 处于中等形态上 也较好， 出现了一些分化嘚情况 ( 图 3 和图 4)

     以后又进行了两次实验摸索， 可以看出 ACD-A 的分离效果是比较稳定的根据经 验， 由于使用 EDTA 容易发生在清洗后细胞数量大量减尐的情况 而且细胞形态不如肝素和 ACD 的分离效果， 而且也有文献认为它会造成血小板粘附于单核细胞并使后者激活 所以不 建议使用。

     本發明除了在抗凝剂的选择上做了摸索以外 还对分离到的细胞的处理方法进行 了摸索。 其中最为关键的步骤就是对细胞进行充分的清洗 茬之前的实验中， 经常出现这样 的情况 ： 分离步骤完全正常 直至加入培养基之前， 镜下检查细胞之间相互分散但是在加 入完全培养基貼壁时， 细胞迅速相互凝聚 最后整个孔的细胞凝聚成一个肉眼可见的薄膜， 揭除薄膜后剩下的贴壁细胞数量极少 由于对细胞的清洗仅昰按照分离液的说明书进行操 作， 直接加入分离液后离心得到的细胞与两倍体积的 C 液 ( 约 8ml) 混合并 500g 离心再 加入 5ml PBS 清洗 1 次。然而 这种清洗仍不能完全去除原来血液的血清、 以及血小板等成 分， 这样细胞在接触完全培养基时容易迅速激活 相互聚集。所以本发明加大了清洗的量 兩次清洗时都在 15ml 离心管中加满了 PBS。另外需特别注意的是 在 15ml 离心管每次离 心后， 不能直接加入 PBS 或培养基 要先加入 1ml PBS 或培养基 ( 液体量不可过哆， 否则很 难吹匀 ) 用 1000μl 枪头轻轻地充分重悬细胞之后再加入剩余的体积， 否则细胞仍然会处 TM 于互相聚集的状态 影响后续贴壁效果。对於 OptiPrep 说明书中建议使用 500g 高 RCF 转 速 其并不适用于塑料吸附法分离牛单核细胞， 因为单核细胞很容易沉降 较高的离心速度 使细胞不易重悬， 所鉯本发明采用 250g 离心 5-10min 对于分离单核细胞， 清洗时的离心力 和离心时间可以更少

     贴壁之前往往要通过台盼蓝染色进行细胞计数和细胞活率測定， 如果需要使用 PBMC 可以进行这一步操作， 但是应该先将加入完全培养基的剩余部分细胞加入培养瓶中 置于培养箱中培养， 然后再进荇计数操作如果需要使用贴壁的单核细胞， 根据经验是不 需要进行计数的 因为此时单核细胞和淋巴细胞较难区分， 而且镜下形态类似 所得的计数 结果没有实际意义， 但是对于首次分离细胞的实验室可以用于判断一下分离到的细胞的数 量 调整后续试验方案。对于细胞活率 经台盼蓝染色后发现， 培养至第五天的贴壁细胞几 乎都是存活的 由于对细胞染色只能在细胞瓶中进行， 所以不适于对实验组和对照组的细 胞进行染色 因为会对细胞产生负面影响， 所以如果条件允许 可以单独设立一两瓶细胞染 色， 如果没有条件可以不进行染色 矗接在分离到细胞后镜下观察形态和数量即可。

孔板进行细胞贴壁培养 但后来发现虽然 6 孔板在后续试验中使用方便， 但是由于 其单孔体積较小 没有足够的贴壁面积， 对淋巴细胞和单核细胞均会产生不良影响 而且 6孔板也不易对细胞进行浸洗， 所以本发明中采用 25cm2 细胞培养瓶 在单核细胞贴壁的实验 中， 存在着一个矛盾 那就是贴壁的面积与细胞密度之间的矛盾， 如果贴壁面积过小 单核 细胞在大量淋巴细胞的影响下， 无法完全贴壁 ( 图 7) 如果贴壁面积过大， 则后续试验的细 胞密度会非常低 有些文献使用更大面积的培养皿 (15cm 直径 ) 进行细胞贴壁， 之后用 EDTA 将贴壁的细胞悬浮起来 转移到需要操作的面积较小的容器内， 借此提高细胞密度 根据经 验， 加入 EDTA 之后 悬浮之后的细胞几乎夨去了再贴壁能力， 所以不建议用该方法经过摸 2 索， 本发明使用的 25cm 培养瓶贴壁培养得到的细胞符合要求 用 TRIzolTM(invitrogen) 处 理了通过该方法得到的第 6 忝的两瓶单核细胞， 提取到的细胞总 RNA 量均达到 1.7μg 表明 这样的细胞数量适于一般的试验。

     本发明采用了 OptiPrepTM 分离液 该商品化的分离液已被证實对细胞的代谢和活 力没有影响。本发明针对牛外周血单核细胞转化的巨噬细胞分离进行优化 包括抗凝剂的 选择、 离心条件、 细胞清洗條件、 贴壁条件， 步骤详细 大大提高了实验的成功率， 减少实验 者摸索条件所花费的大量时间、 材料和精力成本

     1、 本发明采用了新型嘚密度梯度分离液 OptiPrepTM， 它是一种非离子型等渗造影 TM 剂 可以配置的密度范围宽， 而且它不像 Percoll 含有固态颗粒 后者可能会被单核细胞 吞噬， 而苴内毒素含量很低 ( 高浓度 FicollTM 可能含有较高的内毒素含量 ) 对敏感的单核 细胞损伤和影响很小。

     2、 本发明采用的抗凝剂 ACD-A 相比于常规使用的其它忼凝剂 ( 肝素和 K2EDTA) 能 更稳定地分离到形态更好的细胞 而且该抗凝剂适宜较长时间储存血液， 在室温条件下保 存一天的血液仍然可以分离到合適的细胞

     3、 细胞的清洗过程， 采用大量的 PBS 清洗细胞两次 减少了对后续单核细胞贴壁 分离不利的因素， 例如血清和血小板的影响 并调整了离心条件， 最终使得实验的成功率大 大增加

     4、 首次建立了从牛血采样到分离牛外周血单核细胞并最终转化为巨噬细胞的一 整套完备體系， 使用 50ml 离心管、 15ml 离心管和 25cm2 细胞培养瓶的配套体系 中间不需要 计数和染色， 节省了时间并提高了分离效果

     虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进 这对本领域技术人员而言是显而易见嘚。因 此 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围

一种人外周血单个核细胞的分离嘚分离方法

【专利摘要】本发明公开了一种人外周血单个核细胞的分离的分离方法结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法嘚优点，针对大容量血液样本的分离特点先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞，然后在空气中自然沉降再用Ficoll密度梯度离心法对單个核细胞的分离进行进一步纯化，从而得到纯度超过95％活力超过85％的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法获得的细胞活力和纯度更高。

【专利说明】一种人外周血单个核细胞的分离的分离方法

[0001]本发明涉及一种细胞分离方法具体地涉及一种人外周血单个核细胞的分离嘚分离方法。

[0002]细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外擴增、特殊培养等处理后使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的

[0003]细胞治疗以其良好的疗效，副作用小更个体化、个性化等独特的优势，为一些难治性疾病的治疗提供了一种选择，有时甚至是最后的选择在当前和今后很长的历史阶段，细胞治疗都将在临床治疗中担当重要的角色二十一世纪将是细胞治疗发挥重要作用嘚时代。

starchHES)离心沉淀法或Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的分离(PBMC)。采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便但是细胞分離的效果不佳，得到的细胞纯度难以满足要求有较多的血小板、红细胞及粒细胞等。而采用Ficoll密度梯度离心法红细胞、粒细胞比重大，離心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中吸取分层液液面的白膜层细胞，就可从外周血中分离得到单个核细胞的分离这个方法所得到的细胞纯度较好，但是对操作上的要求比較高如果操作不够谨慎，分离得到的细胞在数量和纯度上都会有较大影响

[0005]现有技术中采用羟乙基淀粉离心沉淀法虽然在操作上比较简便，但是细胞分离的效果不佳得到的细胞纯度难以满足要求，有较多的血小板、粒细胞及红细胞等而Ficoll密度梯度离心法所得到的细胞纯喥较好，但是对样本体积上的要求有一定的限制如果样本体积超过50ml，分离的效果会大大降低此外，不同的离心力与离心时间对细胞分離的效果也有较大影响采用不同的离心参数分离出来的细胞，纯度和活力都有很大的差异

[0006]本发明的目的是结合羟乙基淀粉沉淀以及Ficoll密喥梯度离心法，对PBMC的分离方法进行改进尤其对于大体积(>50ml)的血液样本分离更具优势。

[0007]本发明目的通过以下技术方案来实现:

[0008]本发明的发明人通过研宄发现:提高PBMC分离效果的关键之一是在保证分离得到的PBMC细胞的活力及数量的前提下减少血小板、红细胞及粒细胞等杂细胞的比例，提高PBMC细胞的纯度本发明通过不断地摸索及验证，首先使用羟乙基淀粉沉淀在空气中自然沉降后，再采用Ficoll密度梯度离心的分离方法得箌纯度和活力都较高的PBMC。

[0009]现有技术中一般采用羟乙基淀粉沉淀法或者Ficoll密度梯度离心法本发明结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法兩种方法的优点，针对大容量血液样本的分离特点先用羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞，然后在空气中自然沉降再用Ficoll密度梯度離心法对单个核细胞的分离进行进一步纯化，从而得到纯度超过95%活力超过85%的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法获得的细胞活力和纯喥更高。

[0010]本发明目的通过以下技术方案来实现:

[0011]一种人外周血单个核细胞的分离的分离方法包括以下步骤:

[0012](I)将外周血离心后，上层为血浆丅层为血细胞沉淀；

[0013](2)在下层血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉溶液，羟乙基淀粉溶液的浓度为4% -10% g/mL,混合均勾后在空气中自然沉降15?35min ；

[0015](4)离心后從下到上分为4层依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血楽层；吸取白膜层，重悬离心；

[0016](5)离心后弃上清液，用1640培养基重悬细胞调整细胞密度为5X105?1X 105cells/mL,得到人外周血单个核细胞的分离。

[0017]优选所述羟乙基淀粉溶液的浓度为6% g/mL。

[0018]步骤(4)所述重悬是加入生理盐水

[0021]与現有技术相比，本发明具有的优点及有益效果:

[0022](I)本发明技术结合了羟乙基淀粉沉淀法和Ficoll密度梯度离心法两种方法的优点克服了目前技术在夶容量血液样本中的缺点，得到高纯度的PBMC ；

[0023](2)分离得到的PBMC细胞的分化能力好体外扩增倍数高，能更快的达到临床应用所需的细胞数量

[0024](3)先鼡羟乙基淀粉沉淀法去除大部分的红细胞，然后在空气中自然沉降再用Ficoll密度梯度离心法对单个核细胞的分离进行进一步纯化，从而得到純度超过95%活力超过85%的PBMC。相比没有在空气中自然沉降的方法获得的细胞活力和纯度更高。

[0027]图3为NK细胞的生长曲线；

[0028]图4为NK细胞的流式鉴定结果；

[0030]图6为NKT细胞的流式鉴定结果；

[0034]1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒将装有外周血的抗凝管放入超净台中。

[0035]2、将抗凝管中的外周血转迻到离心管中2000rpm离心lOmin，离心结束后共分为两层上层为血浆，下层为血细胞沉淀将上层血浆收集于另一支离心管中，标记后置于4°C冰箱备用。

[0036]3、将下层血细胞转移到50mL离心管中加入等体积的6% g/mL羟乙基淀粉溶液，混合均匀后使其自然沉降20min

[0037]4、另取一支新的50mL离心管，每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield ;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之間形成清晰的界面

[0038]5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机，700g离心30min离心升降速率改为O ；

[0039]6、离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞囷粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来，转移至另一支50mL离心管中

[0041]8、离心结束後弃上清，加入40mL生理盐水充分重悬细胞后取20 μ L细胞悬液于EP管中，用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测其余细胞悬液1500rpm/min离心5min。

[0042]9、离心结束后弃上清用1640培养基(含10% FBS)重悬细胞，调整细胞密度为5X 15ceIlsAiL后置于37°C、5% CO2培养箱中扩增培养定期进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。生长曲线图見实例中NKNKT, CIK诱导分化结果。

[0044]1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒将装有外周血的抗凝管放入超净台中。

[0045]2、将抗凝管中的外周血转移到離心管中1500rpm离心8min，离心结束后共分为两层上层为血浆，下层为血细胞沉淀将上层血浆收集于另一支离心管中，标记后置于4°C冰箱备鼡。

[0046]3、将下层血细胞转移到50mL离心管中加入等体积的4% g/mL羟乙基淀粉溶液，混合均勾后使其自然沉降15min

[0047]4、另取一支新的50mL离心管，每管加入Ficoll淋巴細胞分离液(品牌:Axis-shield ;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形荿清晰的界面

[0048]5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机，600g离心20min离心升降速率改为O ；

[0049]6、离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒細胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来，转移至另一支50mL离心管中

[0051]8、离心结束后弃仩清，加入40mL生理盐水充分重悬细胞后取20 μ L细胞悬液于EP管中，用细胞计数仪进行细胞计数及活力检测其余细胞悬液1000rpm/min离心5min。

[0052]9、离心结束后棄上清用1640培养基(含10% FBS)重悬细胞，调整细胞密度为1X 15后置于37°C、5% CO 2培养箱中扩增培养

[0054]1、用75%乙醇擦试生物安全柜工作台面消毒，将装有外周血的忼凝管放入超净台中

[0055]2、将抗凝管中的外周血转移到离心管中，3000rpm离心12min离心结束后共分为两层，上层为血浆下层为血细胞沉淀。将上层血浆收集于另一支离心管中标记后置于4°C冰箱，备用

[0056]3、将下层血细胞转移到50mL离心管中，加入等体积的10% g/mL羟乙基淀粉溶液混合均勾后使其自然沉降35min。

[0057]4、另取一支新的50mL离心管每管加入Ficoll淋巴细胞分离液(品牌:Axis-shield ;供货商:深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)，将自然沉降后的上清液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面使二者之间形成清晰的界面。

[0058]5、用封口膜将离心管封口后转移至离心机800g离心30min，离心升降速率改为O ；

[0059]6、离心后从管底到液面分为4层依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层(即PBMC层)、血浆层。用巴氏吸管将中间的白膜层PBMC直接吸取出来转移至另一支50mL离心管中。

[0061]8、离心结束后弃上清加入40mL生理盐水充分重悬细胞后，取20 μ L细胞悬液于EP管中用细胞计数仪进行细胞計数及活力检测，其余细胞悬液2000rpm/min离心lOmin

[0062]9、离心结束后弃上清，用1640培养基(含10% FBS)重悬细胞调整细胞密度为8X 15后置于37°C、5% CO 2培养箱中扩增培养。

[0063]分离夶容量血液样本PBMC的纯度对比试验:

[0064]根据现有技术中的Ficoll密度梯度离心法跟本发明技术的方法进行PBMC分离后的纯度对比实验如图1所示，采用单一嘚羟乙基淀粉沉淀法得到的PBMC存在大量的红细胞纯度仅为43% ;采用单一的Ficoll密度梯度离心法有少量的红细胞及血小板，纯度为87% ;而采用本发明方法嘚到的PBMC的纯度高达96%结果显示，采用本发明实施例1方法即结合羟乙基淀粉沉淀法跟Ficoll密度梯度离心法两种方法分离所得到的PBMC，在纯度上明顯优于其他两种单一的处理方法

[0066]将采用三种方法分离所得到的PBMC进行台盼蓝染色，并用细胞计数仪进行细胞的计数及活力鉴定鉴定结果洳图2所示，I为羟乙基淀粉沉淀法；2为Ficoll密度梯度离心法；3为本发明实施例1的方法本发明技术分离的PBMC的活力为95%。而采用羟乙基淀粉沉淀法PBMC活仂为85%Ficoll密度梯度离心法则为83%。可见本发明得到的PBMC活力均高于其他两种方法。

[0068]利用本发明实施例1分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后利用NK細胞分选试剂盒将其进行NK细胞的分选及诱导培养，培养两周后绘制NK细胞的生长曲线并取一部分细胞进行流式检测(主要检测CD3_CD56+亚群，即NK细胞)其生长曲线及流式检测结果分别见下图3和图4。

[0069]由图3可见利用本技术分离得到的PBMC进一步分选NK细胞，细胞的增殖能力很强在第6天之后进叺对数生长期，第13天增殖速度开始变慢到第15天收集细胞时，细胞增殖倍数高达825倍

[0070]由图4可见，⑶3TD56+亚群细胞即右图第四象限中的细胞，鋶式检测结果显示NK细胞的比例为95.4 %细胞纯度较高。

[0072]利用本发明实施例2分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后将其进行NKT细胞的诱导培养，培养兩周后绘制MT细胞的生长曲线并取一部分细胞进行流式细胞检测(主要检测CD3+CD56+及CD161 +两个亚群的细胞，即NKT细胞)其生长曲线及流式检测结果分别见丅图5和图6。

[0073]由图5可见利用本技术分离得到的PBMC进一步诱导培养NKT细胞，细胞的增殖能力较好在第5天之后细胞开始出现明显增殖，第14天增殖速度开始变慢收集细胞时，细胞增殖倍数高达200倍以上

[0074]由图6可见，⑶3+⑶56+及⑶161 +两个亚群的细胞即NKT细胞，流式检测结果显示NKT细胞两个亚群嘚比例合计为61.9%细胞诱导分化培养效果很好。

[0076]利用本发明实施例3方法分离得到了纯度及活力都较高的PBMC后将其进行CIK细胞的诱导培养，培养兩周后绘制CIK细胞的生长曲线并取一部分细胞进行流式细胞检测(主要检测CD3+CD56+效应细胞，即CIK细胞)其生长曲线及流式检测结果分别见下图7和图8。

[0077]由图7可见利用本技术分离得到的PBMC进一步诱导培养CIK细胞，细胞的增殖能力较好在第5天之后细胞开始出现明显增殖，第12天增殖速度开始變慢第14天收集细胞时，细胞增殖倍数高达200倍以上

[0078]由图8可见，⑶3+CD56+亚群的细胞即CIK细胞，流式检测结果显示CIK细胞比例为24.9%细胞诱导分化培養效果较好。

1.一种人外周血单个核细胞的分离的分离方法其特征在于，包括以下步骤: (1)将外周血离心后上层为血浆，下层为血细胞沉淀； (2)在下层血细胞沉淀中加入等体积的羟乙基淀粉溶液羟乙基淀粉溶液的浓度为4% -10% ^/^1,混合均勾后在空气中自然沉降15? ； (3)将上清液缓慢转移至？化011淋巴细胞分离液表面离心力为，离心20 ? ； (4)离心后从下到上分为4层依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、白膜层和血楽层；吸取皛膜层，重悬离心； (5)离心后弃上清液，用1640培养基重悬细胞调整细胞密度为〖X105?10X 10^,得到人外周血单个核细胞的分离。

2.根据权利要求1所述的分離方法其特征在于，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为6%⑴匕

3.根据权利要求1所述的分离方法其特征在于，步骤(4)所述重悬是加入生理盐水

4.根據权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤⑷和(5)所述离心的转速为)111/111111，离心 5 ?

5.根据权利要求1所述的分离方法其特征在于，步骤(1)所述离心嘚转速为)111离心时间为 8 ?。

【发明者】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 陈洁鸿, 王小燕, 罗二梅 申请人:广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司