原标题：RNA修饰分析方法研究进展(1)——整体全分析法
m6A专题
核酸表观遗传修饰能调控真核生物的基因表达, 对遗传、生长和疾病发生等方面有重要影响[1,2]。近年来, RNA表观遗传修饰研究取得了很大进展[3]。天然存在的RNA分子含有各种化学修饰。目前在RNA分子中共鉴定了150多个结构不同的修饰类型[4]。
几乎所有类型的RNA中均含有修饰。目前在转运RNA (Transfer RNA, tRNA) 上发现的修饰种类最多[5]。核糖体RNA (Ribosomal RNA, rRNA) 是细胞中含量最丰富的RNA, 也含有许多位于不同序列和结构上的修饰类型[6]。除了在这些丰富的非编码RNA (Non-coding RNA, ncRNA) 中发现多种修饰外[7],
近年来研究者在体内丰度较低的RNA类型中也发现越来越多的修饰, 包括信使RNA (Messenger RNA, mRNA) [8]、小核RNA (Small nuclear RNA, snRNA) [9]、核仁小RNA[9]和微小RNA (microRNA, miRNA) [10,11]等。甚至环状RNA中也存在RNA修饰, 如N6-Methyladenosine
(m6A) [12]。研究表明RNA修饰在真核生物的生命调控中发挥了重要作用[13]。然而, 由于缺乏合适的检测方法, 目前对很多RNA修饰, 特别是对低丰度的RNA修饰的功能了解甚少[14]。阐明RNA修饰的生物学意义需要能特异性检测、量化修饰核苷并对其分布进行定位的高灵敏度分析工具。近几年, 用于RNA修饰量化和定位的分析方法已取得了很大进展。
RNA修饰的分析方法主要分为RNA修饰的全分析和定位分析两大类。本文总结了这两类分析方法的最新进展, 并讨论了其优点和不足。通过了解每种分析方法的特性, 研究人员可以选择合适的分析方法。此外, 随着技术的进步, 更多新的RNA修饰会被发现, RNA修饰的生理功能会被进一步认识。
1. RNA修饰的全分析
用于RNA修饰全分析的方法主要包括毛细管电泳 (CE) 、液相色谱 (LC) 、液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 、薄层色谱 (TLC) 、荧光标记和免疫检测等方法。RNA修饰的全分析需要酶/化学处理释放RNA组分, 例如核苷酸、核苷或核酸碱基, 随后采用各种分析方法进行检测。
1.1 毛细管电泳法
毛细管电泳是一类以毛细管为分离介质、以高压直流电场为驱动力的分离技术, 其原理是基于电场中带电粒子的分离, 可与紫外检测、质谱检测和激光诱导荧光检测等技术耦合。
研究表明尿液样品中的修饰核苷可作为潜在的癌症生物标志物。Jiang等[15]开发了毛细管电泳结合紫外检测技术分离和定量尿样中包括修饰核苷在内的10种核苷, 检测限 (LODs) 小于2.0μmol/L。与以往的研究相比, 该方法更简单、快速, 可用于尿样中修饰核苷的量化。最近, Stephen等[16]提出了一种使用毛细管电泳结合激光诱导荧光 (CE-LIF)
分析腺嘌呤核苷 (Adenosine, A) 和次黄嘌呤核苷 (Inosine, I) 的方法。首先使用2, 4, 6-三硝基苯磺酸衍生A和I, 得到三硝基苯基的荧光络合物TNP-A和TNP-I。TNP-A和TNP-I进一步与γ-环糊精形成配合物, 荧光增强约25倍, 最后通过CE-LIF进行检测分析。该法可同时分析和定量大鼠前脑样品中的A和I,
LODs分别为1.6、4μmol/L。此外, Khan等[17]报道了一种毛细管电泳结合质谱 (CE-MS) 直接分析生物样品中miRNA的方法。通过CE-MS方法, 不仅能够检测到从B细胞慢性淋巴细胞白血病血清中分离的两种内源性的循环miRNA (isomiR-16-5p和miR-21-5p) ,
而且能够实现miRNA修饰的无标记定量。已有研究表明miRNA的序列和内容与某些癌症有关[18], 说明CE-MS方法分析miRNA具有临床诊断的多功能生物检测的应用潜力。
虽然CE方法可快速分离分析物, 且能提供良好的分离度, 但稳定性和重现性欠缺。此外, CE方法的样品上样量有限, 限制了其灵敏度, 有待进一步改进。
1.2 液相色谱法
液相色谱技术发展比较成熟, 被普遍应用于核酸修饰的分析。通过液相色谱技术检测RNA修饰的方法是基于酶或化学水解产生的RNA组分的色谱分离。若液相色谱对不同的RNA组分无法进行有效分离, 会造成无法对RNA修饰进行定性分析。因此, 基线分离对基于液相色谱的分析方法至关重要。
基于液相色谱的方法常用于核苷的早期研究。Desrosiers等[19]使用二乙氨乙基纤维素色谱法结合放射性同位素标记研究来自Novikoff肝癌细胞mRNA中的甲基化。同位素标记的RNA被完全酶解成核苷后, 通过液相色谱分析RNA中甲基化修饰核苷的组成, 并与标准品比对, 鉴定了mRNA中存在的4种2’;-O-甲基核苷, 分别为2’;-O-Methyladenosine
(Am) 、2’;-O-Methylguanosine (Gm) 、2’;-O-Methylcytidine (Cm) 和2’;-O-Methyluridine (Um) 。此外, 还在mRNA上发现了m6A。Buck等[20]采用高效液相色谱结合紫外检测 (HPLC-UV) 对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌 (E.coli)
tRNA中的29个修饰核苷进行了分析。该方法快速、灵敏且色谱分辨率高。Gehrke等[21]系统地介绍了用于分析RNA核苷组成的HPLC-UV方法, 并开发了3种优化的反相液相色谱系统, 其在分辨率、分析速度和灵敏度上均有改善。优化的方法可从约1μg tRNA中定量31种不同的核苷, 且检测的相对误差均小于5%。
基于液相色谱的方法操作简单、重复性好, 能用于RNA修饰的定量分析, 但其定性能力较弱。为提高对RNA修饰的定性分析能力, 液相色谱常与定性能力较好的质谱联用, 从而实现对RNA修饰的准确定性和定量分析, 液相色谱-质谱联用法也是目前RNA修饰全分析的主要研究方法。
1.3 质谱分析法
质谱分析通过测定分子质荷比实现对样品的分析。与正常核苷相比, 几乎所有的修饰核苷均有相对分子质量上的增加, 因此可运用质谱鉴定和表征修饰核苷[22]。质谱分析法已被广泛用于核酸碱基、核苷和核苷酸的研究[23-27]。在近10多年中, 基于质谱的分析方法和软件开发取得了很大进展,
能提供有关RNA修饰的定性和定量信息。基于质谱的分析方法已被证明是用于发现和鉴定新的RNA修饰最有力的工具之一[28,29]。
1.3.1 液相色谱-质谱分析法
由于良好的选择性和灵敏度, LC-MS被广泛用于化合物的定性和定量分析[30-35]。基于LC-MS的方法主要是在核苷水平上对RNA修饰进行研究, 因此在分析前需将待测的核酸样品酶解为核苷[36-41]。修饰核苷的鉴定通常基于与标准品的比对或与RNA修饰数据库的比对。
Zhao等[42]开发了一种超高效液相色谱 (UHPLC) 与飞行时间质谱 (Time-of-flight mass spectrometry) 联用的方法分析尿液中含有顺式二羟基结构的核苷和其他代谢物。与HPLC相比, UHPLC的分辨率和灵敏度更高, 能检测到更多潜在的修饰核苷。Chan等[43]使用LC-MS分析了牛分枝杆菌BCG (Bacille
Calmette-Guérin) tRNA中的修饰核苷, 将目标tRNA酶解成核苷, 再通过多反应监测 (MRM) 模式的LC-MS进行分析。通过与标准品比对鉴定了12个修饰核苷;并与RNA修饰数据库比对, 进一步鉴定了5个修饰核苷。Su等[44]提出了LC-MS结合动态MRM模式定量分析tRNA中修饰核苷的方法。该方法用HPLC对tRNA进行纯化后,
再用反相HPLC分离酶解的核苷, 最后通过动态MRM模式的LC-MS对单个核苷进行鉴定和定量。该方法可在15 min内实现对数微克tRNA中修饰核苷的相对定量分析。Magana等[45]通过液相色谱-离子阱串联质谱法研究了Cu
O纳米颗粒对L.sativum中核酸甲基化的影响。通过将在电喷雾离子化中形成的质子结合的二聚体作为MRM定量的前体离子来增强对含胞嘧啶的核苷的选择性。该研究在DNA和RNA中分别发现了13.03%和0.92%的甲基化胞嘧啶。
最近, 武汉大学袁必锋课题组开发并建立了一种通过液相色谱-串联质谱 (LC-ESI-MS/MS) 定量分析单细胞中DNA和RNA甲基化的方法[46]。首先建立了一个高效的循环肿瘤细胞 (Circulating tumor cells, CTCs) 捕获系统, 之后在离心管中完成CTCs裂解、核酸酶解、核苷提取一系列步骤,
最后通过LC-ESI-MS/MS进行分析。该方法实现了在单细胞水平上检测5-Methylcytidine (5-mr C) 、m6A和5-Methyl-2’-deoxycytidine (5-md C) 。
为进一步提高修饰核苷的检测灵敏度, 特别是低丰度的修饰核苷, 需对样品前处理过程进行优化[47,48]。武汉大学袁必锋课题组制备了毛细管整体柱, 并将其作为在线固相微萃取柱 (SPME) , 建立了一种在线SPME-LC-MS/MS分析修饰核苷的方法[49,50]。结果显示, 所制备的毛细管整体柱对含有顺式二羟基结构的化合物具有优异的选择性,
能成功用于人体尿液中含有顺式二羟基结构的修饰核苷类化合物和核糖类代谢物的系统分析。运用此方法对比了健康人和癌症患者尿液中含顺式二羟基结构的修饰核苷的相对含量, 发现了几种潜在的癌症生物标志物, 从而为癌症生物标志物的发现提供了一个很好的分析平台[51,52]。
1.3.2 稳定同位素标记-质谱分析法
质谱信号波动或基质效应常引起定量不准确, 可采用稳定同位素标记的核苷作为内标来校正, 以改善定量分析的准确性。Dalluge等[53]使用同位素稀释结合LC-MS定量分析RNA中的二氢尿嘧啶 (Dihydrouridine) 修饰。首先将RNA样品酶解成核苷, 然后加入[1, 3-15N2]-二氢尿嘧啶 ([1, 3-15N2]-Dihydrouridine) 和[1,
3-15N2]-尿嘧啶 ([1, 3-15N2]-Uridine) 作为内标, 最后通过选择离子监测模式的LC-MS对标记和未标记的核苷的质子化分子离子进行分析。
然而许多修饰核苷尚无商品化的稳定同位素标记的标准品[28]。为了解决此问题, Deft等[28]采用代谢标记的方法获得稳定同位素标记的修饰核苷, 并将其用作参考标准, 通过非靶向液相色谱-串联高分辨质谱 (LC-MS/HRMS) 对修饰核苷进行检测。该方法使用在含有D-[13C6]-葡萄糖和氨基酸的培养基中生长的重标记和未标记的大肠杆菌分别饲喂秀丽隐杆线虫
(C.elegans) 幼虫。从标记的或未标记的C.elegans中分离总RNA, 并进行LC-MS/HRMS分析。分别鉴定出C.elegans大RNA片段 (大于200 nt) 中的21个修饰和小RNA片段 (小于200 nt) 中的26个修饰,
并发现一些RNA修饰对环境胁迫具有动态响应。Huber等[54]则建立了一种双稳定同位素标记结合LC-MS/HRMS分析RNA修饰的方法, 采用含稳定同位素标记的[甲基-13CD3]-L-甲硫氨酸的培养基培养人类HEK293T细胞, 以代谢产生RNA中13CD3标记的5-mr C及其氧化衍生物;用含有未标记的L-甲硫氨酸和[1, 3-15N2]-胞嘧啶苷 ([1,
3-15N2]-Cytidine) 的培养基培养人类HEK293T细胞, 以代谢产生RNA中15N2标记的5-mr C及其氧化衍生物。随后对酶解产生的核苷进行LC-MS分析。该方法成功在哺乳动物的RNA中发现了5-mr C的第2个氧化衍生物2’;-O-Methyl-5-hydroxymethylcytidine (hm5Cm) , 并定量了其在高等生物体内的含量。
1.3.3 化学标记-质谱分析法
不同类型的RNA中修饰的类型不同, 且修饰的丰度也不同。生物体内许多RNA修饰的丰度均较低, 传统的LC-MS难以实现对低丰度RNA修饰的灵敏检测。为提高对分析物的检测灵敏度, 研究者建立了化学标记结合LC-MS的分析方法[30,31,55,56,57,58,59]。Wrobel等[60]提出了一种基于化学标记结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱
(HPLC-ICP-MS) 高灵敏分析甲基化胞苷和其他核糖核苷的方法, 通过在顺式二羟基核糖基团、六价Os (K2OsO2(OH)4) 和四甲基乙二胺之间形成三元复合物使核糖残基标记上六价Os后, 再采用HPLC-ICP-MS检测分析Os标记的核苷。该方法实现了对Cytidine (C) 、Uridine (U) 、5-mr C、Guanosine (G)
的高灵敏分析。当进样量为100μL时, 上述4种核苷的LODs分别为24、38、21、28 pmol/L。
武汉大学袁必锋课题组建立了一种氧化衍生化结合LC-MS的新方法检测DNA和RNA中的5-Hydroxymethylcytosine (5-hm C) 和5-Formylcytosine (5-fo C) [61]。该方法用Mn O2将5-hm C氧化为5-fo C, 5-fo C进一步用丹磺酰肼标记。由于丹磺酰肼上的酰肼基团易与5-fo C上的醛基反应,
生成含有易带电的叔胺基团的腙衍生物, 该衍生基团能够提高5-fo C的电离效率, 进而提高了LC-ESI-MS/MS检测5-fo C的灵敏度。使用该方法发现了哺乳动物的RNA中存在5-fo C。武汉大学袁必锋课题组还建立了化学标记结合LC-MS同时测定RNA中5-Methylcytosine (5-m C) 、5-hm C、5-fo
C和5-Carboxylcytosine (5-ca C) 的方法[62,63], 通过使用2-溴-1- (4-二乙基氨基苯基) -乙酮标记RNA修饰, 检测灵敏度增加了70~313倍。通过此方法, 除了在哺乳动物RNA中检出5-ca C外, 还发现人的结直肠癌和肝癌组织中5-hm C含量明显低于癌旁组织 (正常组织) , 表明RNA中的5-hm
C可能参与了肿瘤形成和发展过程的调控。
此外, 使用吉拉德P试剂标记核酸修饰, 武汉大学袁必锋课题组还建立了化学标记结合SPME-UHPLC-ESI-MS/MS法同时灵敏检测DNA和RNA中的6种甲酰化核苷:5-Formyl-2'-deoxycytidine (5-fodC) 、5-Formylcytidine (5-forC) 、5-Formyl-2'-deoxyuridine (5-fodU)
、5-Formyluridine (5-forU) 、2'-O-Methyl-5-formylcytidine (5-forCm) 和2'-O-Methyl-5-formyluridine (5-forUm) [64]。该方法对核苷的检测灵敏度提高了307~884倍, 并在人的细胞和组织中检测到5-forU、5-forCm和5-forUm。
1.3.4 离子迁移谱-质谱分析法
传统的定性和定量RNA修饰的分析方法依赖于液相色谱和毛细管电泳来减少背景, 在分析前需进行RNA酶解产物的分离[65]。为简化分析过程, Fabris等[66]提出了离子迁移谱-质谱法 (IMS-MS) 对核糖核苷酸混合物进行直接分析。基于IMS-MS的方法提供了一个额外的分离维度, 以便根据迁移率和碎片特征区分分析物。使用IMS-MS,
Fabris等成功分析了相似或相同元素组成的核苷酸混合物[66], 并绘制了不同细胞类型和代谢状态的核苷酸修饰谱图[65], 为探索修饰的生物学意义提供了有价值的信息。
1.4 薄层色谱法
TLC用于分析核苷酸、核苷和碱基已有半个多世纪的历史。基于TLC分析RNA修饰是通过对比相应的对照物的迁移率进行定性, 通过测定斑点强度进行定量。TLC分离可在一维或二维 (Two-dimensional thin layer chromatography, 2D-TLC) 中进行, 后者可以提供更好的分离度,
已被广泛用于分析各种RNA的修饰[67,68]。由于TLC的方法灵敏度较低, 因此需要结合放射性同位素 (如32P) 标记, 通过放射自显影检测提高其灵敏度。通常用核糖核酸酶A (Ribonuclease A, RNase A) 或RNase T1、RNase T2将RNA酶切成寡核苷酸, 再通过T4多核苷酸激酶用[γ32P]ATP标记寡核苷酸的5’ ;末端后,
使用RNase P1将标记的寡核苷酸酶解为核苷酸单磷酸, 最后采用TLC分析32P标记的核苷酸单磷酸。Zhong等[69]使用32P标记的2D-TLC方法在拟南芥mRNA中鉴定了m6A, 且证明m6A的含量与文献报道的动物细胞中含量相似。TLC方法分析RNA修饰, 其特点是成本低、装置简单、无需昂贵仪器、能实现快速分离,
但由于其分析过程较繁琐、涉及放射性标记、准确性有限, 因此常用于定性研究。
1.5 荧光标记法
除了化学标记外, 荧光标记也能提高RNA修饰的检测灵敏度。Cornelius等[70]使用BODIPY FL EDA标记核糖核苷酸的5’ ;-单磷酸, 开发了一种灵敏分析RNA组分的CE-LIF方法。RNA或寡核糖核苷酸被RNase P1酶解成核苷酸后, 通过CE-LIF检测荧光标记的BODIPY偶联物。使用该方法检测并鉴定了果蝇、人肝、人肾和酿酒酵母RNA中的修饰核苷,
包括I、Xanthosine (X) 、Pseudouridine (Ψ) 和Am, LODs为80~200 pmol/L。该研究表明使用BODIPY FL EDA荧光标记核苷酸结合CE-LIF检测具有高精确度和高灵敏度测定RNA组成的潜力。为提高液相色谱检测DNA甲基化的分析灵敏度,
Torres等[71]开发了一种使用2-溴苯乙酮选择性衍生化胞嘧啶并结合反相HPLC荧光分光光度法检测DNA甲基化的方法, 也适用于RNA甲基化修饰的测定。采用2-溴苯乙酮标记后, 5-mr C的LOD可达16.6 fmol, 与LC-MS方法相当。使用该方法, Barrientos等[72]分析了L.sativum RNA中的总体甲基化水平, 并进一步评估了Cd (Ⅱ)
和Se (Ⅳ) 胁迫对L.sativum RNA甲基化的影响。
1.6 免疫检测法
免疫检测法的基本原理是抗体-抗原的特异性结合。1992年, Reynaud等[73]利用单克隆抗体检测了尿液中5-mr C、N4-Acetylcytidine (ac4C) 、1-Methylinosine (m1I) 、1-Methyladenosine (m1A) 、7-Methylguanosine (m7G)
和Ψ6种修饰核苷。通过特异性的单克隆抗体对修饰核苷进行定性分析;通过竞争性的固相酶联免疫测定法进行定量分析。使用这种基于免疫的方法, 尿液无需处理可直接分析, 且修饰核苷的检测灵敏度在pmol范围内。使用相同的免疫学方法, Sasco等[74]对68例乳腺癌患者尿液中的这6种修饰核苷进行了评估,
发现乳腺癌患者尿液中的m1I和m1A显著高于正常人。Miao等[75]建立了使用斑点杂交技术分析RNA羟甲基修饰的方法, 提出5-hm C存在于小鼠大脑组织的RNA中, 并发现其在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶诱导的帕金森疾病小鼠模型中含量降低, 暗示RNA中的5-hm C在神经系统疾病上可能发挥着与DNA中的5-hm
C相似的作用。Fakruddin等[76]通过基于免疫的检测方法证明了Cdk5rap1酶介导的修饰核苷2-Methylthio-N6-isopentenyladenosine (ms2i6A) 只存在线粒体tRNA中, 而不存在于细胞核RNA中。
基于免疫的检测方法简化了样品前处理过程, 缩短了样品前处理时间, 但抗体的高度特异性是此方法用于准确分析修饰核苷的前提条件。
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专利名称：血清中微小核糖核酸的检测方法和用于检测的试剂盒、生物芯片及其制作和应用方法技术领域：本发明属于生物技术领域，具体涉及人和动物血清中微小核糖核酸分子的 检测方法、用于检测血清中微小核糖核酸的试剂盒或生物芯片以及试剂盒和生 物芯片的制作和应用方法。背景技术：微小核糖核酸，英文名为microRNA，简写作raiRNA，是一类长约19至23个核 苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植 物细胞中，近五年来在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小 核糖核酸分子。微小核糖核酸通过识别靶mRNA的3'端非翻译序列，与之不完全 互补，从而抑制靶mRNA的翻译。其序列、结构、丰度和表达方式的多样性使微
小核糖核酸成为信使RNA强有力的调节因子并在基因表达调控领域中起着超乎 想象的重要作用。微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，涉及生物个体发育； 组织分化；细胞调亡以及能量代谢等生命活动的方方面面。同时，微小核糖核 酸也与许多疾病的发生及发展存在千丝万缕的联系，在发生某种疾病时总有一 些微小核糖核酸表达量是上调的， 一些是下调的。微小核糖核酸与疾病的关联 有两个层面首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因
子以及促进因子都有可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发 生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或 者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游 一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次， 微小核糖核酸的变化也可以是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时，
会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核 糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。最近研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中几种微小核糖 核酸的表达水平均有不同程度的下调；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中微小核糖 核酸表达时发现有若干组织特定的微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发
生了变化。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等 心血管疾病的发生和发展并且与二型糖尿病等代谢性疾病有密切关联。这些结果 提示微小核糖核酸表达与疾病发生和发展之间存在必然联系。微小核糖核酸完全 可以作为一类新的疾病标志物，相比于传统的病理切片或单一使用的生化指标等 手段，能更加准确帮助疾病定性，诊断疾病的发展阶段，判断并发症的发生和恶
性疾病复发率及疾病的预后，并诊断药效和疗效。此外，微小核糖核酸还是潜在 的药物靶点，如果抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸和过表达下调的微小核糖 核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。然而，因为人和动物微小核糖核 酸的研究工作才开展4年左右，目前还没有相关的微小核糖核酸试剂盒。因此， 需要我们更深入研究肿瘤，各种急慢性传染病和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，
免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统疾病等)过程中微小核糖核酸的特 异变化，对微小核糖核酸的进一步探索将为我们提供疾病诊疗新途径。微小核糖 核酸试剂盒的研发和在临床医学的应用将具产生巨大经济效益和社会前景。
发明内容本发明需要解决的问题是通过研究各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性 肝炎，艾次滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系 统疾病，内分泌系统疾病等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，得到在疾病 及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，应用于疾病鉴 定和病程，恶性疾病复发率及预后和药效的诊断相关的PCR试剂盒和生物芯片，
以提高疾病的早期发现率以及确诊的准确性和疗效。实现本发明目的的一种技术方案为 血清中微小核糖核酸分子的检测方法1) 收集血清样本；2) 将10 u 1血清作为buffer进行逆转录反应，来制备cDNA样品；3) 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；4) 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；5) EB染色后在紫外灯下观察结果。所述步骤5)之后还包括下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清 样本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。实现本发明目的的另一种技术方案为血清中微小核糖核酸分子的检测方法1、 使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA (10ml血清通常能富集 约10ug左右的RNA);2、 通过RNA逆转录反应得到cDNA;3、 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；4、 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；5、 EB染色后在紫外灯下观察结果。所述步骤5之后还包括下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清样 本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。在上述检测方法中，我们首次使用了 RT-PCR技术来发现并证明人和动物血 清中能检测到各种微小核糖核酸，而且它们具有不同的组织来源和表达丰度。 其次，为了研究在各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等) 和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统 疾病等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，我们选取再生障碍性贫血、乳腺
癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病病人血清样品，同时用人全部五百多 个成熟体微小核糖核酸设计引物进行了血清微小核糖核酸的定量PCR实验，以得 到与疾病相关的差异表达的一类血清微小核糖核酸探针。我们直接用病人血清进 行定量PCR实验，用荧光染料EVA GREEN检测并比较相对于正常血清各种疾病血 清中微小核糖核酸的量的变化。一种用于血清中微小核糖核酸检测的生物芯片，包括人血清中能正常检测到 的全部微小核糖核酸的探针。此芯片能高通量地筛选血清中稳定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清 中微小核糖核酸的整体变化预测和诊断疾病。最后我们通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选得到和再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病等疾病相关的血清微小核糖核酸， 作为预测疾病以及诊断病变程度的探针，来制备PCR试剂盒。一种用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒，包括一批血清微小核糖核酸探 针以及Taq酶、dNTP试剂。目前对疾病进行临床诊断的生物化学及分子生物学手段还比较繁琐和粗糙， 比如对于癌症的诊断，需要将手术标本进行组织细胞学染色检验，过程复杂又耗 时耗力。此外，目前尚没有一套早期预测及诊断重症疾病的简易又精确的方法。 鉴于目前疾病诊断方法的单一以及早期发现与预测的困难，我们亟待找到一种比 目前现有方法都更简单可靠同时又简单易行的新方法来鉴定疾病的发生以及判
断病理阶段。我们选取血清中的微小核糖核酸作为研究对象，希望通过检测血清 中的微小核糖核酸解决临床早期诊断等问题。检测血清中的微小核糖核酸有以下 几个优势首先，血清相对组织较易获得，甚至在平常体检中都可以收集到；其 次，血清中的微小核糖核酸反映的是整个机体的生理病理情况，其检测结果具有 指导意义；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的组织器官的病
变，因此其又可以作为疾病诊断的一个参数。总之，检测血清中的微小核糖核酸， 简单易行且效果优越，从血清中的微小核糖核酸的特异性变化这一新角度出发发 现疾病并且区分程度，将建立一种更敏感更精确的用于疾病早期确诊等的全新技 术。本发明与原有技术相比，其优势在于 一、简单易行，成本低廉。二、特别 适用于早期诊断。三、输出的结果简单明了且精确。四
图1正常人血清中直接检测到的部分微小核糖核酸RT-PCR结果。 图2提取正常人血清中RNA，检测其中微小核糖核酸的RT-PCR结果。 图3病人血清中部分微小核糖核酸相对于正常人血清中微小核糖核酸的变 化量。五具体实施例方式1、血清中的微小核糖核酸的RT-PCR实验我们使用了 RT-PCR技术次发现并证明人和动物血清中不仅能检测到各种微小核糖核酸，而且其表达量相当丰富。具体步骤为(1)收集小鼠,大鼠，正常人及某些病人的血清。(2)制备cDNA样品。此操作有两种方案， 一种方案为将 10ul血清作为buffer直接进行逆转录反应，另一种为使用Trizol试剂 (Invitrogen公司)先提取血清总RNA (10ml血清通常能富集约10wg左右的 RNA)，然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4 u 1 5XAMV buffer、 2 u 1 10mM
each dNTP mixture (Takara公司)、0. 5 u 1 RNase Inhibitor (Takara公司)、2 u 1 AMV (Takara公司)以及1. 5 y 1基因特异性反向引物混 和物，反应步骤为16'C孵育15分钟，42。C反应l小时，85。C孵育5分钟。(3) PCR及电泳观察。将cDNA按1/50稀释，取1 y
1稀释后的cDNA，加入0, 3 y 1 Taq 酶(Takara公司)，0.2ul 10 y M正向引物，0. 2 u 1 10uM通用反向引物，1.2ul 25mM MgCl" 1.6ul 2, 5mM each dNTP mixture (Takara公司)，2wl 10XPCR buffer, 13. 5ulH20， 20ul体系进行PCR。
PCR的反应条件是95°C 5分钟进 行1个循环—95°C 15秒，60°C 1分钟进行40个循环。PCR产物取10u 1进行 3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外灯下观察。具体实验结果见附图。图1是以正常人血清为研究对象，将血清作为buffer 直接进行RT-PCR的实验结果。我们选用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进 行PCR反应，图1为其中的12种微小核糖核酸。它们分别是血细胞特异性的微 小核糖核酸miR-181a、 miR-181b、 miR-223、 miR-142-3p、 miR-142-5p、 miR-150，
来自心肌及骨骼肌的微小核糖核酸miR-l、 miR-133a、 miR-206，来自脑组织的 微小核糖核酸MR-9、 miR-124a，以及来自肝脏的微小核糖核酸miR-122a。从结 果可以看出上述四种组织来源的微小核糖核酸在血液中都能检测到。但是并非全 部五百多个成熟体微小核糖核酸在血清中都有高丰度表达，有些微小核糖核酸是
很微量的，甚至不能正常检测到。为了进一步验证血清中存在微小核糖核酸，我 们先提取正常人血清中的RNA，然后选用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进 行PCR实验，结果如图2所示。图2的结果与图1的结果很吻合，PCR产物都单 一，表明这两种实验方法都能检测到人血清微小核糖核酸的表达和丰度。此外， 我们用同样的方法检测了小鼠和大鼠血清中五百多个微小核糖核酸的表达和丰
度，同样发现不同组织来源的微小核糖核酸在小、大鼠血清中有表达(图没列出)。82、 血清中微小核糖核酸的real-time PCR实验为了研究各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等)和急 慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统疾病 等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，我们进行了血清微小核糖核酸的定量 PCR实验。定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR—样，唯一不同是在PCR的 时候加入了荧光染料EVA GREEN。仪器使用的是ABI Prism
7300荧光定量PCR 仪，反应条件为95°C 5分钟进行1个循环一95°C 15秒，60°C 1分钟进行40 个循环。数据处理方法为AACt法，ct设为反应达到域值时的循环数，则每个 微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2—"t表示，其中ACt =Ct# 。 -Ct a#。我们将病人血清样本与正常人血清样本直接进行逆转录反应，通过定量
PCR反应比较其中所含微小核糖核酸的量。我们选取再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病 病人血清样品，同时用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸进行PCR实验。图3 仅是上述提及的四种组织来源的12种微小核糖核酸在正常人和病人血清中进行 定量PCR的实验结果。再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、 糖尿病病人血清中微小核糖核酸的量相对于正常人的量的比值分别有上调和下
调，表明血清微小核糖核酸可以作为一类新的疾病诊疗预测的标志物。此外，从 图3可知，在一种疾病中不同微小核糖核酸在血清中表达水平不同，提示可能是 不同疾病过程中，对不同组织来源的微小核糖核酸，血细胞免疫应答不同或细胞 破裂或分泌微小核糖核酸途径不同造成的。3、 用于诊断疾病的血清微小核糖核酸芯片的制作为了验证通过定量PCR筛选出的与疾病相关的一类血清微小核糖核酸探针 准确可靠性，我们制作了血清微小核糖核酸的生物芯片，该芯片包含了人血清中 能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针。此外，芯片能高通量地筛选血清中稳 定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清中微小核糖核酸的整体变化预测和诊 断疾病。我们首先通过测序的方法或定量PCR方法确定血清中有一个以上拷贝的
微小核糖核酸，然后合成这些微小核糖核酸的的反向互补探针，再把这些探针用芯片点样仪SmartArrayTM点制在一张75X25 mm、经过化学修饰的载玻片上。点 制在芯片上的样品还包括作为内标的U6、 tRNA，人工制备的30个碱基长度的外 标，阳性对照Hex等。整个点阵分成4个亚阵，每个亚阵有23行，21列，点间
距为185um，点的直径约为130um，每条探针重复三次。芯片操作流程为(1) 提取血清中总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；(2)微小核糖核酸的 分离取50-100yg总RNA用Ambion's miRNA Isolation Kit (Cat 1560) 分离微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸样品的荧光标记利用T4 RNA连接酶标
记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4)杂 交与清洗将RNA溶于16 P L杂交液中(15%甲酰胺；0.2% SDS; 3XSSC; 50X Denhardt' s solution)，于42。C杂交过夜。杂交结束后，先在42。C左右含0. 2% SDS， 2XSSC的液体中洗4分钟，而后在0.2XSSC液体中室温洗4分钟，玻片
甩干后即可用于扫描；(5)芯片扫描芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描 仪进行扫描；(6)数据提取及分析采用LuxScan3. 0图像分析软件对芯片图像 进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。将定量PCR技术和生物芯片技术双重验证的在疾病及正常生理状态下差异 表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，用于制备生物芯片，方法同上。此芯 片与传统芯片相比，制作工艺和操作流程没有很大改进，但是此芯片简化了探针 库，由此将大大减少芯片的制作成本和生产时间，易于制备。同时也增加了芯片 的疾病针对性和实用性。将此芯片投入实践，仅仅需要病人的血清而不需要任何
其它组织就可以在早期发现疾病，帮助指导诊断和治疗。4、专门用于疾病诊断与预测的微小核糖核酸试剂盒的制作用于诊断预测各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等) 和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统 疾病等)的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量PCR技术和生 物芯片技术。我们首先通过测序的方法或PCR方法确定正常血清中有一个以上拷 贝的微小核糖核酸。然后通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选在疾病及正常生
理状态下表达量和差异程度大的一类血清微小核糖核酸，作为预测是否发生癌变 或其它疾病以及诊断病变程度的探针。此试剂盒包括一批血清微小核糖核酸探针，Taq酶、dNTP等试剂。此试剂盒价值在于只需要血清而不需要其它组织样品， 通过最精简的探针库检测微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势预测疾病 的发生可能或诊断疾病的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，特别对于不能活
检组织的疾病如胰腺癌等，可以增加在早期发现病变的可能，帮助指导诊断和治 疗，把疾病的确诊和治疗推上一个新高度。权利要求1、血清中微小核糖核酸分子的检测方法，其特征是，所述检测方法包括下列步骤6)收集血清样本；7)将10μl血清作为buffer进行逆转录反应，来制备cDNA样品；8)用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；9)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；10)EB染色后在紫外灯下观察结果。2、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤5)之后还包括 下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清样本相对于正常血清中微小核 糖核酸的量的变化。3、 血清中微小核糖核酸分子的检测方法，其特征是，所述检测方法包括下 列步骤① 使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA (10ml血清通常能富集 约10ug左右的RNA);② 通过RNA逆转录反应得到cDNA;③ 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应； 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；⑤EB染色后在紫外灯下观察结果。4、根据权利要求2所述的检测方法，其特征是，所述步骤⑤之后还包括下 列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清样本相对于正常血清中微小核糖 核酸的量的变化。5、 一种用于血清中微小核糖核酸检测的生物芯片，其特征是，所述生物芯 片含有人血清中能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针。6、 一种用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒，其特征是，所述试剂盒中 设有一批血清微小核糖核酸探针以及包括Taq酶、dNTP在内的试剂。7、 一种应用血清中微小核糖核酸检测的生物芯片的检测方法，其特征是， 该制作方法包括下列步骤(1) 提取血清中总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；(2) 微小核糖核酸的分离取50-100ug总RNA用Ambion's miRNAIsolation Kit (Cat tt. 1560)分离微小核糖核酸；(3) 微小核糖核酸样品的荧光标记利用T4
RNA连接酶标记方法进行荧光 标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4) 杂交与清洗将RNA溶于16uL杂交液中(15M甲酰胺；0.2%SDS; 3XSSC; 50XDenhardt's solution)，于42。C杂交过夜。杂交结束后，先在42。C左右含 0.2%SDS， 2XSSC的液体中洗4分钟，而后在0. 2XSSC液体中室温洗4分钟，
玻片甩干后即可用于扫描；(5) 芯片扫描芯片用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；(6) 数据提取及分析采用LuxScan3. 0图像分析软件对芯片图像进行分析， 把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。8、 一种用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒的制作方法，其特征是，该 制作方法包括下列步骤I .通过测序的方法或PCR方法确定正常血清中有一个以上拷贝的微小核糖核酸；II. 通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选在疾病及正常生理状态下表达量 和差异程度大的一类血清微小核糖核酸，作为预测是否发生癌变或其它疾病以及 诊断病变程度的探针；III.
将步骤II中得到的一类血清微小核糖核酸探针和包括Taq酶、dNTP在内 的试剂，制备成用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒。，全文摘要本发明涉及血清中微小核糖核酸分子的检测方法、用于检测血清中微小核糖核酸的试剂盒或生物芯片以及试剂盒和生物芯片的制作和应用方法，目的在于检测血清微小核糖核酸的变化，得到在疾病及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，应用于疾病鉴定和病程，恶性疾病复发率及预后和药效的诊断相关的PCR试剂盒和生物芯片，以提高疾病的早期发现率以及确诊的准确性和疗效。本发明的技术方案为血清中微小核糖核酸分子的检测方法收集血清样本；将10μl血清作为buffer进行逆转录反应，来制备cDNA样品；用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；EB染色后在紫外灯下观察结果。文档编号G01N27/447GK101424640SQ200710134620公开日2009年5月6日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日发明者一 巴, 燕 张, 张峻峰, 张红杰, 张辰宇, 柯 曾, 媛 殷, 进 王, 王可慧, 星 蔡, 郭继刚, 熹 陈, 陈江宁 申请人:南京大学}