共培养诱导骨髓间充质干细胞向leydig细胞分化的研究--《中华医学会整形外科学分会第十一次全国会议、中国人民解放军整形外科学专业委员会学术交流会、中国中西医结合学会医学美容专业委员会全国会议论文集》2011年
共培养诱导骨髓间充质干细胞向leydig细胞分化的研究
【摘要】：目的探讨共培养诱导骨髓间充质干细胞向leydig细胞分化的可行性,解决组织工程化雄激素分泌组织研究中种子细胞来源不足的问题。方法通过Ficoll液分离、贴壁后传代并富集3周大鼠的BMSCs,及差速贴壁法获得的大鼠睾丸leydig细胞,将两种细胞通过transwell共培养皿间接共培养,并对诱导2、4周后的BMSC进行leydig细胞的特异性指标3β-HSD免疫组化、RT-PCR的测定及睾酮分泌的检测。结果免疫组化显示leydig细胞与BMSCs共培养4周后部分BMSCs表达leydig细胞特异性标志物3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD);RT-PCR反应也表明共培养后的BMSCs在基因水平上在共培养2周后表达leydig细胞的特异性标志物,并能分泌睾酮。结论本研究首次发现通过体外共培养模拟leydig细胞生长的微环境,能够诱导骨髓间质干细胞向leydig样细胞方向上分化,进一步改善培养条件提高诱导效率后,将可能为雄激素缺乏性疾病提供一条具有前景的治疗途径。
【分类号】：R329
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不属于白血病。概述 　　再生障碍性贫血（aplastic anemia）简称再障系多种病因引起的造血障碍，导致红骨髓总容量减少，代以脂肪髓，造血衰竭，以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。据国内21省（市）自治区的调查，年发病率为0．74/10万人口，明显低于白血病的发病率；慢性再障发病率为0．60／10万人口，急性再障为0．14／10万人口；各年龄组均可发病，但以青壮年多见；男性发病率略高于女性。 一般表现为贫血、出血、感染、发热（高烧或低烧），并伴有走路乏力，头晕等症状。 【诊断】 　　1987年第四届全国再障学术会议修订的再障诊断标准如下：①全血细胞减少，网织红细胞绝对值减少。②一般无脾肿大。③骨髓检查显示至少一部位增生减低或重度减低（如增生活跃，巨核细胞应明显减少，骨髓小粒成份中应见非造血细胞增多。有条件者应作骨髓活检等检查）。④能除外其他引起全血细胞减少的疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征中的难治性贫血、急性造血功能停滞、骨髓纤维化、急性白血病、恶性组织细胞病等。⑤一般抗贫血药物治疗无效。 【治疗】 　　包括病因治疗、支持疗法和促进骨髓造血功能恢复的各种措施。慢性型一般以雄激素为主，辅以其他综合治疗，经过长期不懈的努力，才能取得满意疗效，不少病例血红蛋白恢复正常，但血小板长期处于较低水平，临床无出血表现，可恢复轻工作。急性型预后差，上述治疗常无效，诊断一旦确立宜及早选用骨髓移植或抗淋巴细胞球蛋白等治疗。 　　（一）支持疗法 凡有可能引起骨髓损害的物质均应设法去除，禁用一切对骨髓有抑制作用的药物。积极做好个人卫生和护理工作。对粒细胞缺乏者宜保护性隔离，积极预防感染。输血要掌握指征，准备做骨髓移植者，移植前输血会直接影响其成功率，尤其不能输家族成员的血。一般以输入浓缩红细胞为妥。严重出血者宜输入浓缩血小板，采用单产或HLA相合的血小板输注可提高疗效。反复输血者宜应用去铁胺排铁治疗。 　　（二）雄激素 为治疗慢性再障首选药物。常用雄激素有四类：①17α-烷基雄激素类：如司坦唑（康力龙，Stanozolone）、甲氧雄烯醇酮、羟甲烯龙（oxymetholonE）、氟甲睾酮（fluoxymetholonE）、大力补（Dianabol）等；②睾丸素酯类：如丙酸睾酮、庚酸睾酮、环戊丙酸睾酮、十一酸睾酮（安雄）和混合睾酮酯（丙酸睾酮、戊酸睾酮和十一烷酸睾酮）又称&巧理宝&；③非17α-烷基雄激素类：如苯丙酸诺龙和葵酸诺龙等；④中间活性代谢产物：如本胆脘醇酮和达那唑（Danazol）等。睾酮进入体内，在肾组织和巨噬细胞内，通过5α-降解酶的作用，形成活力更强的5α-双氢睾酮，促使肾脏产生红细胞生成素，巨噬细胞产生粒巨噬细胞集落刺激因子；在肝脏和肾髓质内存在5β-降解酶，使睾酮降解为5β-双氢睾酮和本胆烷醇酮，后两者对造血干细胞具有直接刺激作用，促使其增殖和分化。因此雄激素必须在一定量残存的造血干细胞基础上，才能发挥作用，急性、严重再障常无效。慢性再障有一定的疗效，但用药剂量要大，持续时间要长。丙酸睾丸酮50～100Mg/d肌肉注射，康力龙6～12mg/D口服，安雄120～160mg/d口服，巧理宝250mG每周二次肌肉注射，疗程至少6个月以上。国内报告的有效率为34．9％～81％，缓解率19％～54％。红系疗效较好，一般治后一个月网织红细胞开始上升，随后血红蛋白上升，2个月后白细胞开始上升，但血小板多难以恢复。部分患者对雄激素有依赖性，停药后复发率达25％～50％。复发后再用药，仍可有效。丙酸睾酮的男性化副作用较大，出现痤疮、毛发增多、声音变粗、女性闭经、儿童骨成熟加速及骨骺早期融合，且有一定程度的水钠潴留。丙睾肌注多次后局部常发生硬块，宜多处轮换注射。17α烷基类雄激素男性化副反应较丙睾为轻，但肝脏毒性反应显著大于丙睾，多数病人服药后出现谷丙转氨酶升高，严重者发生肝内胆汁瘀积性黄疸，少数甚至出现肝血管肉瘤和肝癌，但停药后可消散。 　　（三）骨髓移植 是治疗干细胞缺陷引起再障的最佳方法，且能达到根治的目的。一旦确诊严重型或极严重型再障，年龄＜20岁，有HLA配型相符供者，在有条件的医院应首选异基因骨髓移植，移植后长期无病存活率可达60％～80％，但移植需尽早进行，因初诊者常输红细胞和血小板，这样易使受者对献血员次要组织相容性抗原致敏，导致移植排斥发生率升高。对确诊后未输过血或输血次数很少者，预处理方案可用环磷酰胺每天50mg/kG连续静滴4天。国内已开始应用异基因骨髓移植治疗严重再障，并已有获得成功报道。凡移植成功者则可望治愈。胎肝细胞悬液输注治疗再障国内已广泛开展，有认为可促进或辅助造血功能恢复，其确切的疗效和机理尚有待于进一步研究。 　　（四）免疫抑制剂 适用于年龄大于40岁或无合适供髓者的严重型再障。最常用的是抗胸腺球蛋白（ATG）和抗淋巴细胞球蛋白（ALG）。其机理主要可能通过去除抑制性T淋巴细胞对骨髓造血的抑制，也有认为尚有免疫刺激作用，通过产生较多造血调节因子促进干细胞增殖，此外可能对造血干细胞本身还有直接刺激作用。剂量因来源不同而异，马ALG10～15mg/（kgd），兔ATG2．5～4．0mg/（kgD），共5天，用生理盐水稀释后，先皮试，然后缓慢从大静脉内滴注，如无反应，则全量在8～12小时内滴完；同时静滴氢化考的松，1／2剂量在ALG／ATG滴注前，另1／2在滴注后用。患者最好给予保护性隔离。为预防血清病，宜在第5天后口服强的松1mg/（kgd），第15天后减半，到第30天停用。不宜应用大剂量肾上腺皮质激素，以免引起股骨头无菌性坏。疗效要1个月以后，有的要3个月以后才开始出现。严重型再障的有效率可达40％～70％，有效者50％可获长期生存。不良反应有发热、寒颤、皮疹等过敏反应，以及中性粒细胞和血小板减少引起感染和出血，滴注静脉可发生静脉炎，血清病在治疗后7～10天出现。环孢菌素A（CSA）也是治疗严重型再障的常用药物，由于应用方便、安全，因此比ALG／ATG更常用，其机理可能选择性作用于T淋巴细胞亚群，抑制T抑制细胞的激活和增殖，抑制产生IL-2和γ干扰素。剂量为10～12mg／（kgd），多数病例需要长期维持治疗，维持量2～5mg/（kgd）。对严重再障有效率也可达50％～60％，出现疗效时间也需要1～2月以上。不良反应有肝肾毒性作用、多毛、牙龈肿胀、肌肉震颤，为安全用药宜采用血药浓度监测，安全有效血浓度范围为300～500ng/ml。现代免疫抑制剂治疗严重型再障疗效已可和骨髓移植相近，但前者不能根治，且有远期并发症，如出现克隆性疾病，包括MDS、PNH和白血病等。 　　（五）中医药 治宜补肾为本，兼益气活血。常用中药为鹿角胶、仙茅、仙灵脾、黄芪、生熟地、首乌、当归、苁蓉、巴戟、补骨脂、菟丝子、枸杞子、阿胶等。国内治疗慢性再障常用雄激素合并中医补肾法治疗。 （六）造血细胞因子和联合治疗 再障是造血干细胞疾病引起的贫血，内源性血浆EPO水平均在500u/L以上，采用重组人EPO治疗再障必需大剂量才可能有效，一般剂量是不会取得任何效果。重组人集落刺激因子包括G-CSF、GM-CSF或IL-3治疗再障对提高中性粒细胞，减少感染可能有一定效果，但对改善贫血和血小板减少效果不佳，除非大剂量应用。但造血细胞因子价格昂贵，因此目前仅限于重型再障免疫抑制剂治疗时的辅助用药，如应用ALG／ATG治疗重型再障，常因出现严重粒细胞缺乏而并发感染，导致早期亡。若该时合并应用rHG-CSF可改善早期粒缺，降低病率。联合治疗可提高对重型再障治疗效果，包括ALG／ATG和CSA联合治疗，CSA和雄激素联合治疗等，欧洲血液和骨髓移植组采用ALG、CSA、甲基强的松龙和rhG-CSF联合治疗，对重型再障有效率已提高到82％。
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&&&&【概述】
再生障碍性贫血（aplastic　anemia，AA，简称再障）是一组由多种病因所致的骨髓功能障碍，以全血细胞减少为主要表现的综合征。在我国年发病率约为0.74/10万。确切病因尚未明确，已知再障发病与化学药物、放射线、病毒感染及遗传因素有关。发病机制主要有3种学说，即干细胞损伤、造血微环境缺陷和免疫功能失调。再障分为先天性和获得性，后者又分为原因不明的原发性再障和能查明原因的继发性再障。根据起病和病程急缓分为急性和慢性再障。
&&&&【诊断要点】
贫血症状，一般无肝脾肿大，出血和感染是再障的两大主要并发症。急性再障起病急，病情进展迅速，常以出血和感染为首发症状，早期贫血可不严重，随着病程进展，呈进行性加重，几乎所有患者均有不同部位出血，如、、、眼底、颅内及皮下出血等，60％以上有内脏出血；病程中常有，为感染所致，感染以口咽部、呼吸道及肛门等部位多见，皮肤粘膜可发生坏死性溃疡而导致败血症，一般治疗难以见效。慢性再障起病缓慢，多以贫血为首发症状，出血以皮肤粘膜多见，感染多见于呼吸道，较易控制。
实验室检查
全血细胞减少，贫血多表现为正细胞正色素型，红细胞也可偏大或大小不等，一般无畸形及多染或幼红细胞，网织红细胞明显减少。骨髓检查：急性再障呈多部位增生减低或重度减低，三系造血细胞明显减少，尤以红系细胞及巨核细胞减少明显，非造血细胞比例增多，以淋巴细胞比例增多明显。慢性再障多部位骨髓穿刺可能结果不一，可表现为增生不良到增生活跃，但至少有一个部位增生不良，此外增生活跃的骨髓，晚幼红细胞比例增多，晚幼红细胞出现“多核”现象，核呈不规则分叶状，表现脱核障碍，巨核细胞明显减少，骨髓片肉眼观察油滴增多，骨髓小粒非造血细胞和脂肪细胞增多，一般在60％以上。由于骨髓涂片多混血稀释，骨髓活检对评估造血情况优于涂片，活检显示造血细胞减少。放射线核素骨髓扫描可从整体反映造血情况，此种检查包括注射到体内由红细胞摄取成像和用注入后由骨髓内单核巨噬细胞吞噬成像，正常骨髓中单核巨噬细胞与造血组织有恒定比例关系，可以反映造血情况。正常人颅骨、脊柱、胸骨、锁骨、肩胛骨、骨盆、肱骨和股骨上1/4显示造血，再障患者摄取减少。造血祖细胞培养集落生成减低有助于再障诊断，而且有助于检出有无抑制淋巴细胞或血清中有无抑制因子。此外因再障造血功能低下，铁利用不良，常有铁代谢异常，表现为血清铁升高，升高，血清铁蛋白增高，骨髓内外铁增高，输血多者更明显。再障患者成熟粒细胞活力升高，血清溶菌酶活力减低，抗碱血红蛋白量增多。一般正常。红细胞内游离原卟啉可轻度升高。红细胞膜的钠钾ATP酶活性降低。血浆（EPO）浓度增高，尿排出EPO增加。
再障需与以下疾病鉴别诊断：①（MDS），该病中难治性贫血（RA）易于与再障相混。RA虽有全血细胞减少，但骨髓造血细胞均增生，各系中均可见病态造血，染色体核型可有0％~60％异常改变，骨髓活检可见造血前驱细胞异常分布；②（PNH），PNH可有全血细胞减少，有的患者可有骨髓增生低下，但PNH有表现，如网织红细胞增高、血浆游离血红蛋白增加、尿含铁血黄素阳性、红细胞对补体敏感、糖水试验、Ham试验、阳性等可与再障鉴别；③急性造血功能停滞，严重感染（包括细菌或病毒），某些药物或危象时出现急性造血功能停滞。表现全血细胞减少、网织红细胞降低，酷似急性再障，但本病是一种自限性疾病，经过适当治疗，去除致病因素后，可逐渐恢复造血；④、低增生性白血病、非造血系统肿瘤转移至造血系统、、巨幼细胞贫血等可表现为全血细胞减少，须注意鉴别。
&&&&【治疗概述】
1981年4月全国再障学术会议上制定的疗效标准为：
　　　　基本治愈：贫血、出血症状消失，Hb达到男性10　g/L，女性100　g/L，白细胞达到4×109/L，血小板达到80×109/L，随访一年以上无复发。
缓解：贫血、出血症状消失，Hb达到男性10　g/L，女性100　g/L，白细胞达到3.5×109/L，血小板也有一定程度恢复，随访3个月病情稳定或继续进步者。
明显进步：贫血、出血症状明显好转，不输血，血红蛋白较治疗前1个月内常见值增加30/L，维持3个月不降。
无效：经充分治疗后症状及血象均不能达到明显进步者。
自0世纪50年代起，由于药物研究发展及医学整体水平的提高，再障治疗已有很大进步，目前国内外主要治疗方法如下：
1．尽可能去除导致再障的各种病因。
．积极支持治疗　　主要包括改善贫血，预防重要脏器出血、防治感染及心理治疗。一般认为Hb<50　g/L，有心功能代偿不全者，对贫血耐受能力很差或有大出血倾向者有输血适应证，但应注意有些老年病人，特别是高龄患者由于各器官功能衰退，即使血红蛋白达60　g/L，也应考虑适当输血，以防各种严重合并症发生。有骨髓移植适应证患者，骨髓移植术前应尽量避免输血，因为输血可引起同种免疫抗体如HLA抗体、血小板抗体等，影响以后骨髓的植入。有的再障患者需长期反复输血，应注意血液传播的疾病，如各种、病毒感染、巨细胞病毒等。因此在有条件的情况下，尽量输“去血浆和白细胞”的红细胞。此外长期大量输血可以引起，也应注意观察。止血一般常用维生素C、止血敏、肾上腺皮质激素等。如检查发现有纤维蛋白溶解活性增高表现，应加用抗纤溶药物如6-氨基己酸等。女性月经量过多或流血不止，可在月经来潮前7~10　d开始用丙酸睾丸酮100　mg，肌注每日1次，直至月经来潮停用，可减少出血。血小板<10×109/L，伴有严重出血者，有输血小板的适应证。皮肤大片淤斑、口腔粘膜血泡或出血、眼底出血等，应积极输血小板，改善出血情况。因临床经验提示，有上述情况者，常常容易发生中枢神经系统出血，而在此种情况下，一旦发生中枢神经系统出血，抢救很困难。输血小板在一开始就应注意尽量少用供者，最好用同一供者，用不含白细胞的单采血小板以尽量减少血小板抗体的产生。再障患者感染防治十分重要，因粒细胞减少，免疫功能异常，感染常是再障死亡的重要原因之一。预防感染平时应注意保护，适当营养、讲究卫生、尽量减少与人群接触，尽可能清除全身已存在的各种感染病灶，以防导致全身感染。一旦发生感染，如不明原因，不论当时是否能找到感染灶，应首先试用抗细菌治疗，抗细菌治疗无效，应考虑病毒感染或真菌感染，同时合用或单用抗病毒或抗真菌治疗，病原体明确后，应按药物敏感试验用药。再障用药还应注意尽量避免对造血有影响的药物。在抗感染方面，目前一般不主张输注白细胞，因为粒细胞在血液中的寿命仅几小时，必须每日连续输注直到感染控制，而反复输注HLA不合的粒细胞易产生抗体，影响以后的治疗。在粒细胞极度低下的严重感染情况下，适当应用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）或粒/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）有利于控制感染。心理治疗主要包括提高治病信心，提高对疾病的认识和加强对治疗的配合。
3．雄激素和蛋白合成同化激素治疗雄激素是治疗慢性再障的首选药物。它能促使肾脏产生红细胞生成素（EPO）；巨噬细胞产生粒/巨噬细胞集落刺激因子；在肝脏和肾脏存在5β-降解酶，使睾酮降解为5β-和胆脘醇酮，后两者对造血干细胞具有直接刺激作用，促使其增殖和分化，因此雄激素治疗必须在有一定量残存造血干细胞的基础上，才能发挥效果。急性再障有时显示不出效果，可能与残存的干细胞太少有关。慢性再障有一定疗效，国内报告有效率为34.9％~81％。常用雄激素有4类：①17α-烷基雄激素，如康力龙（司坦唑/stanozolo-ne）、甲基雄烯醇酮、羟甲烯龙（oxymetholo-ne）、氟甲睾酮（fluoxymetholone）、大力补（dianabol）等；②睾丸素酯类：如丙酸睾丸酮、庚酸睾酮、环戊丙酸睾酮、十一酸睾酮（安雄）和混合睾酮酯（丙酸睾酮、戊酸睾酮和十一烷酸睾酮），又称“巧理宝”；③非17a-烷基雄激素类：如苯丙酸诺龙和葵酸诺龙；④中间活性代谢产物：如苯胆烷醇酮和达那唑（dan-azol）等。雄激素用药剂量要大，常用者如丙酸睾丸酮50~100mg/d肌注，康力龙6~1mg/d口服，安雄10~160mg/d口服，巧理宝50　mg每周3次肌注，疗程至少6个月以上。有效者用药后1个月网织红细胞开始上升，随后血红蛋白上升，约个月后白细胞缓慢上升，血小板恢复更为缓慢或难以恢复，有5％~50％患者血象恢复，停药后复发，复发后再用药有效。雄激素的主要副作用为男性化表现，如、声音变粗、毛发增多，女性、儿童骨成熟加速及骨骺早期融合，且有一定程度的水钠潴留和肝脏毒性，如GPT升高及淤积性黄疸，极少数甚至出现肝和肝癌。临床观察提示，男性化不良反应在用丙酸睾丸酮时表现明显，而17a-烷基雄激素类的肝脏毒性比丙酸睾酮大。上述毒性反应多在停药后可消失。
4．造血干细胞移植　　异基因骨髓或直干细胞移植是急性再障的首选治疗方法，移植后长期无病存活率可达60％~80％，其适应证一般年龄<0岁，有相符供者，术前少量输血或未经输血，因输血易使受者对献血员次要组织相容性抗原致敏，易发生排斥而使移植失败。预处理一般以环磷酰胺50mg/（kg·d），连续4　d静脉点滴。一般认为，输入有核细胞数应≥3×108kg（供者体重）。（GVHD）是异基因骨髓移植失败的重要原因之一，因此在异基因骨髓移植后要常规采用预防GVHD措施，应用免疫抑制剂，如环胞素A（CSA）、环磷酰胺等（见异基因骨髓移植）。去除移植物中T细胞可以减少GVHD的发生，但移植失败率增高，此法不常用。急性再障持久性植入率>80％，5年生存率>70％。因此急性再障有移植适应证者应首选异基因骨髓或血干细胞移植，但必须按移植常规进行，尽量减少移植相关合并症。
5．免疫抑制剂治疗　　一部分再障患者是由于免疫功能失调，因此近年有用免疫抑制剂治疗再障，目前常用的有抗淋巴细胞球蛋白（ALG）和抗胸腺细胞球蛋白（ATG），剂量为40mg/（kg·d），静脉点滴，连用4d，或10~15mg/（kg·d），静脉点滴8~14　d，可同时合用肾上腺皮质激素，或用单倍体相合亲属提供的骨髓细胞输注，在上述免疫抑制治疗后应用雄激素，一般认为羟甲基雄酮效果好，副作用轻，3mg/（kg·d），连用3个月后评价疗效。有效率0％~80％，多为45％~50％，完全缓解率约占0％，有效病例中15％有复发。从目前积累的病例分析看，疗效与不同ATG或ALG制剂和选择病例有关。诊断后早期用药（<6个月）、粒细胞≥0.×109/L、血小板≥30×109/L效果较好。一般认为疗效与病因、年龄无关，联合应用大剂量肾上腺皮质激素比单用ATG或ALG效果要好。药物反应有、血小板减少、低血压、血清病反应等；应积极处理。有报道约4.3％的患者再治疗后5个月~3年内发生其他血液病，如骨髓异常增生综合征、白血病及阵发性血红蛋白尿等。此外，近年有用单克隆抗T细胞抗体、环胞素A、大剂量进行免疫抑制治疗。
6．造血治疗　　由于再障是干细胞疾病，应用造血治疗近年已有报道。大致可分为以下几种情况：用EPO治再障必须大剂量才能有效；G-CSF、GM-CSF、IL-3治疗再障对提高中性粒细胞减少感染，有一定效果，但对改善贫血和提高血小板效果不佳，大剂量应用可能有效，而这种效果常在停药后随之消失，有的甚至使粒细胞降至比用药前更低。因此有人认为，只有在严重粒细胞缺乏或合并严重感染时应用上述，一般不作为常规应用；联合用药治疗重型再障可提高其疗效，如与ALG或ATG和环胞素A（CSA）联合治疗；或CSA和雄激素联合治疗等。已有报道ALG、CSA、甲基强的松龙和rhG-CSF治疗重型再障效果明显提高。
7．中医中药治疗　　一般认为以补肾为主，中医将再障分为肾阴虚、肾阳虚、肾阴阳两虚、脾肾阳虚及肝肾阴虚等类型，在此基础上进行辨证施治。
总之，再障是一种难治性疾病，单用支持治疗，重型再障多在6个月内死亡，因此治疗多为联合用药，如中西医结合治疗、免疫抑制剂加等。
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慢性再障的治疗首选（） A．丙酸睾酮肌肉注射 B．造血干细胞移植 C．维生素B12肌注 D．
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慢性再障的治疗首选（）A．丙酸睾酮肌肉注射B．造血干细胞移植C．维生素B12肌注D．抗胸腺球蛋白E．肾上腺糖皮质激素口服
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