②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。

③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。

④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。因为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，况且其不能合成起诱导作用的信号分子，所以限制了农杆菌介导法在单子叶植物中的应用。不过近年来大量成功转化的实例表明，植物、真菌、哺乳动物甚至人类细胞都可以作为农杆菌的受体

• ．生物360[引用日期]

农杆菌（Agrobacterium）是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，常见的有两种：根癌农杆菌（A. tumefaciens）和发根农杆菌（A. rhizogenes）。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物或裸子植物的受伤部位，诱导产生冠瘿瘤。诱发冠瘿瘤的原因在于根癌农杆菌Ti质粒上的T-DNA含8个左右的基因能在植物细胞内表达，指导合成一种非常特殊的化合物冠瘿碱，进而引发转化细胞癌变；而发根农杆菌能诱导产生发状根，特征在于大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌Ti质粒（150～200kb）和发根农杆菌Ri质粒（200～800kb）上的一段T-DNA，当农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，Ti质粒或Ri质粒上的T-DNA区脱离质粒而整合到植物基因组。

正因如此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，能通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，并通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。这就是农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation）。目前，此方法不仅在实验室中普通用于双子叶植物的感染，还成功用在非农杆菌寄主生物，比如真菌，单子叶植物，裸子植物甚至动物细胞等的转化。目前得到普遍应用，特别是植物的转基因工程研究。

操作流程（农杆菌转化法）：

Transformation）涉及多个步骤：1）从起始物种中分离感兴趣基因；2）建立功能性的转基因构建子包括感兴趣基因、驱动表达的启动子、密码子修饰（若是需要以提高成功的蛋白表达）、筛选基因（便于筛查出成功转入目的基因的宿主植物）；3）将转基因插入到Ti质粒上；4）将含T-DNA的质粒转化进入农杆菌；5）将转化后的农杆菌与植物细胞混合，从而允许T-DNA整合进入植物染色体；6）遗传工程成功改造的植物体再生；7）在实验室、温室和大田水平来测试转基因表达效果。见图1，根癌农杆菌介导的植物转化示意图。

植物转化用T-DNA双元载体（质粒）：

双元载体系统（Binary-vector system）是植物基因工程常用的载体系统。

双元载体系统包含两个不同的质粒：一种是野生宿主源的小复制子（wide-host-range small replicon），含有一复制起始点（ori），能够让质粒在包括大肠杆菌和农杆菌在内的细菌内维持生长，这类质粒通常含有a）替换T-DNA的外源DNA；b）T-DNA左右边界序列（或至少含T-DNA右边界）；c）同时维持和筛选大肠杆菌和农杆菌的标志基因；d）植物生长的筛选标志基因；一种是辅助型Ti质粒（helper Ti plasmid），缺乏完整的T-DNA区域，但是含有完整的vir区，能够激活T-DNA的转移。

表1、常用的农杆菌T-DNA双元载体

植物转化用农杆菌菌株类型：

植物双元载体转化用的农杆菌菌株有很多，如何选择合适的农杆菌，不仅要考虑到转化的农作物以及农作物自身品系，还要考虑到搭配所用的双元载体以及转化方法等。具体实验还是需多参阅文献和实验室自身工作经验，来选择适当的农杆菌菌株。以下列出几款常用的农杆菌菌株应用范畴。

表2、常用根癌农杆菌感受态细胞的应用范畴

表3、常用发根农杆菌感受态细胞的应用范畴

农杆菌介导的植物转化方法（仅作交流学习用）

根癌农杆菌介导的拟南芥转化实验（来自网络资料）

农杆菌对双子叶植物的创伤部位侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。

根癌农杆菌含有Ti 质粒，Ti质粒上的T-DNA在Vir区（virulence region）基因产物的介导下可以插入到植物基因组中，诱导在宿主植物中瘤状物的形成。因此，将外源目的基因插入到T-DNA  中，借助Ti质粒的功能，使目的基因转移进宿主植物中并进一步整合、表达。

重组双元表达载体pCAMBIA1300 ，GV3101农杆菌感受态细胞，拟南芥

将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种于MS培养基上，于22℃、光照10h培养1-2周，长出无菌苗后转移至坧石和土（3：1）混合物上培养。【注意：湿度要大一些】

2. 成功转化双元载体的农杆菌GV3101悬浮液（对数生长期）

将目的基因构建到双元载体上，之后，将重组的双元载体转入农杆菌GV1301并用卡那霉素（50mg/ml）筛选含有重组双元载体的菌落。将农杆菌接种在LB 液体培养基（含有庆大霉素25mg/L用于筛选Ti质粒，卡那霉素50mg/L 用于筛选T-DNA）中，28℃，180r/min条件下震荡培养至对数生长期，T-DNA 28℃，180r/min 在4℃和-20℃分别保存菌株备用。

3. 农杆菌感染拟南芥

3.1 在转化前三天，接种含有双元载体的农杆菌到5ml含有抗生素（庆大霉素20mg/L，卡那霉素50mg/L）的LB液体培养基中，28℃下震荡培养2天。

3.2 两天后，将1ml培养的农杆菌转移到100ml含有抗生素的 LB液体培养基中，28℃继续震荡培养24h。（前面步骤由实验技术人员准备：保证每组有约80ml-100ml 的农杆菌，事先分装到两个50ml的离心管中。）

3.3 将农杆菌转入离心管中，6000rpm/min，室温条件下， 离心10min，然后将上清倒出。

3.4 将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口的器皿中（500ml烧杯）。

3.5 选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约20-30s，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。

3.6 将盆钵取下，横放于暗箱中约24h。注意保持一定的湿度。

3.7 24h后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长。

3.8 大约三周后收取成熟种子。

4.1 在箱底撒水保湿，然后将花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培养16-24h（过夜）后，将拟南芥放置于塑料培养池内，并浇足Horgland营养液，恢复正常培养。

4.2 为了提高转化率，去除塑料袋3天后，用吸管吸取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾花蕾。

4.3 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。

4.4 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分。

4.5 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中（在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于-20℃冰箱内长期保存。 

产品信息：我司（上海懋康生物）提供一系列农杆菌介导的转基因植物研究用产品，从双元载体（binary vectors），到农杆菌感受态细胞（competent cells），到常用植物培养基，到植物生长调节剂/诱导剂，到转化筛选用的抗生素，所有产品现货供应，专为植物研究人员而设计。如果你需要更多关于产品或实验相关的问题，欢迎来电咨询，021-，QQ：。

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