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重组胰蛋白酶最适 PH 和 PH 稳定性
重组胰蛋白酶最适 PH 和 PH 稳定性
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样品：重组胰蛋白酶，比活 4500USP u/mg pro.，上海雅心生物技术有限公司，纯度如图 1 所示。BAEE，Sigma.
图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定
1. 最适 pH 的研究 准备 pH 为 3~12 的底物 BAEE（0.25 mM），分别测定 rPT 纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。缓冲液成分依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6)，25 mM Tris-HCl (pH 7~8)，25 mM Gly-NaOH(pH 9~12)，所有缓冲液均为 25℃ 下配制。底物在 25℃ 温浴 10 分钟后，开始测活。
2. pH 稳定性的研究 取活性为 10 mg/ml 纯酶液，分别在 pH 3~12 缓冲液中稀释 10 倍，在 25℃ 下温浴 2 h，取样品测定酶活，以水浴前酶液初始活性作为 100%，计算残余活性。缓冲液依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6)，25 mM Tris-HCl (pH 7~8)，25 mM Gly-NaOH (pH 9~12)，所有缓冲液均为 25℃ 下配制。
a, RPT 最适 pH 曲线；
b, RPT 的 pH 稳定性
分别在 pH 3.0~12.0 不同的 pH 条件下，测定 rPT 活性。结果见上图 2a，最适 pH 范围是 7~11，而 pH 为 9.0 时测得 rPT 活性为最大值，这与天然提取的猪胰酶不同（天然胰酶最适 pH 为 7.6-9.0），几乎接近极值，确定该值为测活最适条件，但是底物在碱性条件易降解，所以底物尽量要现用现配。
分析不同 pH 环境对 RPT 活性的影响，如图 2b 所示，rPT 在 pH 3.0 NaAc-HAc 缓冲液里最为稳定。随着 pH 的升高，RPT 酶活的损失程度也随之提高。在测定 rPT 最适 pH 值时发现，pH≤5 底物条件下，RPT 蛋白几乎无活性，如图 2a 所示。而图 1b 所示，在 pH≤5 的缓冲液中，2 小时后依然保持较高的活性。说明在 pH≤5，RPT 稳定，自降解的速率大大降低，酶分子处于相对稳定的状态。此时把酶液转入到 pH 7.6 的测活体系中，此时酶分子的构象瞬间发生变化，重新暴露出活性位点，于是又恢复了活性。此外，RPT 对碱性环境有一定时间的耐受性，在 pH&9环境中，2小时后依然有80% 以上的酶活残余，从这一点讲，rPT扩大了胰酶的应用pH范围，有很大的意义。但是pH&10 环境中，活性损失非常快。
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酶的作用为什么会有最适温度和最适ph
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酶的作用有最适温度和最适ph值原因如下：（1）温度对酶促反应速度的影响各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，酶促反应速度可以相应提高1～2倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为37～40℃；微生物体内各种酶的最适温度为25～60℃，但也有例外，如黑曲糖化酶的最适温度为62～64℃；巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为80℃；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为85～94℃。可见，一些芽孢杆菌的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。最适温度在60℃以下的酶，当温度达到60～80℃时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100℃时，酶的催化作用完全丧失。（2）pH对酶促反应速度的影响酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。主要表现在两个方面：①改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合；②过高或过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭受不可逆破坏。人体中的大部分酶所处环境的pH值越接近7，催化效果越好。但人体中的胃蛋白酶却适宜在pH值为1~2的环境中，胰蛋白酶的最适pH在8左右。酶（英文：Enzyme，源于希腊语：ενζυμον，“在酵里面”），指具有生物催化功能的高分子物质， 在酶的催化反应体系中，反应物分子被称为底物，底物通过酶的催化转化为另一种分子。几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。与其他非生物催化剂相似，酶通过降低化学反应的活化能（用Ea或ΔG表示）来加快反应速率，大多数的酶可以将其催化的反应之速率提高上百万倍；事实上，酶是提供另一条活化能需求较低的途径，使更多反应粒子能拥有不少于活化能的动能，从而加快反应速率。酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。酶有正催化作用也有负催化作用，不只是加快反应速率，也有减低反应速率。与其他非生物催化剂不同的是，酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。虽然酶大多是蛋白质，但少数具有生物催化功能的分子并非为蛋白质，有一些被称为核酶的RNA分子也具有催化功能。此外，通过人工合成所谓人工酶也具有与酶类似的催化活性，包括人工合成的DNA。 有人认为酶应定义为具有催化功能的生物大分子，即生物催化剂。
铸造工程师
因为绝大多数情况下,酶的化学本质是蛋白质,而蛋白质是具有活性的物质,温度过高或过低,强酸或强碱都会使蛋白质结构受到破坏而变性,所以酶有最适温度和最适PH.
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17 天然蛋白质中不存在的氨基酸是_______________：A、脯氨酸 B、半胱氨酸 C、蛋氨酸 D、丝氨酸 E、瓜氨酸1 酶的最适 pH 值是一个常数,每一种酶只有一个确定的最适 pH 值.（ ）2 ATP 虽然含有大量的自由能,但它并不是能量的贮存形式.（ ）3 蛋白质合成过程中所需的能量都由 ATP 直接供给 （ ）4 生物体内核酸和蛋白质两种大分子均能吸收紫外光,但最大吸收峰不同.（ ）5 蛋白质和酶原的激活过程说明蛋白质的一级结构变化与蛋白质的功能无关.（ ）6 同种生物体不同组织中的DNA,其碱基组成也不同.（ ）请说明理由
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