一种细菌内毒素检测方法
专利名称一种细菌内毒素检测方法
技术领域本发明属于药物领域，特别涉及一种细菌内毒素检测方法。
背景技术细菌内毒素是G-菌细胞壁上的特有结构，其主要成分是脂多糖，具很强的热原活性。当细菌内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时，则可导致不同程度的内毒素血症。因此，对于注射剂及其生产中所用的原辅料都应进行细菌内毒素的控制，以确保产品质量，保障用药安全。细菌内毒素的检测常用方法是家兔热原法和鲎试剂法，目前运用较多的是鲎试剂法。采用该方法进行细菌内毒素检测之前，须进行干扰实验，排除供试品对鲎试剂实验的干扰，确保该方法的准确度。对于非水溶性供试品，由于其与细菌内毒素检测用水不能互溶，混合后一段时间出现分层，导致难以有效检测。目前多采用的方法是在分层以前取供试品与细菌内毒素检测用水的混合物，或者通过离心取水相部分进行干扰实验，但是取供试品与细菌内毒素检测用水的混合物进行干扰实验需要稀释更大的倍数才能排除干扰甚至不能排除干扰；离心方法存在操作复杂、容易造成二次污染，出现假阳性，同时不能确保油相中的细菌内毒素完全溶解在水相中，在进行细菌内毒素检测时，容易出现假阴性等缺点。对于含有这类非水溶性原料的药品，虽然能够与水互溶，在采用细菌内毒素检测用水稀释时，仍然存在细菌内毒素在供试品中分散不均匀导致干扰不能成立的情况。商君等，“油剂普鲁卡因青霉素注射液细菌内毒素检查方法的研究”，中国兽药杂志):20 22，采用在样品中加入适量无菌、内毒素合格的0.lmol/L氢氧化钠、1%吐温-80溶液，并用0.lmo l/L盐酸调节样品液的pH值，解决了油剂普鲁卡因青霉素注射液的溶解问题，但是该方法操作复杂，并且经研究，不能广泛应用于常用的非水溶性药品。
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的细菌内毒素检测方法。本发明细菌内毒素检测方法，它包括如下步骤:(I)配制细菌内毒素检测用分散液:取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性齐U，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1 2% (v/v),阴离子表面活性剂浓度为0.05 0.5% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为0.1 1% (v/v);(2)检测:以步骤(I)制备的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品。细菌内毒素检查用水:系指内毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝胶法)或0.005EU/ml (用于光度测定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水(详见《中华人民共和国药典(2010版)第二部》附录XI E细菌内毒素检查法)；
细菌内毒素检查法，指《中华人民共和国药典(2010版)第二部》附录XI E规定的细菌内毒素检查法。其中，步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂HLB值为I 20。优选地，所述阴离子表面活性剂的HLB值为12 20。其中，步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂包括油酸、油酸钠或者油酸三乙醇胺中的一种或者多种。其中，步骤(I)中，所述非离子表面活性剂的HLB值为I 20。优选地，所述非离子表面活性剂的HLB值为13.3 16.7。步骤(I)中，所述非离子表面活性剂包括聚山梨酯类系列中的一种或者多种。步骤(I)中，所述甘油浓度为1% (v/v)，阴离子表面活性剂浓度为0.1% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为1% (v/v)。步骤(I)中，去内毒素采用的方法是:用孔径为IOOnm微孔滤膜将溶液过滤。本发明细菌内毒素检测方法 ，可以有效排除非水溶性供试品对鲎试剂实验的干扰，准确度高，检测步骤简单。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1内毒素检测报告，其中，管号1-8:标准曲线；9_10:离心法制备供试品溶液；11-12:阳性对照；13-14:实施例1分散液作为溶剂制备的供试品溶液I ;15-16:实施例1分散液对照样品的制备I ;17_18:实施例2分散液作为溶剂制备的供试品溶液2 ； 19-20:实施例2分散液对照样品2 ；21-22:实施例3分散液作为溶剂制备的供试品溶液3 ；23~24:实施例3分散液对照样品3 ；25-26:实施例4分散液作为溶剂制备的供试品溶液4 ；27~28:实施例4分散液对照样品4 ；29-30:实施例5分散液作为溶剂制备的供试品溶液5 ;31_32:实施例5分散液对照样品5。
具体实施例方式实施例1本发明检测方法及有效性验证一、检测方法1、分散液配制(I)试剂选择阴离子表面活性剂选择油酸钠，其HBL值为18 ;非离子表面活性剂选择聚山梨酯-80，其HBL值为15。(2)实验器具及试剂热原的去除所有用的实验器具，包括碘量瓶、容量瓶、药匙、烧杯在250°C下干烤2h，去除其中的热原；油酸钠放置于除去热原的碘量瓶中，在150°C下干烤2h。(3)分散液的配制称取已经在150°C干烤2h的油酸钠0.lg，用细菌内毒素检测用水配制的1%甘油溶液在已经去除热原的烧杯中溶解，配制成浓度为0.1%的油酸钠溶液，然后加入1%聚山梨酯-80，使得整个体系各原料的配比为:油酸钠0.1% (w/v)，甘油1% (v/v)、聚山梨酯-801%(v/v),最后用细菌内毒素检测用水配制的0.lmol/L HCl溶液调节pH在6_8左右。(4)分散液溶液的内毒素去除将得到的溶液用孔径为IOOnm微孔滤膜将溶液过滤到已除热原的碘量瓶中。2、以步骤I制得的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品，即可。
二、分散液溶液细菌内毒素含量验证实验按照细菌内毒素检测用水的要求将该分散液溶液的细菌内毒素限值定为0.015EU/ml。采用两个不同生产厂家的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素干扰实验，建立该分散液细菌内毒素验证方法为采用灵敏度为0.015EU/ml的鲎试剂对该溶液进行细菌内毒素检测。a、细菌内毒素限值的确定按照细菌内毒素检测用水的要求将该分散液溶液的细菌内毒素限值定为0.015EU/ml。b、供试品的干扰试验鲎试剂灵敏度复核试验按《中国药典》2010年版二部附录XI E “细菌内毒素检查法”，对所用两个厂家鲎试剂的灵敏度进行复核。根据鲎试剂灵敏度的标示值(X )，将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2入、A ,0.5A ,0.25 A四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟。按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时，用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度2.0 A管均为阳性，最低浓度0.25 A管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(、C)。A c=lg_1( E X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。复核结果见表I。表I鲎试剂灵敏度复核结果
1.一种细菌内毒素检测方法，其特征在于:它包括如下步骤:
(1)配制细菌内毒素检测用分散液:取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，调pH至6 8，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1 2% (v/v),阴离子表面活性剂浓度为0.05 0.5% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为 0.1
1% (v/v)；
(2)检测:以步骤(I)制备的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂HLB值为I 20。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述阴离子表面活性剂的HLB值为12
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述阴离子表面活性剂包括油酸、油酸钠 或者油酸三乙醇胺中的一种或者多种。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述非离子表面活性剂的HLB值为I 20。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于:所述非离子表面活性剂的HLB值为13.3
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述非离子表面活性剂包括聚山梨酯类系列中的一种或者多种。
8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，所述甘油浓度为1%(v/v),阴离子表面活性剂浓度为0.1% (w/v)，非离子表面活性剂浓度为1% (v/v)。
9.根据权利要求1的检测方法，其特征在于:步骤(I)中，去内毒素采用的方法是:用孔径为IOOnm微孔滤膜将溶液过滤。
本发明公开了一种细菌内毒素检测方法，它包括如下步骤(1)配制细菌内毒素检测用分散液取甘油、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，溶于注射用水或细菌内毒素检查用水中，去内毒素，得分散液，其中，甘油浓度为0.1～2%(v/v)，阴离子表面活性剂浓度为0.05～0.5%(w/v)，非离子表面活性剂浓度为0.1～1%(v/v)；(2)检测以步骤(1)制备的分散液取代细菌内毒素检查用水，按照细菌内毒素检查法检测待检样品。本发明细菌内毒素检测方法准确度高，操作简单。
文档编号G01N33/579GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者朱雪梅, 杨秋艳, 杨军, 王利春, 王晶翼, 梁隆, 沈鑫, 程志鹏 申请人:四川科伦药业股份有限公司 上传我的文档
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注射剂的原料需要进行细菌内毒素检查吗
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请问注射剂的原料需要进行细菌内毒素检查吗？求解答
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请问有法规支持吗？我看了药典没有这样的要求。
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可以做一个内控标准。
签到天数: 72 天[LV.6]常住居民II
可以做一个内控标准。
请问您知道有单位进行这种检测吗？
签到天数: 494 天[LV.9]以圈为家II
肯定你需要的呀
签到天数: 416 天[LV.9]以圈为家II
原料药在药典中应该有质量标准，如果原料药中规定有内毒素的指标，那肯定要做。
如果原料药的内毒素对你的注射剂质量有影响，但药典中又没规定，你也可以要求供应商增加检测项，自己公司也增加相应的检测。
Powered by导读：热原是一种致热物质，它是一种脂多糖物质（Lipopoly-saccharide），最近已揭示了类脂A（Lipid）也是热原物质，发热性物质即热原有两类：一类是低相对分子质量发热物质（Pyretice），另一类是高相对分子质量发热物质（Pyrogen），一般认为热原是指细菌发热物质，这类物质具有耐热性和化学稳定性，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质，细菌内毒素是检查样品
热原是一种致热物质，有两种来源，一种是来自生产环境的污染程度，即产品的初始污染菌，这种致热原可用细菌内毒素的方法检测出来；而另一种致热原则来自于材料，材料对人体的致热程度是无法用细菌内毒素的方法检测出来的，必须用家兔法进行检查。所以，你的产品如果是首次注册，材料中的致热程度还不明确的时候，不能只检测细菌内毒素，也需要用家兔法检测热原。如果你的产品重新注册，材料中的致热原已经被排除，那么只需检测细菌内毒素就可以了。个人观点，供参考。
1．1热原的本质
M.Thmas等[1]指出，热原（Pyrogen）又称内毒素（Endotoxin）,产生于革蓝氏阴性（Gram-nagative）细菌的细胞外璧，亦即细菌尸体的碎片。它是一种脂多糖物质（Lipopoly-saccharide），简称LPS，其相对分子质量从几千到几十万不等，根据产生它的细菌种类而定。在水溶液中，其相对分子质量可为几十万到几百万不等。最近已揭示了类脂A（Lipid）也是热原物质，构成为危害人体的内毒素，相对分子质量大约为2000。
永田彦等指出[2]，发热性物质即热原有两类：一类是低相对分子质量发热物质（Pyretice），另一类是高相对分子质量发热物质（Pyrogen），它们统称为内毒素。一般认为热原是指细菌发热物质，它由革蓝氏阴性细菌的细胞壁的外膜构成。更进一步分析其主要成份是脂多糖（LPS）及类脂A，是热原的活性部分。它们的相对分子质量一般为1万～2.5万，在水溶液中形成缔合体，相对分子质量可达50万～100万。这类物质具有耐热性和化学稳定性，不易被除灭。
1．2热原的定量表示
热原可以用浓度来定量标度。文献大都以每毫升克数为浓度单位，一般单位为ng/ml，即10-9g/ml，或pg/ml，即10-12g/ml。也有采用EU/ml为热原单位。我国1998年药典确定用EU/ml为热原单位。两个单位之间的换算关系比较复杂，因为来自不同种类细菌的热原毒性表现不尽一致。美国有关部门对大量试样数据采用概率统计方法提出如下结果：对EC2类细菌1ng/ml＝5EU/ml；类细菌1ng/ml＝10EU/ml。日本药检部门报告对EKT类细菌1ng/ml＝8EU/ml。
1．3热原的测定方法
热原的分析、测定方法主要有鲎试剂法和家兔法。
1．3．1鲎试剂凝胶法
该法是利用鲎试剂检测供试品中或其表面可能存在的细菌内毒素浓度的一种方法[3]。目前，各国药典收载的细菌内毒素试验法均包含凝胶法。药品细菌内毒素检查是以凝胶法为基础，通过试验证明供试品某一浓度对凝胶法不存在干扰作用后，在供试品的有效浓度范围内，根据供试品的内毒素限值进行检测的一种方法[4]。此法厦门鲎试剂实验厂的吴伟洪先生已经有近三十年的研究，先后出版了四期的【鲎试剂研究进展】，近些年又推出了显色基质鲎试剂检测后，实现定性到定量的飞跃，为内毒素检测的新方法。
1．3．2家兔法
该法则为各国药典中规定的标准检测方法，可简述为取3只健康家兔各注入规定量的试样，在一天内单兔体温上升不超过0.6℃，3兔总升温不超过1.4℃，即被认为试验中热原含量合格。
无菌与热原（细菌内毒素）
因为我们这没有无菌操作间，一直以来无菌、热原（细菌内毒素）都是委托外面单位检查的，对于原料而言（要求作热原或细菌内毒素检查的），现有如下疑问：
1，无菌不合格，热原（细菌内毒素）一定不合格？那如果热原（细菌内毒素）不合格，无菌是不是就一定不合格？
2，实际操作中，无菌、热原和细菌内毒素，哪个更容易操作？或者说能更有效控制产品质量？
3，如果某原料是供注射剂用的，且原料要求进行细菌内毒素检查，其干扰试验、限度是否得根据制剂的规格、临床用量来设计试验？
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。 （个人认为）无菌不合格，热源（细菌内毒素）不一定不合格，热源不合格，无菌不一定不合格。
细菌内毒素与热原相关，内毒素是药品热原检查不合格的主要原因；在GMP条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：无内毒素即无热原，控制内毒素就是控制热原，这也是药典普遍采用细菌内毒素检查法代替热原检查法的依据。细菌内毒素检查法因其灵敏、准确、快速和经济等优点，越来越多被用于控制药品注射剂质量。
是的，无菌不合格，不一定内毒素不合格。原料药有注射级这一说法，也就是指没有无菌的要求，但是有细菌内毒素的要求，用于生产最终灭菌的产品。
lyslinjiu wrote:
实际操作中，无菌、热原和细菌内毒素，哪个更容易操作？或者说能更有效控制产品质量？
从工艺上看当然是无菌的要求最为复杂而严格了，但是无菌合格的产品也可能含有热原。制剂或者原料除热原最常规工艺就是过炭。
控制产品质量是要根据药品的质量需求而定的，我认为在这里不能用哪个更有效来评价，就比如口服剂，不需要做成无菌。
无菌和细菌内毒素是两个不同的检查项，无菌是检查样品存在细菌的多少；细菌内毒素是检查样品是否存在细菌死亡或解体后释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质，那原料在没有灭菌的情况下，检查细菌内毒素有什么意义呢？
也就说样品不灭菌和灭菌（比如原料和其制剂），设计细菌内毒素干扰试验会有什么区别？细菌内毒素限度、检查结果是否具有可比性？
不知理解是否有误？欢迎指点
对于供注射剂用的原料药，我们一般只控制细菌内毒素，不会对无菌进行要求的，已经足以控制原料药的质量了。原料药进行细菌内毒素检查，其干扰试验、限度都是根据制剂的规格、临床用量来设计试验的。
内毒素完全可以自己在厂里的超净台上做，没有必要委托外面去做，干扰试验、限度不用根据制剂的规格、临床用量来设计试验，你的原料也是有标准的嘛！
请问你做的是无菌原料药吗？无菌和热原就要求的检验条件要高一些，如果是供税针用的，就没有必要做无菌啦
请问floatishere：
我们的原料是供注射剂使用的，不是无菌分装，所以没有无菌要求；原标准是采用热原检查的，审评中心发的补充资料要求我们将热原改为细菌内毒素，所以得我们自己通过一系列试验来确定方法及限度
这种情况下，原料的细菌内毒素如果不根据制剂的规格、临床用量来设计试验，那怎么来设计试验？
包含总结汇报、办公文档、党团工作、外语学习、资格考试、人文社科、考试资料、专业文献、教学教材、应用文书、工作范文、旅游景点、经管营销以及热原是一种致热物质等内容。
相关内容搜索[摘要] 为了确保凝胶法测定细菌内毒素的准确性，我们通过对凝胶法准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、原料及其他)，指出了应用凝胶法测定细菌内毒素时应注意的问题。最后认为只要克服了检查中的干扰因素，凝胶法是最简单、经济、应用最广泛检查细菌内毒素的方法。此外此种方法对干扰不敏感，为《中国药典》的“仲裁”方法。
&&&&[关键词] 凝胶法；热原；注意事项
&&&&[中图分类号]R927 [文献标识码]C [文章编号]07)10(b)-153-02
&&&&《中国药典》2005年版二部将细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法。因凝胶法具有最简单、经济，应用最广泛，对干扰不敏感的优点，因此为《中国药典》的“仲裁”检查方法，而广泛用于注射剂药品细菌内毒素的检查。
&&&&凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够以凝胶法代替家兔热原检查法。多年以来的实践证明，进行细菌内毒素检查前必须具备的条件是：①实验所用器具“无细菌内毒素”；②鲎试剂灵敏度的确证；③无干扰因素。这3条也是检验细菌内毒素试验是否有效的重要标准。
&&&&用凝胶法做细菌内毒素的检查时应注意以下问题：
&&&&1 鲎试剂本身
&&&&1.1 鲎试剂灵敏度
&&&&为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验对结果的改变时 ......&&&&百拇医药网
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