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幽门螺杆菌(HP)研究进展.ppt68页
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PPI，利福布汀，阿莫西林 -含有利福布汀的补救疗法，治愈率在70-80%
加权后平均治愈率 74% -300mg/日的剂量优于150mg/日 -获取有限 -皮疹和胃肠道不良反应最常见，骨髓抑制和眼毒性少见 Chey and Wong,Am J Gastroenterol 8 Luther,Saad,Chey.Hospital Practice 2011 补救疗法：其他的选择 14天高剂量抑酸剂，非铋剂序贯疗法 “杂合”vs“伴同”疗法 治疗Hp感染：一项随机试验
验证在克拉霉素高耐药率
15-20% 的情况下，优化的经验性非铋剂四联疗法是否是一项有效的替代治疗 目
的 Molina-Infante J1 ,Romano M2 ,Fernandez-Bermejo M1 ,Federico A2 ,Gravina AG2 ,Pozzati L3,Garcia-Abadia E4 ,Martinez-Alcala C1,Miranda A2,Vinagre-Rodriguez G1,Perez-Gallardo B1,Hernandez-Alonso M1,Gata-Cuadrado M3,Rancel F4,Gisbert JP5. 优化的非铋剂四联疗法 417例Hp患者入组 74例患者排除： 符合排除标准 n 52
拒绝参加 n 22
343例患者随机分组 杂合疗法 n 171 伴同疗法 n 172 完成 n 163 退出 n 8 完成 n 156 退出 n 16 违反协议 n 1
因不良反应停止 n 5
违反协议 n 2
因不良反应停止 n 10
疗程：14天 高剂量PPI 奥美拉唑 40mg
根除率 在20%的克拉霉素耐药率和10%的双重耐药情况下，PP和ITT均显示，优化的伴同疗法与杂合疗法治愈率≥90%。 PP观察显示：伴同疗法的有效率更高 但无显著性差异 ，与伴同疗法相比，杂合疗法的耐受性与依从性明显更好 结 论 在PPI+阿莫西林+克拉霉素或甲硝唑的三联疗法中，不同剂量阿莫西林对Hp根除率的影响 Takahisa Furuta1）,Mitsushige Sugimoto2）,Mihoko Yamade2）,Takahiro Uotani2）,Shu Sahara2）,Hitomi Ichikawa2）,Takanori Yamada2）,Satoshi Oswa2）,KenSugimoto2）,Hiroshi Watanabe3）.Kazuo Umemura4） 研究在PPI+阿莫西林+克拉霉素或甲硝唑的三联疗法中
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【毕业论文】医学类__幽门螺杆菌可塑区jhp947基因功能的初步研究
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幽门螺杆菌可塑区jhp947基因功能的初步研究
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幽门螺杆菌cag致病岛内cag1基因功能的研究
幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,H.pylori）为人类胃部疾病的重要致病菌之一，世界范围内感染率达到50％。已证实，H.pylori感染与多种胃肠道疾病的发生密切相关，例如慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤。Ⅰ型H.pylori菌株因携带cag致病岛(cagpathogenicityisland，cagPAI)而致其毒性较强。致病岛编码的Ⅳ型分泌系统能够合成并转运H.pylori重要的毒力因子-细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin-associatedgeneA，CagA)进入到宿主细胞内导致细胞功能紊乱。本文选择了该组基因中的第一号基因cag1作为研究对象，通过微生物学、分子生物学、免疫学和生物信息学等技术探讨cag1基因的功能，为深入研究cag致病岛的功能和致病机制奠定基础。　　
1.根据已报道的H.pylori26695全基因序列，利用PrimerPremier6.0设计cag1全长基因引物，用PCR方法从H.pylori11637基因组DNA中扩增目的基因片段，T-A克隆后构建pMD18-T-cag1载体，完成测序工作;使用生物信息学软件:DNAStar、ProtParam、ANTHEPROT5.0和SignalP4.1server对其基本的理化性质和信号肽进行预测分析，同时使用Tmpred、TMHMMv2.0和SOSUI对该蛋白的跨膜区域进行预测。　　
2.使用PrimerPremier6.0设计去信号肽后的cag1基因引物，并构建原核表达载体pET-32a-cag1，将质粒转化入表达工程菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后，确定蛋白是否可溶，大量诱导蛋白后，使用QIAGEN系统Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白。SDS-PAGE电泳、Westernblot分析和质谱方法鉴定目的蛋白。　　
3.纯化后的Cag1融合蛋白免疫家兔，制得兔抗Cag1多克隆抗血清，酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)测定抗体效价。　　
4.利用同源重组原理，设计PCR引物并扩增cag1基因上下游同源臂片段，构建cag1基因缺陷自杀质粒pBlueKM40-Δcag1::kan，电转化进入H.pyloriNCTC11637中，通过抗性筛选出阳性克隆，并使用PCR方法验证后，即获得cag1基因缺陷株。　　
5.将H.pyloriNCTC11637细菌菌体收集并裂解菌体，使用超高速低温离心机对H.pylori进行亚细胞分离，分为膜组分（包括内膜和外膜）、胞质组分和周质组分，包括周质间隙蛋白、胞质蛋白及膜蛋白，使用Westernblot方法，以兔抗Cag1多克隆抗体为一抗，检测Cag1蛋白亚细胞定位。　　
6.将cag1基因缺陷株与NCTC11637野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后，检测CagA蛋白转运量，研究cag1基因缺陷对CagA蛋白转运的影响。　　
7.收集cag1基因缺陷株与NCTC11637野生株，裂解后得到细菌全菌蛋白，分别使用Westernblot方法检测cag致病岛重要编码蛋白CagX、CagM、CagL和CagI的表达量，研究cag1基因对这些蛋白合成与稳定的影响。　　
1.H.pyloriNCTC11637菌株cag1基因全长为348bp，编码蛋白长度为115aa，其相对分子质量为12.42kDa，等电点为8.58。该蛋白属于稳定且亲水性的蛋白。在蛋白两端存在多个亲水区域，而蛋白的中段则是疏水的跨膜区域。预测该蛋白存在信号肽，位置在N端的前21个碱基，在21至22的位置处断裂。并且存在一个跨膜区域，位于蛋白中段，两端亲水，极可能游离于膜外。　　
2.成功构建原核表达载体pET-32a-cag1，在大肠杆菌中异源表达，获得大量目的蛋白Cag1。并通过QIAGEN系统纯化目的蛋白，利用质谱技术对蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备了兔抗Cag1多克隆抗体，效价为1∶3.2×105。　　
3.成功构建cag1基因敲除重组自杀质粒:pBlueKM40-Δcag1::kan。电转化自杀质粒进入H.pyloriNCTC11637菌体内，通过卡那霉素抗性筛选出同源重组成功的菌株，即为H.pyloricag1基因缺陷株:Δcag1。并用PCR方法以及对PCR产物进行测序的方法验证。　　
4.以兔抗Cag1多克隆抗体为一抗作Westernblot分析，确定Cag1位于菌体膜部分;H.pylori与GES-1细胞共培养，检测CagA蛋白转运量，结果显示cag1基因缺陷株CagA转运量比野生株少，但仍具有转运CagA的能力;比较H.pylori野生株和cag1基因缺陷株中四种已知Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达量。结果显示CagX、CagM、CagL和CagI蛋白表达水平没有明显差异。　　
1.成功克隆了cag1全长基因，使用生物信息学方法了解其编码蛋白的理化性质，并预测了其存在的信号肽和跨膜区域。　　
2.成功构建了cag1基因原核表达载体pET-32a-cag1，通过IPTG诱导获得和纯化了大量目的蛋白，免疫家兔后，制备了兔抗Cag1蛋白的多克隆抗体。　　
3.成功构建了自杀质粒pBlueKM40-Δcag1::kan，并且获得了一株cag1基因缺陷株Δcag1。　　
4.确定了Cag1蛋白的亚细胞定位，位于菌体膜部位;证明了cag1基因缺失并没有使H.pylori丧失CagA蛋白转运的能力，但其转运量明显减少;证明了cag1基因缺失对CagX、CagM、CagL和CagI这四种Cag-T4SS重要的结构蛋白的表达和稳定没有影响。
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万方数据电子出版社疣状胃炎及胃癌组织幽门螺杆菌感染与Ki67、COX-2基因表达及意义--《山东大学》2014年硕士论文
疣状胃炎及胃癌组织幽门螺杆菌感染与Ki67、COX-2基因表达及意义
【摘要】：背景与目的：
疣状胃炎(varioliform gastritis, VG)是一种特殊类型的胃炎,又称慢性糜烂性胃炎、痘疹状胃炎等,症状及体征均缺乏特异性,它的特点是复发或持续性胃多发性糜烂,主要依靠胃镜确诊。相关研究表明,其发病可能与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染、胆汁反流、过敏、胃酸分泌异常等因素有关,其中与幽门螺杆菌感染的关系最为密切,但国内外缺乏关于疣状胃炎的基础研究,鲜有深入地从分子水平阐明该病的发病机理的临床报道。一直以来,关于疣状胃炎与幽门螺杆菌感染的关系及其是否癌变备受国内外学者的密切关注,但缺乏微观深入研究该病的恶变倾向及机制的报道。早在1960年有西班牙学者就已经报道过疣状胃炎恶变为原位癌者的病例,而Cappell等在1988年详细报道了1例疣状胃炎逐步演变成胃癌的过程。国内学者姚忆蓉等对73例疣状胃炎进行了5年不间断临床随访,发现其中有4例癌变,病理结果为粘膜内癌,并在随访过程中总结发现疣状胃炎-上皮内瘤变(intraepithelial neoplasia, IN)-息肉-早期胃癌逐渐癌变的特点。临床观察疣状胃炎的上腹部症状较萎缩性胃炎为重,病理表现炎症反应更重,并且上皮不典型增生发生率高,因此可能更具癌变的危险,需加以重视。1990年悉尼国际胃肠病大会明确疣状胃炎为特殊类型慢性胃炎,为胃癌(gastric carcinoma, GC)的癌前疾病之一。幽门螺杆菌是胃粘膜病变的一种重要致病因子,近年来研究发现幽门螺杆菌感染与胃癌的发生密切相关,被国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌因子。Ki67是一种存在于增殖细胞中的核抗原,是由分子量为345KD和395KD两条多肽链组成的核蛋白,它的功能与染色质相连,与细胞有丝分裂有关,是当前应用最广泛的增殖细胞标记之一。Gerdes等研究发现Ki67的反应与细胞周期密切相关,在G1、S、G2、M期均有表达,但在GO期无表达,而且还发现Ki67在G1晚期和S早期微量表达,在S期聚集,尤其在后半期表达率明显升高,而在有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定簇,因此认为Ki67是检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。目前国内外研究表明在多种实体恶性肿瘤中Ki67的表达远高于正常组织,并与恶性肿瘤的发展、转移及预后密切相关。环氧化酶(COX)是一种膜结合蛋白,是前列腺素类生物合成的限速酶,同时具有过氧化物合成酶及环氧化酶的双重酶功能,它有两种亚型,分别是COX-1与COX-2,有研究表明COX-2和萎缩性胃炎、多种恶性肿瘤包括胃癌的发生、发展、转移、分化及预后均有关。Ki67、COX-2及Hp感染之间的关系,以及它们在疣状胃炎及胃癌形成过程中的作用,至今尚未见有临床报道。本研究旨在通过检测疣状胃炎以及胃癌病变组织中的Hp,以及Ki67、COX-2基因表达水平,分析Ki67、COX-2基因表达与Hp感染间的关系,探讨Hp感染引起胃上皮细胞增殖异常导致疣状胃炎及胃癌发生的可能分子机制,探讨幽门螺杆菌与疣状胃炎及胃癌的相关性。
材料与方法：选择在我院由消化科医生经胃镜检查及病理科检查后明确诊断的疣状胃炎(varioliform gastritis, VG)与慢性非萎缩性胃炎(non atrophic gastritis, NAG)胃粘膜病变标本,均取材于胃窦部。其中疣状胃炎117例作为实验组,慢性非萎缩性胃炎62例及胃癌45例作为对照组。疣状胃炎组中未成熟型68例,成熟型49例(分别在疣状隆起中心位置粘膜、疣旁3厘米平坦粘膜取样本)。组织学诊断由我院病理科做出。所有病例取材行胃镜前4周来未接受抗生素、抑酸剂、铋剂、抗过敏药及非甾体抗炎药等药物治疗,未经过任何相关抗肿瘤治疗；未合并其它部位的恶性肿瘤；无消化性溃疡(胃、十二指肠溃疡)病史及手术史。标本均采用快速尿素酶试验(Rapid urease test, RUT)检测Hp,所有标本经10%甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm连续切片,然后行免疫组化染色,镜下观察Ki67、COX-2在组织中的表达。
结果：疣状胃炎组(成熟型、未成熟型)疣状隆起位置粘膜的HP感染率增高,均明显高于NAG组、VG疣旁3厘米粘膜组(成熟型、未成熟型)及胃癌组,差异有统计学意义(p＜0.05)。疣状胃炎组(成熟型、未成熟型)疣状隆起位置粘膜与胃癌组的Ki67、COX-2阳性率较高,均明显高于NAG组、VG疣旁3厘米粘膜组(成熟型、未成熟型),差异有统计学意义(p0.05)。Ki67、COX-2在VG疣状隆起位置粘膜(成熟型)的表达(80%,57%)与VG疣状隆起位置粘膜(未成熟型)(62%,43%)相比有显著性差异(p0.05),但VG疣状隆起位置粘膜(成熟型)(80%,57%)与胃癌组(84%,62%)相比无显著性差异(p0.05)。Ki67、 COX-2在VG疣状隆起位置粘膜(成熟型)、VG疣状隆起位置粘膜(未成熟型)、胃癌病变组织中表达均存在相关性(p0.05)。
结论：幽门螺杆菌在疣状胃炎的感染率高,Ki67、COX-2在疣状隆起病灶部位表达增强,且幽门螺杆菌感染与Ki67、COX-2阳性表达有一定的相关性,三者可能参与了疣状胃炎中疣状隆起病灶部位的形成,并通过促使细胞异常增殖而涉及胃癌的发生过程。成熟型疣状胃炎(疣状隆起部分)的潜在癌变倾向高于未成熟型疣状胃炎。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：R735.2【目录】：
中文摘要6-9ABSTRACT9-13符号说明13-14前言14-17材料和方法17-20结果20-24讨论24-36结论36-37参考文献37-45附图45-53致谢53-54攻读硕士期间发表的论文54-55学位论文评阅及答辩情况表55
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