嗜肺军团菌胶体金免疫层析检测试剂的研制--《中国人民解放军军事医学科学院》2008年硕士论文
嗜肺军团菌胶体金免疫层析检测试剂的研制
【摘要】：
军团菌(Legionella)是一种细胞内寄生的革兰氏阴性杆菌,可侵入人类肺泡巨噬细胞及其他巨噬细胞、肺泡上皮细胞和水生环境中的原虫中并寄生。在巨噬细胞内,军团菌破坏小泡传输,产生空泡,阻止吞噬体-溶酶体融合,阻止内涵体和溶酶体的杀菌作用,建立其独有的复制型吞噬体,以二分裂复制,产生大量的吞噬体,充满宿主细胞,导致宿主细胞死亡。该菌广泛存在于自然界水和土壤中,在人工水环境中也可长期存活,自来水中可存活1年以上,蒸馏水中也可存活2~4个月。近年来,对建筑物内外环境水的抽查结果显示,军团菌的检出率高达60%以上。目前,人工水系统产生的气溶胶已被认为是军团菌传播的主要途径,这预示着随着工业全球化的发展,军团菌可能成为威胁人类健康的重要病原体。迄今,已发现军团菌属有43个种、65个血清型,其中与人类疾病关系最密切的为嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,LP),80~85%的军团菌肺炎由LP引起,现已发现15个血清型。
人类因吸入含有军团菌的气溶胶而引起的一种急性细菌性呼吸道传染病称为军团病(Legionnaires’Disease,LD),以庞蒂亚克热(Pontiac fever)和军团菌肺炎为主要表现,易暴发流行,大约1/3的社区获得性肺炎(Community-acquired pneumonia,CAP)是由军团菌引起的。大多数LD患者有与其它病原体引起的非典型肺炎相似的临床表现,如咳嗽、发热和肌痛,胸部X片显示肺部浸润现象等,故常导致误诊和漏诊,未及时确诊或恰当治疗的LD患者死亡率达25~40%。因此,快速、准确地确定病原体是控制疾病的关键。
由于80~85%的军团菌肺炎是由LP引起的,故对其的快速检测尤为重要。LP感染检测方法很多,细菌培养仍是疾病诊断的金标准,但因LP培养条件苛刻,耗时较长,不利于临床快速确诊。WHO推荐的其他检测方法有直接荧光抗体法(DFA)、间接荧光抗体法(IFA)、试管凝集试验(TAT)、微量凝集试验(MAT)、酶免疫法(EIA)及DNA探针等。所需检测标本为患者呼吸道标本(痰、支气管肺泡灌洗液及肺活组织等)或成对血清标本(急性期和恢复期)。而军团菌肺炎患者的临床症状之一是少痰;支气管肺泡灌洗液及肺活组织的采集具有创伤性,不易被患者接受;患者感染后第3~6周血清抗体含量才能达到检测水平,达不到早期诊断的要求,从而限制了上述技术在临床的推广应用。
研究表明,大多数LD患者在感染1~3天后即可在尿液中排出一种具有热稳定性及抗胰蛋白酶活性的LP O-多糖抗原,该抗原浓度比血清中高30~100倍,故对患者尿液标本中特异性、可溶性LP抗原的检测,可快速、准确的确定病原菌。
针对LP尿抗原的检测方法主要有DFA、放射免疫法(RIA)及EIA等。但因DFA法敏感性不高;RIA法具有放射性;EIA耗时较长等不足,不推荐临床应用。近年来,胶体金免疫层析技术(gold immunochromatographic assay,GICA)在LP的快速检测中得到了应用,并取得了一定成效,其主要原理是将抗LP特异性抗体包被在硝酸纤维素膜上,用以捕获尿液标本中的LP抗原,然后用胶体金标记同一抗体,标记抗体在层析中可与捕获到的抗原在膜上出现肉眼可见的沉淀带。与其它方法比较,该技术优势在于敏感性高、特异性好,检测过程中标本处理简单,不需要专门仪器和人员培训,非专业技术人员按照说明书即可操作,迅速获得结果,非常适合突发事件现场和基层使用。
国外已有LP感染的胶体金免疫层析检测试剂产品出售。目前,世界各国普遍采用的是美国缅因州波特兰Binax公司生产的Binax NOW ICT试剂盒,检测的靶抗原为LD患者尿液标本中LP1型O-多糖抗原,但该试剂盒不适用于其它LP血清型及其它军团菌种感染的检测。国内尚无同类产品。
LP的15个标准血清型中,LP1型LD占LP感染的80~90%,LP5型O-多糖抗原为多种LP血清型所共有,故本研究分别采用兔抗LP1抗体和兔抗LP5抗体,根据双抗体夹心法原理来初步建立两种LP抗原胶体金免疫检测试剂。主要研究工作从以下几个方面进行:
1、LP1~7、9和10型多糖抗原的制备与鉴定
将LP1~7、9和10型菌株分别接种在缓冲活性炭酵母琼脂培养基(BCYE)上,37℃、5%CO2的条件下培养,3~5天后洗下菌苔,经抽提、除蛋白、透析等步骤后得到基本无蛋白的LP多糖抗原,经紫外分光光度仪全波长扫描及Western blotting验证其抗原良好。
2、兔抗LP1抗体和兔抗LP5抗体的制备与鉴定
分别用LP1、LP5型多糖抗原免疫家兔,采用琼脂糖双向扩散试验检测,两种抗体血清效价均为1:32;饱和硫酸铵法提取抗体,SDS-PAGE检定其抗体纯度均达到80%以上。
3、胶体金免疫层析检测试剂的初步研制
采用柠檬酸三钠还原法制备约25nm大小的胶体金颗粒;分别制备兔抗LP1抗体、兔抗LP5抗体的金标探针,两种抗体的最适标记量均为30μg/选择适当孔径的微孔滤膜为载体包被两种抗体,NC膜包被浓度均为5mg/ml。
两种LP抗原胶体金免疫层析检测试剂的实验室考核结果表明:LP1检测试剂对LP1型抗原的最低检出量为10ng/ml,不与其他血清型交叉,与Binax NOW ICT试剂盒的检测结果一致;LP5检测试剂可检出包括LP1~7、9和10型在内的9个血清型抗原,最低检出量分别为:LP2~5型为0.1μg/ml,LP1、7、9和10型为1μg/ml,LP6型为10μg/ml。
实验室考核初步认为以上两种LP抗原检测试剂有望用于LD的诊断,但还需进一步作临床考核验证。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：R446.6【目录】：
中文摘要6-9
英文摘要9-12
实验材料14-20
实验方法20-25
实验结果25-34
参考文献39-41
硕士期间发表文章41-54
个人简历54-55
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