鱼腥藻PCC7120铁调蛋白基因all1691的初步研究--《中南民族大学》2014年硕士论文
鱼腥藻PCC7120铁调蛋白基因all1691的初步研究
【摘要】：蓝藻（Cyanophyceae）或蓝细菌分布广泛，种类繁多，形态多样，电镜下可见光合色素汇集的类囊体，因此蓝藻是一种光合自养型原核微生物，在食用、资源开发、环境净化等方面都有较高的应用价值。鱼腥藻PCC7120异形胞的发育调控及固氮机制的研究基本完善，本文研究对象铁摄取调节蛋白FurA受控于异形胞发育调控因子NtcA，各部件紧密联系于精细网络中保证藻细胞正常的活性。
本研究第一部分是在前期研究基础上，选取鱼腥藻Anabaena sp. PCC7120为实验材料，以藻内铁摄取调节基因fur（ferric uptake regulator）作为研究对象，旨在对鱼腥藻PCC7120中铁摄取调节基因furA(all1691)及其相关基因进行克隆和表达，并探究环境中Fe3+浓度对藻生长情况的影响。首先对传统的酚氯仿法进行改进，提取鱼腥藻PCC7120染色体总DNA，由Cynobase提供的序列信息设计特异性引物，以鱼腥藻PCC7120总DNA为模板进行Touch-down PCR，扩增furA、furB、furC这3个fur同源基因片段，运用TA克隆获得稳定保存的pMD-fur菌液，经质粒提取及双酶切，将目的片段与表达载体pET-28a进行连接，转入表达宿主菌E.coli BL21中构建furA重组表达质粒载体pET-1691，在1mmol/L的IPTG诱导下，于37℃下摇床培养15h，经SDS-PAGE检测到含表达载体系统自带标签（T7和组氨酸标签）的约19KD的蛋白条带，为了得到实验条件下蛋白表达的最优表达量，前期已对诱导温度、诱导剂浓度等影响因素进行探究实验，发现在37℃、0.8mmol/L IPTG诱导表达量最佳。本实验对诱导时间进行了探究，发现12h是诱导时间设置中的最佳诱导时间。为了预测蛋白结构与功能，辅助生物信息学的方法，利用在线软件对FurA进行分析发现，它属于定位于细胞质基质，与细胞壁结合的蛋白，构建的三维图显示边缘具有约5个螺旋结构域，包裹中间区域的β折叠结构区。进一步对蛋白进行纯化，用于后续研究。
本研究第二大部分设计不同Fe3+浓度，系统化的研究藻细胞在生长过程中藻细胞密度、蛋白含量、叶绿素含量和总糖含量这些生长指标的变化，以探究对鱼腥藻PCC7120的生长影响。结合分光光度法、标准曲线法和分子生物方法，从生长曲线看出，低铁浓度组（0-0.6mg/L）生长速率随着铁浓度增大而增大，尤其到达0.6mg/L，增长斜率最大，为藻细胞的最适生长浓度；中间铁浓度组（0.6-0.9mg/L），当浓度达0.9mg/L时，生长情况下滑，表现为叶绿素浓度、总蛋白、糖类含量的总体下降，尤其是高铁浓度组（1.4-4mg/L）时，藻类不堪高浓度铁负荷，生长每况愈下。缺铁组的RNA条带亮度最弱，Fe3+浓度为2.0mg/L时藻细胞密度最大，RNA浓度最高，条带最亮。这些变化与预期结果基本一致，即低浓度铁促进藻生长，反之抑制。
鉴于淡水藻类研究甚少，前期实验已实现了FurC的表达，本文选择铁调控路径中发挥主要作用的FurA为主要研究对象，结合生物信息学方法，对鱼腥藻PCC7120中的铁摄取机制基础研究进一步完善及应用的推广，具有一定意义。
【关键词】：
【学位授予单位】：中南民族大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：Q943.2【目录】：
摘要7-9Abstract9-11第一章 综述11-25 1.1 蓝细菌11-15
1.1.1 蓝细菌概论11-12
1.1.2 蓝细菌生理生化特性12-15
1.1.3 蓝细菌分子研究进展15 1.2 鱼腥藻（Anabaena sp.）PCC712015-19
1.2.1 异形胞的固氮作用16-18
1.2.2 遗传转化的研究进展18-19
1.2.3 鱼腥藻毒素（Anatoxins）19 1.3 铁摄取调节因子 Fur19-23
1.3.1 地球中的铁19-21
1.3.2 HNLC 中的铁限制21-22
1.3.3 鱼腥藻 PCC7120 中的铁摄取调节因子 Fur22
1.3.4 Fur 族及其调控22-23 1.4 研究内容、方案与意义23-25
1.4.1 研究内容23
1.4.2 研究方案23-24
1.4.3 研究意义24-25第二章 T-A 克隆与表达载体构建25-43 2.1 引言25 2.2 材料与方法25-35
2.2.1 实验材料25
2.2.2 试剂与仪器25-29
2.2.3 PCR 引物29-30
2.2.4 实验方法及步骤30-35 2.3 结果35-41
2.3.1 鱼腥藻 Anabaena sp. PCC7120 染色体组 DNA 的提取35
2.3.2 furA，furB，furC 三个基因 PCR 扩增检测35-37
2.3.3 T‐A 克隆重组质粒检测37-38
2.3.4 pET‐all1691 表达载体构建38-40
2.3.5 实验组、阴阳对照组的转化平板40-41 2.4 讨论41-43第三章 重组质粒的蛋白表达43-52 3.1 引言43 3.2 材料与方法43-47
3.2.1 实验材料43
3.2.2 试剂与仪器43-45
3.2.3 实验方法及步骤45-47 3.3 结果47-50
3.3.1 FurA 蛋白表达47
3.3.2 诱导时间对蛋白表达量影响47-48
3.3.3 FurA 蛋白生物信息学分析结果48-50 3.4 讨论50-52第四章 Fe3+对鱼腥藻生长的影响52-62 4.1 前言52 4.2 材料与方法52-56
4.2.1 实验材料52
4.2.2 试剂与仪器52-53
4.2.3 实验方法及步骤53-56 4.3 结果56-61
4.3.1 不同 Fe3+浓度下 PCC7120 生长曲线56-57
4.3.2 不同 Fe3+浓度下藻培养液蛋白含量变化57-58
4.3.3 不同 Fe3+浓度下藻培养液叶绿素浓度变化58-59
4.3.4 不同 Fe3+浓度下藻培养液总糖含量变化59-60
4.3.5 三种 Fe3+浓度下培养的鱼腥藻总 RNA 的提取60-61 4.4 讨论61-62结论与展望62-64参考文献64-70致谢70-71附录A 研究生在读期间发表的论文71
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京公网安备75号内部萃取电喷雾电离质谱法筛查食管癌组织分子特征物质--《中国化学会第二届全国质谱分析学术报告会会议摘要集》2015年
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【作者单位】：
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【分类号】：R735.1;O657.63【正文快照】：
图1食管癌患者配对的癌症与癌旁正常组织i EESI-MS谱图.a)癌症;b)癌旁。内部萃取电喷雾电离质谱法筛查食管癌组织分子特征物质@张建勇$东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室!330013$南昌大学第二附属医院!330006
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