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怀孕几个月能查出胎儿是否琦形
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你是说四维彩超检查呀，这个在怀孕23到28周之间的时候就可以检查的，不过这个好像是需要提前预约的吧，最好是提前去医院预约一下
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你好,一般在怀孕两个多月，快三个月的时候.最好去医院做个检查，看看胎儿的发育情况，因为三个月前如果有不好的情况，也比较好处理。
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一般的做B超应该是在60天左右的时候做,这时就能够看到胎囊,胎芽,胎心是否正常.
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你好,怀孕后是应该定期去医院作相关的检查的,需要多次检查才有可能早期发现胎儿的异常.
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怀孕期间产检的话，这个是需要整个周期就需要检查的，三十七周以后足月的话，孩子正常的话，也就没事了对于这样的情况，这个是可以从怀孕四五十天的时候开始产检，以后定期产检，随时观察孩子的生长发育的变化就可以的
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运用第二代测序技术对母体血浆中胎儿游离DNA进行β地中海贫血无创性产前诊断的应用性研究
【摘要】：研究背景与目的
β地中海贫血是p珠蛋白合成减少(β+)或缺失(βo),造成血红蛋白(α2β2)生成障碍,导致无效造血和红细胞破坏而产生溶血性贫血。p地中海贫血有三种临床表型：携带者、中间型地中海贫血和重型地中海贫血。
β地中海贫血分子基础是位于11号染色体短臂1区5带5亚带(11p15.5)位点上的p珠蛋白(HBB)缺陷所致。迄今为止,已发现200多种突变类型,p地贫表型分为β0和p+两种类型,β0地贫无珠蛋白产生,p+地贫有低于正常水平的p珠蛋白产生。在中国人群的p地贫突变中,中国南方地区有5类突变最为常见,占突变类型的92.5%,分别是：(1)密码子41-42(-TCTT),即在HBB基因第41和42密码子区域出现4个核苷酸的缺失引起移码突变,导致肽链合成提前终止,产生β0地贫；(2)IVS-2-654(C-T),使mRNA加工异常产生β+地贫；(3)TATA盒-28(A-G),使mRNA转录效率降低,从而使p珠蛋白链合成减少,产生p+地贫；(4)密码子17(A-T),引起无义突变,生成无功能的mRNA,产生β0地贫；(5)异常血红蛋白E,是异常血红蛋白中最常见的一类结构异常,导致中间型地贫。
目前,对于重型地中海贫血患者缺乏有效的治愈方法,因此对夫妇双方为地中海贫血基因携带者的孕妇进行地贫基因产前诊断(prenatal diagnosis),可有效预防地贫患儿的出生。
产前诊断是现代遗传病诊断的重点,也是临床产科学的重要组成部分,是通过物理、生化和遗传等诊断技术和方法,对胎儿的遗传状况进行诊断,其主要目的在于为遗传病风险家庭提供充足可靠的信息,使他们在妊娠期做出适当的选择。侵入性方法是获取胎儿物质最直接的方法,是目前产前诊断广泛使用的方法之一,主要通过羊膜腔穿刺术、绒毛取样术、脐静脉血取样术等方式获取到充足的胎儿物质用于遗传学检测,但存在流产(0.2%-3%),绒毛膜炎,羊水渗漏,穿刺部位出血、感染,胎儿心动过缓,胎膜早破等手术并发症,增加孕妇风险同时加重孕妇及家属焦虑情绪。因此大力发展无创性产前诊断技术是临床医务工作者和科学研究者共同努力的方向。
从2007年发现母体血浆中存在胎儿游离DNA至今,p地中海贫血作为常染色体隐性遗传性疾病的常见病之一被学者做为单基因疾病模型进行无创性产前诊断的方法学研究。最初采用飞行质谱、AS-PCR等方法针对父母携带不同突变的胎儿进行父源性突变等位基因排除性诊断,但该方法存在局限性：(1)不能对携带了父源性突变等位基因的胎儿行进一步的诊断。(2)不能针对双亲携带相同突变的胎儿进行诊断。
随着数字化PCR、液滴数字化PCR以及第二代测序等绝对定量技术的出现,及相对突变剂量(RMD)这一理论的提出,推进了单基因疾病的无创性产前诊断的发展,使得从cfDNA中鉴别胎儿是否遗传了母源性突变位点成为现实。目前研究利用SNP的特点,通过父母具有不同信息的SNPs位点进行RMD分析,通过序贯概率比检验(SPRT)来判断胎儿是否携带双亲的致病突变位点,达到无创性产前诊断的目的。但SNPs作为第三代人类遗传物质标签,受人群、种族等因素影响,其等位基因的频率存在差异性,因此,需要建立一组与地域、人群等相关的具有诊断价值的SNPs数据库,尽管目前可以通过液相杂交捕获的方法获取HBB基因上成千上万的SNP位点,但捕捉芯片价格昂贵,不适合广泛的临床应用。
鉴于以上技术方法的缺点和不足,本研究拟以地中海贫血为研究对象,采用PCR捕获的方法对地贫突变基因位点进行富集,应用Illumina Miseq台式高通量测序平台建立一种快速、经济、准确的无创产前诊断方法。p地中海贫血基因突变以点突变为主,其中IVSII-654、CD41-42、CD17.-28和HbE5种突变最为常见,由于-28和-29突变位点相邻,可通过同一对引物进行扩增,因此本研究拟针对以上6种突变进行设计引物,通过扩增子对目标区域进行富集,富集后的片段经Miseq深度测序。针对双亲携带不同突变位点的样本,首先对父源性突变等位基因进行排除性诊断,而后通过RMD结合SPRT方法对母源性突变位点进行诊断。针对双亲携带相同突变位点的样本直接通过RMD和SPRT方法对胎儿基因型进行分析。本研究拟建立的方法简便、快捷有望实现地中海贫血无创性产前诊断的临床转化,推进单基因疾病无创性产前诊断的临床应用,为我国的优生优育工作做出贡献。
材料与方法
本研究对象为2012年1月至2013年1月分别到南方医科大学南方医院、新加坡国立大学国立医院妇产科就诊的144个计划接受产前诊断的p地中海贫血家系,其中124个家系中双亲携带的p地贫突变位点涉及实验设计的5个p地贫突变位点(IVSII-654、CD41-42、CD17、-28、-29)和HbE,将其纳入进一步研究。以上124个家系中,孕妇孕龄在10.57-32.14周,平均孕周20.29±0.36周；10例孕妇接受绒毛取样术,101例孕妇接受羊膜腔穿刺术,13例孕妇接受脐静脉穿刺术(产前诊断标本收集标准：孕龄11-13+6周行绒毛取样术,16-24周行羊膜腔穿刺术,24+1-32周行脐静脉穿刺术)。家系标本收集包括孕妇外周血10ml(穿刺术前抽取),胎儿标本(绒毛标本1-2mg,羊水标本5ml,脐静脉血500u1),孕妇配偶外周血2ml。
采集孕妇外周血10ml,4℃保存6小时内需进行血浆分离：Eppendorf低温离心机4℃,1600g离心10分钟,小心将血浆转移至2.0mlEP管内,避免扰动血棕黄层。将装有血浆的2.0mlEP管离心10分钟,转速16000g/min,将所得血浆转移至新的EP管内。血浆DNA采用QIAamp(?) Circulating Nucleic Acid试剂盒进行手工提取。
母体血浆游离DNA经PCR捕获法对目的片段进行富集,通过第二代测序技术平台对其进行深度测序,检测内容包括：(1)母体血浆DNA中胎儿DNA含量(fetal fraction)定量检测：a.应用性别决定区域的特异性位点ZFX/ZFY及INDEL多态性位点对胎儿性别及胎儿游离DNA含量进行检测。ZFX/ZFY诊断标准：ZFY%4%为男性胎儿；ZFY%1%为女性胎儿,ZFY%介于1%-4%之间,为不能确定的结果；INDEL诊断标准：每个样本至少包含2个或2个以上的有生物信息的INDEL多态性位点,将胎儿游离DNA含量在4%-50%之间的IN/DEL信息纳入胎儿游离DNA含量计算。(2)针对双亲携带不同型致病基因突变的胎儿基因型检测：a.通过对母体血浆DNA中父源性突变位点的直接检测可判断胎儿是否携带父源性突变等位基因；b.对于cfDNA母源性突变等位基因检测,主要通过RMD和SPRT方法进行分析。(3)针对双亲携带相同型致病基因突变的胎儿基因型检测：基于胎儿DNA含量的定量检测,对cfDNA中致病基因的突变型和野生型进行定量检测,测序结果通过RMD和SPRT分析对胎儿基因型进行诊断。
结果中的计量资料除特别表述外,均表述为X±SD,样本间的显著性均用双侧检验。通过两种文库构建方法检测所获得的母体血浆中Y染色体含量的比较和ZFX/ZFY生物标记与IN/DEL多态性位点对胎儿含量检测的比较选用配对t检验,两种文库构建方法诊断率的比较、父源性排除性诊断方法与金标准以及母源性等位基因单倍型诊断方法与金标准比较采用配对x2检验进行统计学分析。
以a=0.05为显著性检验水准。所有统计数据均用SPSS19.0统计软件分析。实验结果
(1)胎儿性别诊断及胎儿游离DNA定量检测结果
在124个样本中,长引物和短引物同时诊断为男性52例,诊断为女性47例,均为不能确定性别的样本7例。长引物和短引物诊断中分别出现2例错误结果。将两方法进行配对卡方检验分析,提示两种方法诊断胎儿性别的结果无显著性差异,P0.05(P=0.255).
124例样本胎儿游离DNA含量通过INDEL方法进行检测,63例男性胎儿胎儿游离DNA含量均数为11.834±7.706。采用配对t检验将IDNEL与ZFX/ZFY结果进行比较,P0.05(t=-3.000,P=0.004),提示通过INDEL检测的胎儿游离DNA含量与ZFX/ZFY检测值存在显著性差异,IN/DEL方法获得的胎儿游离DNA含量较高。61例女性胎儿游离DNA含量分布范围2.33%-20.9%,均值12.183±4.899.124个cfDNA样本中,平均每个样本包含11个有诊断价值的INDEL位点。
(2)母体血浆DNA中父源性突变位点的排除性诊断
在124个β地贫家系中,83(83/124,66.9%)个家系胎儿双亲携带不同β地贫突变位点,2个家系父源性突变为-28和HbE杂合性突变,累计病例数为85例。本研究的PCR扩增子平均每个碱基的测序深度读数为460.002±430.854。
83例双亲携带不同突变位点的样本进行父源性突变等位基因诊断结果显示33(33/83)例诊断为未携带父源性突变等位基因,可排除重型患儿的可能；47例诊断为携带了父源性突变等位基因,需进一步行母源性等位基因单倍型分析；3例为假阳性结果。通过本研究建立的重叠扩增子深度测序的方法进行父源性突变等位基因排除性诊断的准确率为96.4%(80/83),该方法的灵敏度为100%,95%CI(92.4%-100%),特异性为91.67%,95%CI(78.17%-97.13%),阳性预测值为94%,95%CI(83.78%-97.94%),阴性预测值为100%,95%CI(89.57%-100%)。将Miseq诊断结果与RDB结果采用McNemar方法进行比较,两方法无显著性差异,P0.05(P=0.250)。(3)双亲携带不同p地贫突变位点家系中母源性突变位点的诊断结果及双亲携带相同突变位点的cfDNA诊断结果
83例cfDNA样本中,经RMD结合SPRT分析方法进行母源性突变位点检测,结果显示47例样本携带了母源性突变等位基因,36例排除了母源性突变等位基因的携带。与RDB结果相比较,7例为假阴性结果,8例为假阳性结果,应用RMD方法进行母源性诊断方法的灵敏度84.78%,95%CI(71.78,92.43%)；特异性78.38%,95%CI(62.8%-88.61%)。阳性预测值和阴性预测值分别是82.98%,95%CI(69.86%-91.11%)；80.56%,95%CI(64.97%-90.25%)。将Miseq诊断结果与RDB结果采用McNemar方法进行比较,两方法无显著性差异,P0.05(P=1.000)。
41个家系双亲携带相同的突变位点,其诊断策略和诊断标准与母源性突变等位基因相同,结果显示胎儿诊断为携带者20例,纯合子患儿6例,正常个体15例；诊断率为75.61%,假阴性结果8例,假阳性结果2例。将Miseq诊断结果与RDB结果采用McNemar方法进行比较,两方法无显著性差异,P0.05(P=0.112)。
分析与讨论
本研究通过INDEL多态性位点结合Y染色体特异性基因位点对母体血浆中胎儿游离DNA进行定量检测,所选择的45个INDEL多态性位点在中国南方人群中具有较高的杂合度,每个样本平均有11个INDEL位点可提供可靠的生物信息,为女性胎儿游离DNA的定量检测提供了可靠的理论基础。本研究通过PCR方法对p地中海贫血常见的6个突变位点进行直接捕获,目标序列经第二代测序技术进行深度测序。从母体血浆中寻找父源性突变等位基因是目前最常用的排除重型地贫的有效的排除性诊断方法,其准确率与所采用的定量检测平台相关,本研究选用的illumina公司的NGS测序平台具有高通量,绝对定量检测等优势,可准确的对父源性突变位点进行排除性诊断。本研究所建立的父源性突变位点排除性诊断方法的灵敏度为100%,95%CI(92.4%-100%),特异性为91.67%,95%CI(78.17%-97.13%),阳性预测值为94%,95%CI(83.78%-97.94%),阴性预测值为100%,95%CI(89.57%-100%)。通过父源性突变位点筛查,可排除临床约50%的重型胎儿,从而避免了行侵入性产前诊断。除此以外,该方法的优势还在于可以早期对胎儿游离DNA进行诊断,据文献报道,可对孕5-7周的孕妇行无创性产前诊断。对于母源性突变位点的胎儿基因型诊断,我们通过RMD和SPRT方法进行分析,该方法方法的灵敏度84.78%,95%CI(71.78-92.43%)；特异性78.38%,95%CI(62.8-88.61%)。
阳性预测值和阴性预测值分别是82.98%(69.86-91.11%)；80.56%(64.97-90.25%)。除此以外,该方法同时可对双亲携带相同突变位点的家系进行分析,其诊断率为75.61%。导致母源性突变位点检测出现假阴性或假阳性结果的因素主要考虑：(1)胎儿游离DNA含量较低,增加检测的错误率；(2)PCR扩增过程中可能出现的错配,导致后续的检测出现错误结果；(3)待检测序列中的GC含量分布是导致测序发生错误的一个关键因素,需要进一步通过生物信息学方法对原始数据进行修正。结论
本研究将建立的基于PCR捕获特异性片段的NGS测序方法应用于p地中海贫血的无创性产前诊断领域,通过对父源性突变等位基因进行直接诊断,可排除50%的重型患儿,本方法的阴性预测值为100%,可准确的预示未携带父源性突变等位基因的胎儿,避免了行侵入性产前诊断。对于携带了父源性突变等位基因的胎儿及双亲携带相同突变的胎儿可通过RMD和SPRT方法进行母源性突变等位基因筛查,可降低侵入性诊断的风险。本研究所建立的方法操作简便、准确率较高,有望成为单基因疾病无创性产前诊断的诊断模型广泛应用于其他单基因疾病的无创性产前诊断。
【关键词】：
【学位授予单位】：南方医科大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：R714.5【目录】：
摘要3-10ABSTRACT10-18引言18-31第1章 前言31-34 (一) β地中海贫血的分子基础31-32 (二) 重型β地中海贫血基因型与临床表现32-33 (三) 血红蛋白E异常的分子基础和临床表现33-34第2章 实验材料34-39 2.1 研究对象34-35 2.2 主要试剂35-36 2.3 主要仪器36-37 2.4 计算机软件和数据库37 2.5 试剂37-39第3章 实验方法39-63 3.1 本研究所采用的技术路线39-40 3.2 基因组DNA模板的制备40-43 3.3 母体血浆DNA模板制备43-44 3.4 基因组DNA检测44-48 3.5 基于Miseq高通量测序的PCR捕获法的方法建立和评价48-62 3.6 统计学方法62-63第4章 实验结果63-89 4.1 基因组DNA诊断结果63-65 4.2 目标序列捕获后的文库构建结果65-68 4.3 Miseq检测结果68-89第5章 分析与讨论89-106 5.1 母体血浆中胎儿游离DNA(cffDNA)定量检测体系的建立89-95 5.2 母体血浆DNA中父源性突变位点的排除性诊断95-102 5.3 母体血浆DNA中母源性突变位点诊断策略102-106小结106-108参考文献108-117攻读博士学位期间所发表论文117-118附录一 124个地贫家系gDNA基因分型结果118-124附录二 知情同意书124-133附录三 统计审核证明133-134致谢134-135英文缩略词表135-137
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