脐血分离脐血单个核细胞胞用什么分离液

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供应GE 淋巴细胞分离液Ficoll-Paque PLUS
GE&淋巴细胞分离液Ficoll-Paque&PLUS&17------5442-52细胞分离液Ficoll-Paque&PLUS,已在市场上销售了30多年。是无菌的、即用型的Ficoll-泛影酸钠,有着合适的密度、粘度和渗透压,能够简单快速的从人外周血、骨髓和脐带血中分离淋巴细胞,它的内毒素水平非常低,小于0.12EU/ML。分离所得的细胞中95%左右为单个核细胞,细胞存活率大于90%,回收率为60%左右。Ficoll-Paque&PREMIUM密度为1.077&g/ml,经过优化用于从人外周血分离单核细胞,所采用的方法为由Boyum&(3)&改进的简便快速的离心方法。此介质亦可用于从包括骨髓和脐带血等组组织来源中分离人单核细胞。采用推荐的方法分离人外周血获得的单核细胞悬液具有以下特点:&●&分离所得的细胞中95&±&5%为单核细胞&●&分离所得的细胞存活细胞率&>&90%&●&可回收原始的血液样本中60&±&20%的单核细胞&●&3&±&2%的粒细胞&●&5&±&2%的红细胞订购信息:(符合ISO和GMP)&&&产品编号&&&&&&&&&&&&&&&&&产品名称&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&包装&&&&&&&&&&&&目录价&&&&&&&&&&&密度17-1440-02&&&&&Ficoll&Paque&PLUS&&&&&&&&&&&&6x100ml&&&&&¥1980.00&&&&1.077g/ml17-1440-03&&&&&Ficoll&Paque&PLUS&&&&&&&&&&&&6x500ml&&&&&¥6990.00&&&&1.077g/ml17-5442-02&&&&&Ficoll&Paque&Premium&&&&&&&6x100ml&&&&&¥2250.00&&&&1.077g/ml&17-5442-03&&&&&Ficoll&Paque&Premium&&&&&&&6x500ml&&&&&¥7890.00&&&&1.077g/ml17-5446-02&&&&&Ficoll&Paque&Premium&&&&&&&6x100ml&&&&&¥2780.00&&&&1.084g/ml&&&&&new17-5442-52&&&&&Ficoll&Paque&Premium&&&&&&&6x100ml&&&&&¥2780.00&&&&1.073g/ml&&&&&newFicoll&PaquePLUS是一种无菌的,用于提纯少量或大量人外周血中高产和高纯度的淋巴细胞的即用型密度梯度介质。基于Boyum发展方法中的一简单快速的离心操作来完成纯化过程。Ficoll-Paque&plus也可以用来制备除人外周血其他来源的淋巴细胞。相关产品Ficoll-Paque?&PREMIUM1、Ficoll-PaqueTM&PREMIUM由Ficoll&TMPM&400和密度为1.077&g/ml的泛影酸钠混合物组成,经过优化用于从人&外周血分离单个核细胞,所采用的方法为由Boyum&(3)&改进的简便快速的离心方法。2、分离所得的细胞中95&±&5%为单核细胞,分离所得的细胞存活细胞率&>&90%。3、按照ISO和(GMP)标准进行生产4、无菌,即用型产品,避光储存在4-30℃之间,保存3年.Ficoll-Paque&PLUS1、无菌的,用于提纯少量或大量人外周血中高产和高纯度的淋巴细胞的即用型密度梯度介质。2、是FicollTMPM400和密度1.077g/ml的泛影酸钠的无菌内毒素(<0.12EU/ml)测试溶液3、原血液样品中60&±&20%的淋巴细胞的回收率,分离所得的细胞中95&±&5%为单核细胞。Ficoll?&PM400&通过离心或沉降形成密度梯度来分离真核细胞,细胞器和细菌细胞Percoll?&PLUS1.&&&&用于密度梯度离心分离分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒,还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。低内毒素(<2EU/ml),无毒,无菌2.&&&&非常适用于在临床研究中分离细胞Percoll用于密度梯度离心分离分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒(小到70S),还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离,无毒。Density&marker&beads标记珠基于Sephadex?填料,经过改变葡聚糖的交联度,此标记珠可配套Percoll?/RediGrad?进行密度标记。&冻干状态,室温保存5年&&
北京冬璞泰和科技有限责任公司 (Beijing Dongputaihe Technology Co.,LTD) 是一家专注于生命科学研究领域的高科技企业 。公司以“聚焦生命科学,发展科研技术”为中心理念,为广大科学工作者提供包括分子生物学、细胞生物学、免疫学、蛋白组学、临床诊断等领域的试剂、耗材、抗体、仪器等相关产品,其服务行业涵盖生命科学基础研究、临床疾病诊断与控制、生物制品的开发与应用、制药、商品检验检疫、人口与健康、食品安全以及农林牧渔等诸多领域,面向客户群体有各大医学院、医科大学、生命科学院、农林业大学、研究所、医院、卫生防疫部门、检验检疫部门、公安系统、制药公司、生物技术公司等单位。
冬璞泰和 与国内外各大生物领域保持密切合作关系,凭借深厚的行业人脉和丰富的专业经验为广大科研用户提供更强大的技术支持和产品动态。
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技术支持:论文:脐血采集后分离时间对单个核细胞玻璃化冷冻效果的影响-中大网校论文网3个脐带血单个核细胞分离的问题(单个核细胞,脐带血,离心管,白膜) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 3个脐带血单个核细胞分离的问题(单个核细胞,脐带血,离心管,白膜)
摘要: [3个脐带血单个核细胞分离的问题(单个核细胞,脐带血,离心管,白膜)] 本人刚开始做脐带血单个核细胞分离的实验,在实验中有几个问题想请教一下坛子里的各位高手。非常期待大家能给我解答,谢谢!1
使用淋巴细胞分离液分离细胞时,细胞悬液(PBS等体积稀释)和分离液的比例应如何选择?我看到坛子里和文献中说法各异,有1:1,也有2:1,还有1:2的,我不太清楚,不同的比例对分离的效果是否会有影响?2
密度梯度离心的转速选择,是转速越高分离效果越好吗?还是有选择转速的规律?我 关键词:[离心管 单个核细胞 脐带血 白膜 淋巴细胞分离液 分离液 密度梯度离心]……
本人刚开始做脐带血单个核细胞分离的实验,在实验中有几个问题想请教一下坛子里的各位高手。非常期待大家能给我解答,谢谢!1. 使用淋巴细胞分离液分离细胞时,细胞悬液(PBS等体积稀释)和分离液的比例应如何选择?我看到坛子里和文献中说法各异,有1:1,也有2:1,还有1:2的,我不太清楚,不同的比例对分离的效果是否会有影响?2. 密度梯度离心的转速选择,是转速越高分离效果越好吗?还是有选择转速的规律?我用的是50ml,转速2500rpm,25min。在分界面上能看到模糊的白膜层,只是层间分界不是特别清楚。这种情况是否可以用提高转速或者降低转速来解决?3. 我分离时看到的白膜层量还挺大的,但是用PBS洗(15ml,1200rpm,10min,洗2遍)之后根本在离心管底看不到清晰的细胞沉淀。种进孔板培养,3天后换液观察也发现贴壁细胞很少。这是否跟洗细胞时用的离心管有关?我用的是旧的15ml离心管,是否应改用新的离心管?希望坛子里的各位高手能多给我指点,非常感谢!
回复1、这个比例不是绝对的。首先确保分离液在管子中有一定高度,至少在锥形管变细的部位以上1cm。在此前提下,细胞悬液与分离液的比例1:1,2:1应该没什么太大影响(我用2:1),但1:2就纯属浪费了,个人意见哈。2、转速和时间肯定是有个合适的区间的,转速太高,单个核细胞也会沉下去,转速太低又分不开,或者白膜层压不好。比较常见的是2000rpm(大的台式水平),20度,20min。这个没有绝对最优数值,比如成人外周血和脐带血,正常人血和病人血(肝炎病人)最佳分离条件可能就不一样,分离效果不好时要自己摸索,速度和时间上、下变动一下。3、你第一次洗细胞的转速用得太低了,至少要1500rpm。取白膜层的最高境界是吸走最少的液体量将白膜层取干净。取白膜层时如果混的分离液多的话,第一次洗细胞离心速度就要加大细胞才能沉下来。而且加了PBS后要充分混匀,将整体密度降下来,要不然高密度的液体都集中在下面,细胞更不容易离下来。第一次洗完拿到细胞后,第二次再低速离心以去除血小板,800~1000rpm (我用1000rpm)。这个跟管子新、旧没什么关系。回复非常感谢TCR的解答!很详细!谢谢!得到很大启发啊~ 下次改进实验再试一下。我刚开始做这个实验,估计在取白膜层的技术上还存在很大问题,我每次都怕取的细胞量少,所以可能带走了很多的分离液……
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上海研谨生物科技有限公司
上海市北青公路6725弄
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产品详细描述
本系列产品目录
1. 适用于各种动物血液及脏器组织本系列产品检索
2. 相关试剂及耗材
3. 注意事项
5. 产品性能指标
6. 贮藏及保存期限
7. 实验前准备
8. 各种动物单核细胞分离液试剂盒使用方法说明及图例
9. HES-TBD550 使用说明
10. 组织单细胞悬液的制备
11. 生产企业
1. 适用于各种动物血液及脏器组织本系列产品检索:::
2. 注意事项
A. 本分离液是敏光型的,在运输和贮藏过程中应在 18℃-25℃避光保存,启封后置 4
℃保存避免微生物污染。另外,本品为真空包装,未启封前置于 10℃ 以下易出现白色结晶,
影响分离效果。
B. 待分离的血液、组织及细胞要求新鲜,避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一
定在20℃水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好,
且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。
C. 由于各品牌离心机的性能不同,国内南北地区温度环境和四季的差异,可能影响
分离效果,用户可以调节离心转数,调节离心的时间,摸索最佳的分离条件(具体分离条件
各实验室自定)。
D. 最好使用无静电反应的离心管,推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。
E. 最优抗凝剂选择:EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂
F. 分离过程中所用其他试剂如:羟乙已基淀粉 550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及红细
胞裂解液等以我公司产品为最优选择,本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内
毒素水平且无细胞毒性,所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。
适用于从动物血液或脏器组织中分离单核细胞。
5.. . . 产品性能指标
pH 7.0-7.5
渗透压 280-340mOsmol/kg
内毒素 ≤0.5...EU/ml
无菌 直接接种培养 14 天后培养基澄清
澄明度及不溶性颗粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下,,,
含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下
6. 贮藏及保存期限 6. 贮藏及保存期限
18℃-25℃避光保存,有效期两年。启封后置 4℃保存,有效期一周。
注:若保证无微生物污染,启封后可置 4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易
出现白色结晶,影响分离效果。
7. 实验前准备 7. 实验前准备
单核细胞分离液试剂盒所含试剂、组织匀浆液、羟乙已基淀粉 550、胎牛血清
玻璃离心管、玻璃滴管
水平转子离心机、无菌工作台
8. 各种动物 8. 各种动物单核细胞分离液试剂盒使用方法说明及图例
A. 在 10ml 或 15ml 玻璃离心管中依次小心加入 A、D 两种液体各 2ml,制成梯度界面(各液面分层一定要清晰);
B. 取 1ml新鲜抗凝血按1:1比例与全血及组织稀释液混匀并小心叠加于D液之液面上;或将组织单细胞悬液(细胞浓度为2×108
-1×109个/ml,制备方法详见“10.组织单细胞悬液的制备方法”)叠加于D液之液面上;
C. 以400g(约1500转/分)离心15分钟(半径15cm水平转子);
此时离心管中由上至下细胞分为六层。第一层;为血浆(稀释液)层。第二层;;;为;单核
细胞层。。。第三层;为透明 D 液层。第四层;为淋巴细胞层。第五层;为透明 A 液层。第六层;
为极少量红细胞层。收集第二层单核细胞放入含 4-5ml 细胞洗涤液的试管中,充分混匀后,
以 500g(约 1800 转/分)离心 20 分钟,弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤 2 次即得所需单核细胞。
注::A. 提取率约为 80%。
B. 分离大量样品时,具体操作方法请参照我公司“淋巴细胞快速分离技巧”,查询路径:
登陆我公司网站,在产品搜索中输入您要的产品名称→点击查询→或者直接联系我的客服!
 血液(人)中各细胞含量参考值 中各细胞含量参考值::: :
男:4.0-5.5×1012/L(400-550 万个/mm3
女:3.5-5.0×1012/L(350-500 万个/mm3 红细胞 )
新生儿:6.0-7.0×1012/L(600-700 万个/mm3
***:4.0-10.0×109
/L( 个/mm3
) 白细胞 新生儿:15.0-20.0×109
/L( 个/mm3
血小板 100-300×109
/L(10 万-30 万个/mm3
名称 占白细胞总数百分比 占白细胞总数百分比
嗜中性粒细胞 30%-70%
嗜酸性粒细胞 0.5%-5%
嗜碱性粒细胞 0%-1%
淋巴细胞 20%-40%
白细胞分类计数
单核细胞 3%-8%
9. HES- 9. HES-TBD550 使用说明
HES 是从支链淀粉衍生出来的,是富含淀粉的复合物,其生理和化学特性主要由羟乙已基
取代度即取代级、平均分子量决定。大量实验表明平均分子量越大对红细胞的凝集作用越强,
有效提高红细胞的沉降速度,从而使红细胞与其它细胞分离。故而,使用 HES-TBD550(羟
乙已基淀粉 550)沉淀法是一种高效的细胞分离方法。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、
骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞,是在
细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细胞。MSCs 不仅存在于骨髓,也可从脐血、
外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分离。UCB - MSCs 的分离、筛选、
增殖、分化与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、扩增分化过程中操作技术等多种因
素有关。目前用于 UCB - MSCs 分离的方法有:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪
法和免疫磁珠法。流式细胞仪法对细胞损伤较大,免疫磁珠法价格相对较贵且由于抗原抗体
反应也容易改变细胞原有特性,而 HES-TBD550(羟乙已基淀粉 550)联合密度梯度离心法常与贴壁筛选法结合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的纯度,目前研究多采用此法。国内不少学者采用羟乙已基淀粉沉淀红细胞,然后再进行离心分离单个核细胞,也取得不错结果。实验
证明采用随机数字表法,将每份脐血随机分入两个不同处理组,从而将脐血样本的个体差异
减小到最小程度。结果证实,HES-TBD550(羟乙已基淀粉 550)联合密度梯度离心法获得的有核细胞数量明显多于 FICOLL 密度梯度离心法。本实验采用的羟乙已基淀粉商品名为
HES-TBD550(羟乙已基淀粉 550),克分子渗透压为 308mosm/L,胶体渗透压为 68/36 mmHg,
可影响红细胞集聚性沉降率。红细胞集聚是可递性桥接结构形成的结果,由大的 HES-TBD550
(羟乙已基淀粉 550)分子处在红细胞之间联接而成。HES-TBD550(羟乙已基淀粉 550)同时还
阻碍白细胞和内皮细胞的黏附,并使平均血小板容积呈现微弱地降低,从而有轻度抑制血小
板集聚的功能。脐血经 HES-TBD550(羟乙已基淀粉 550)处理后,可使红细胞沉积至试管底,
对其它主要成分包括干细胞无影响。经这样处理后,实验时间相对较短(平均为 1.5 h),
步骤相对较少,细胞污染几率小,从而使细胞数损失减少。结论证明,与相应的干细胞分离
液联合分离使用羟乙已基淀粉沉淀法是一种高效的脐血干细胞分离方法。
10. 组织单细胞悬液的制备 10. 组织单细胞悬液的制备
注::::A.. .. 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法,,,酶消化法由于各实验室选取的消化 ,酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类各不相同,,,请各实验室自行选择进行试验 ,请各实验室自行选择进行试验。。。 。
B. .. 全过程及所需试剂要求无菌环境 B. 全过程及所需试剂要求无菌环境。。。 。
剪碎法:::将组织块放入平皿后 : ,加入少量组织匀浆液及 20%胎牛血清;用眼科剪将组织剪至
匀浆状,加入 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清;用吸管吸取组织匀浆,用 100 目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内;离心沉淀1500转/分×3 min,再用细胞洗涤液清洗3次,每次以500rpm
短时低速离心除去细胞碎片,以 200 目不锈钢滤网(另购)过滤去细胞团块。作细胞计数并
调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血
清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108
-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。
匀浆器法:用眼科剪将组织剪成小块;放入 70ml 组织研磨器内,加入 2ml 组织匀浆液及 20%
胎牛血清;缓慢转动研棒,研磨至匀浆;用 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清冲洗研器;收集
细胞悬液,经 200 目不锈钢滤网(另购)过滤;离心沉淀 800rpm×2min ,再用细胞洗涤液
洗 3 次,离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为(2~5)×107个/ml。常温下放置, 待测
细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108
-1×109 个
/ml 的单细胞悬液备用。
细胞计数方法:
细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板(血球计数板)
进行。既可用于分离(散)细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,也可用于
对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何,均须制备分散的细胞悬液。
计数与计算过程
1)、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。
2)、用玻璃虹吸管吸取细胞,让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹处流出悬液,至
盖玻片被液体充满为止。
3)、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者,
对于细胞团按单个细胞计数。
4)、按下式计数细胞悬液的密度:
细胞密度=(4 个大格细胞总数/4)×104个/ml×稀释倍数
公式中乘以 104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3
而 1ml=1000mm3
细胞计数要点::: :
A. 进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于 104个/ml,如果细胞数目很少要进行离
心再悬浮于少量培养液中;显微镜下计数时,遇到 2 个以上细胞组成的细胞团,应按单个细
胞计算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分; 或细胞数500 个/10 mm2
时,说明稀释不当,?重新制备细胞悬液。
B. 要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
C. 取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混
匀,以求计数准确;
D. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细
胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计左线,不计右线。
E. 操作时,注意盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
初学者易犯的错误::: :
A. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
B. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
C. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。
12. 参考文献 12. 参考文献
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中国医学科学院生物医学工程研究所灏洋生物联合实验室监制 本品只能用于科学研究,,,不能用于临床检测 ,
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[13] 鄂征.组织培养.北京出版社,1995.
[14] 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社,2000.
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一种简便提取脐带血单个核细胞的方法
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