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大家还关注复极储备相关钾通道在心力衰竭时的变化及相互作用研究--《南开大学》2013年博士论文
复极储备相关钾通道在心力衰竭时的变化及相互作用研究
【摘要】：背景与目的：心力衰竭(心衰)时恶性室性心律失常和心源性猝死发生率增加,严重影响患者的生活质量甚至危及生命。研究显示心衰时心律失常发生率增加与复极储备障碍或功能丧失关系密切,复极储备主要依赖于快速延迟整流钾电流(IKr)通道和缓慢延迟整流钾电流(IKs)通道离子流在心肌复极过程中相互作用产生的代偿性补充,从而缓冲动作电位时程(APD)过度延长。本课题一方面利用兔腹主动脉缩窄心衰模型,研究心衰时心室肌细胞中KCNH2和KCNQ1基因在mRNA水平表达的变化情况,以及与动作电位(AP)、IKr通道和IKs通道离子流之间的关系,探讨心衰时复极储备改变的特征及机制；另一方面利用转染技术将KCNH2和KCNQ1基因导入细胞,研究二者在mRNA.蛋白及离子通道水平的相互影响,进一步探讨复极储备中离子通道间的相互作用机制。为心衰时恶性室性心律失常及心源性猝死的机制研究提供实验与理论依据。
研究方法：24只日本大耳白兔随机分为假手术组(Sham)和心衰模型组(HF),每组12只,分别行腹主动脉分离术和腹主动脉缩窄术,术后常规饲养12周,评价一般情况及心脏超声指标,判定HF组模型建立达标情况。Sham组与HF组动物均麻醉取心脏,灌流分离心室肌细胞,提取总RNA用RT-qPCR方法,比较目的基因KCNH2及KCNQ1的mRNA表达量在两组间的差别,应用膜片钳技术辅以钾离子通道阻滞剂多非利特(Dof)和293B药物,检测心衰时心室肌细胞AP,比较复极至50%的动作电位时程(APD50)、复极至90%的动作电位时程(APD90)、动作电位幅值(APA)和静息膜电位(RMP)在各条件下的变化情况,测定心室肌细胞IKr电流和IKs电流在不同条件下的改变。另一方面应用瞬时转染技术,将HEK293细胞随机分为7组,即单独将KCNQ1(Q1组)、野生型WT-KCNH2(WT组)、功能获得型T618I-KCNH2(T618I组)和功能缺失型V535M-KCNH2(V535M组)与空质粒共转染,及将KCNQ1分别与各功能型KCNH2共转染(依次为Q1+WT组、Q1+T618I组和Q1+V535M组)。转染后培养48h,提取细胞总RNA和总蛋白,分别应用RT-qPCR和Western Blot方法检测目的基因在mRNA和蛋白水平的相对表达量,比较各组间的差别,同时应用膜片钳技术检测不同功能型KCNH2对KCNQ1电流的影响。
研究结果：
(1)与Sham组相比,HF组兔心室肌细胞KCNH2基因和KCNQ1基因在mRNA水平表达均显著降低(P0.05)。
(2)与Sham组相比,HF组兔心室肌细胞AP、APD50和APD90均显著延长(P0.05),其中HF组给予Dof干预后,AP、APD50和APD90均进一步延长(P0.05),若加用293B共同干预,则AP、APD50和APD90延长程度与单独给予Dof相比增加更显著(P0.05)。
(3)兔心室肌细胞APA和RMP在Sham组、HF组及给予Dof,293B干预的HF组中无明显差异(P0.05)。
(4)HF组兔心室肌细胞IKr电流密度与Sham组相比显著降低(P0.05),给予Dof干预后,两组IKr电流密度均显著下降(P0.05),且HF组表现更为明显。
(5) Sham组和HF组中,兔心室肌细胞IKr尾电流(IKr,tail)均随刺激脉冲正移不断增加,但HF组增加幅值低于Sham组。给予Dof干预后,两组的IKr,tail均被抑制,随刺激脉冲电压增加抑制效应增强,且对HF组作用更明显。
(6)HF组兔心室肌细胞IKs电流密度与Sham组相比显著降低(P0.05),给予Dof干预后IKs电流密度显著回升(P0.05),但未恢复至正常水平。
(7)不同功能型KCNH2与KCNQ1共转染均可使KCNQ1在mRNA水平的相对表达量显著升高(P0.05),Q1+V535M组升高最显著,Q1+WT组次之,Q1+T618I组升高程度最小。共转染KCNQ1可使不同功能型KCNH2在mRNA水平表达均出现升高,仅野生型升高程度有统计学意义(P0.05)。
(8)不同功能型KCNH2与KCNQ1共转染均可使KCNQ1在蛋白水平表达升高(P0.05),其中Q1+T618I组作用最显著,Q1+WT组作用次之,Q1+V535M组作用最弱。共转染KCNQ1可使不同功能型KCNH2在蛋白水平表达均升高,但差异无统计学意义(P0.05)。
(9)野生型WT-KCNH2与KCNQ1共转染能够使KCNQ1峰电流密度从152.8±7.5pA/pF增加至209.3±9.1pA/pF(P0.05),功能获得型突变T618I-KCNH2与KCNQ1共转染使KCNQ1峰电流密度升高相对较弱,仅升高至169.2±6.7pA/pF(P0.05),功能丧失型突变V535M-KCNH2与KCNQ1共转染使KCNQ1峰电流密度升高最为明显,KCNQ1峰电流密度可升高达253.5±13.6pA/pF (P0.05)
(1)在mRNA水平,心衰能够使心室肌细胞KCNH2和KCNQ1表达均降低。
(2)心衰时心室肌细胞APD延长,IKr和IKs电流密度降低,复极贮备功能障碍。抑制IKr电流APD延长增加不大,若同时抑制IKr和IKs两种电流,则APD延长显著加重。
(3) KCNH2与KCNQ1均能使彼此在mRNA水平的表达升高,且KCNQ1升高程度与KCNH2的功能呈负相关。
(4)相似地,KCNH2与KCNQ1均能使彼此在蛋白水平的表达升高,且KCNQ1升高程度与KCNH2的功能呈负相关。
(5) KCNH2能够使KCNQ1峰电流密度增加,且升高程度与KCNH2的功能呈负相关。
【关键词】：
【学位授予单位】：南开大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：R541.6【目录】：
中文摘要5-8Abstract8-19引言19-34 第一节 心力衰竭时心源性猝死发生的研究背景及现况19-20 第二节 动作电位在心力衰竭时变化的研究20-21 第三节 复极储备与心力衰竭时心律失常的关系21-22 第四节 延迟整流钾电流在复极储备中的作用22-24 第五节 心衰模型的建立依据24-26 第六节 细胞转染的基本原理及应用26 第七节 RT-qPCR测定的基本原理及意义26-28 第八节 Western Blot的基本原理及意义28-29 第九节 膜片钳技术的基本原理及应用29-30 第十节 研究目的及意义30-34第一部分 兔心衰模型中复极储备通道mRNA变化机制的研究34-83 第一章 实验方案34-55
第一节 实验流程34-35
第二节 实验对象35
第三节 实验仪器及材料35-37
1.3.1 建立心衰模型手术器材35
1.3.2 提取RNA及RT-qPCR检测器材35-36
1.3.3 兔心室肌细胞膜片钳检测相应设备36-37
第四节 药品及试剂37-38
1.4.1 建立心衰模型所需药品及试剂37
1.4.2 提取RNA、RT-qPCR检测及膜片钳实验相关试剂37-38
第五节 相关溶液配制38-41
第六节 实验方法41-55
1.6.1 实验分组41-42
1.6.2 兔腹主动脉缩窄法建立心衰模型42-44
1.6.2.1 兔腹主动脉缩窄术的操作步骤42-44
1.6.2.2 兔心衰的评定标准44
1.6.3 兔心室肌细胞分离44-46
1.6.4 兔心室肌细胞总RNA制备及浓度测定46-47
1.6.4.1 兔心室肌细胞总RNA的提取46-47
1.6.4.2 RNA浓度测定与纯度判定47
1.6.5 RT-qPCR的具体操作步骤及结果运算方法47-50
1.6.5.1 逆转录的具体操作步骤47-48
1.6.5.2 定量PCR的具体操作步骤48-49
1.6.5.3 2~(-△△Ct)值的运算方法49-50
1.6.6 全细胞膜片钳记录电流方法50-52
1.6.6.1 兔单个心室肌细胞的预处理50
1.6.6.2 全细胞膜片钳记录方法50-51
1.6.6.3 诱发电流参数的设定及结果记录51-52
1.6.7 统计学处理52-55 第二章 实验结果55-67
第一节 兔腹主动脉缩窄心衰模型建立的评定结果55-58
2.1.1 兔腹主动脉缩窄心衰模型中一般情况的变化55-56
2.1.2 兔腹主动脉缩窄心衰模型中心脏超声指标的变化56-58
第二节 心衰对兔心室肌细胞I_(Kr)和I_(Ks)通道mRNA表达的影响58-61
2.2.1 心衰对兔心室肌细胞KCNH2在mRNA水平表达的影响58-59
2.2.2 心衰对兔心室肌细胞KCNQ1在mRNA水平表达的影响59-61
第三节 钾通道抑制剂对心衰兔心室肌细胞复极储备相关离子流的影响61-67
2.3.1 钾通道抑制剂对心衰兔心室肌细胞AP的影响61-63
2.3.2 I_(Kr)通道抑制剂Dof对心衰兔心室肌细胞复极储备相关离子流的影响63-67 第三章 讨论67-80
第一节 兔腹主动脉缩窄心衰模型建立的效果评价67-70
3.1.1 兔腹主动脉缩窄心衰模型中一般情况的变化67-68
3.1.2 兔腹主动脉缩窄心衰模型中心脏超声指标的变化68-70
第二节 心衰对兔心室肌细胞I_(Kr)和I_(Ks)通道mRNA表达的影响70-73
3.2.1 心衰对兔心室肌细胞KCNH2在mRNA水平表达的影响70-72
3.2.2 心衰对兔心室肌细胞KCNQ1在mRNA水平表达的影响72-73
第三节 钾通道抑制剂对心衰兔心室肌细胞复极储备相关离子流的影响73-77
3.3.1 钾通道抑制剂对心衰兔心室肌细胞AP的影响73-75
3.3.2 I_(Kr)通道抑制剂Dof对心衰兔心室肌细胞复极储备相关离子流的影响75-77
3.3.2.1 I_(Kr)通道抑制剂Dof对心衰兔心室肌细胞I_(Kr)电流的影响75-76
3.3.2.2 I_(Kr)通道抑制剂Dof对心衰兔心室肌细胞I_(Ks)电流的影响76-77
第四节 小结77-80 第四章 结论80-83第二部分 复极储备重要离子流I_(Ks)与I_(Kr)相互作用的研究83-137 第一章 实验方案83-110
第一节 实验流程83-84
第二节 实验对象84
第三节 实验仪器及材料84-86
1.3.1 HEK293细胞培养及转染部分仪器及材料84
1.3.2 RNA及蛋白提取及检测部分仪器及材料84-85
1.3.3 全细胞膜片钳检测部分相应设备85-86
第四节 药品及试剂86-95
1.4.1 细胞培养及转染相关试剂86-94
1.4.2 RNA及蛋白提取及检测相关试剂94-95
1.4.3 全细胞膜片钳检测相关药物和试剂95
第五节 相关溶液配制95-97
第六节 实验方法97-110
1.6.1 实验分组97
1.6.2 HEK293细胞培养的操作步骤97-99
1.6.2.1 细胞复苏98
1.6.2.2 细胞冻存98-99
1.6.2.3 细胞传代99
1.6.3 HEK293细胞转染质粒的操作步骤99-101
1.6.3.1 细胞计数99-100
1.6.3.2 转染前细胞预处理100
1.6.3.3 细胞转染100-101
1.6.4 HEK293细胞RNA提取及RT-qPCR的具体步骤101-103
1.6.4.1 HEK293细胞总RNA的提取101-102
1.6.4.2 HEK293细胞总RNA浓度的测量及纯度的判定102-103
1.6.4.3 RT-qPCR的具体操作步骤及结果运算103
1.6.5 HEK293细胞蛋白提取及Western Blot的具体步骤103-107
1.6.5.1 细胞总蛋白的提取103-104
1.6.5.2 细胞总蛋白含量的测定104-105
1.6.5.3 Western Blot的具体操作步骤105-107
1.6.6 HEK293细胞全细胞膜片钳检测KCNQ1电流的具体操作107
1.6.7 统计学处理107-110 第二章 实验结果110-125
第一节 KCNH2和KCNQ1质粒转染HEK293细胞后在mRNA水平的相互影响110-115
2.1.1 HEK293细胞共转染各功能型KCNH2对KCNQ1基因mRNA表达的影响110-111
2.1.2 HEK293细胞共转染KCNQ1对各功能型KCNH2基因mRNA表达的影响111-115
第二节 KCNH2和KCNQ1质粒转染HEK293细胞后在蛋白水平的相互影响115-119
2.2.1 HEK293细胞共转染各功能型KCNH2对KCNQ1在蛋白水平表达的影响115-117
2.2.2 HEK293细胞共转染KCNQ1对各功能型KCNH2在蛋白水平表达的影响117-119
第三节 HEK293细胞共转染各功能型KCNH2对KCNQ1电流的影响119-125
2.3.1 共转染功能野生型质粒WT-KCNH2对KCNQ1电流的影响119-121
2.3.2 共转染功能获得型质粒T618I-KCNH2对KCNQ1电流的影响121-122
2.3.3 共转染功能缺失型质粒V535M-KCNH2对KCNQ1电流的影响122-125 第三章 讨论125-134
第一节 KCNH2和KCNQ1质粒转染HEK293细胞后在mRNA水平的相互影响125-127
3.1.1 HEK293细胞共转染各功能型KCNH2对KCNQ1基因mRNA表达的影响125-126
3.1.2 HEK293细胞共转染KCNQ1对各功能型KCNH2基因mRNA表达的影响126-127
第二节 KCNH2和KCNQ1质粒转染HEK293细胞后在蛋白水平的相互影响127-129
3.2.1 HEK293细胞共转染各功能型KCNH2对KCNQ1在蛋白水平表达的影响127-128
3.2.2 HEK293细胞共转染KCNQ1对各功能型KCNH2在蛋白水平表达的影响128-129
第三节 HEK293细胞共转染各功能型KCNH2对KCNQ1电流的影响129-130
3.3.1 共转染功能野生型质粒WT-KCNH2对KCNQ1电流的影响129-130
3.3.2 共转染功能突变型质粒T618I-KCNH2或V535M-KCNH2对KCNQ1电流的影响130
第四节 小结130-134 第四章 结论134-137参考文献137-146致谢146-149附录149-166 参考文献159-166个人简历166-167
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刘盈盈;[D];吉林大学;2007年
权友琼;[D];福建医科大学;2011年
王红举;[D];浙江大学;2006年
张馨文;[D];第二军医大学;2006年
林培林;[D];青岛大学;2007年
刘永岭;[D];天津医科大学;2005年
崔国元;[D];中国医科大学;2009年
汤琪;[D];广州中医药大学;2009年
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京公网安备74号都说高压输电 是为了减小损耗 根据I^2RT 在电阻不变的时候 减小电流就减小损失 疑问的是 既然电压那么高 电阻又一定 I=U/R 那应该电流很大啊?_百度作业帮
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都说高压输电 是为了减小损耗 根据I^2RT 在电阻不变的时候 减小电流就减小损失 疑问的是 既然电压那么高 电阻又一定 I=U/R 那应该电流很大啊?
都说高压输电 是为了减小损耗 根据I^2RT 在电阻不变的时候 减小电流就减小损失 疑问的是 既然电压那么高 电阻又一定 I=U/R 那应该电流很大啊?
高压输电输的是电压不是电流,电压是作用在用电器上的不是导线上的.而且由于涉及变压器等电感器件,欧姆定律不成立.还有补充高中书上的一点就是其实高压交流输电最大的考虑不是电阻损耗而是电感和电容损耗.而这两者除了和交流电的频率有关,就是和电压有关.改变交流的频率很麻烦,而电压很容易改变,所以采用高压输电.加载中，请稍候...
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