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免疫组化技术总结
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下载文档:免疫组化技术总结.PDF免疫组化抗原技术 _百度百科
特色百科用户权威合作手机百科 收藏 查看&免疫组化抗原技术本词条缺少概述、信息栏、名片图，补充相关内容使词条更完整，还能快速升级，赶紧来吧！ 现AR技术已广泛应用于免疫组化(ihc)各领域的研究例如在诊断病理学和IHC的标准化方面对原来仅表达在冰冻切片上的抗原利用AR后绝大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上对IHC回顾性研究和临床病理IHC鉴别诊断肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估具有积极的意义福尔马林固定时组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键使得不少抗原决定簇被封闭同时由于甲醛的聚合作用使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络也导致了抗原决定簇被掩盖这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应因此抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素抗原修复(AntigenretrievalAR)技术建立在Fraenkel-conrat等人一系列生物化学研究经1991年shi等人发展抗原修复是指石蜡冰冻火棉胶塑料切片免疫组织化学(IHC)前用胰蛋白酶尿素表面活性剂微波缓冲液和金属盐等使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果成为一种有效的补救措施本文的目的是概述AR-HIC的发展应用和标准化
一AR技术加热AR技术微波加热方法.在传统标准方法,经脱蜡脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧(化)物酶石蜡切片经蒸馏水冲洗放置在塑料Coplin缸中加入AR液如蒸馏水缓冲液金属盐液尿素等盖上并置家用微波炉加热5或10分钟(注意防止切片干躁)有时在加热5分钟后间隔1分钟再加热5分钟(在第一个5分钟后检测液体高度)加热后从微波炉取出塑料Coplin缸冷却15分钟片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟才进行IHC染色为了保持一致的加热条件必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin缸按照不同的抗体设定不同的加热时间尽可能的建立标准的加热条件微波(MW)加热过程如下在专用盒内放入200ml柠檬酸缓冲液(PH6.0±0.1)并盖上带有小孔的盖子微波加热至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中放入已沸腾缓冲液中有作者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率800W微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(根据目前的研究,建议用医用微波炉)中档继续处理10-20分钟;取出微波塑料缸冷却至室温从缓冲液中取出玻片片子经蒸馏水冲洗二次之后用PBS(PH7.2-7.4)冲洗两次每次3分钟尽管有少数作者认为经高温后冷却这一步省略在我们观点15分钟的冷却必须的几点理由1如这一步省略对于有些抗体而言会降低AR-IHC染色强度2突然从高温到低温可导致组织片掉片3可能引起形态学的变化单纯加热方法.将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉(600W)上加热至沸腾并持续10minShi等人用单纯加热方法与微波加热方法比较IHC染色强度显示两种方法导致相同的染色强度高压加热方法.Shin等人发展了含水高压锅煮沸方法来增强福尔马林固定的脑组织tau蛋白免疫反应性将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内加热至产生喷气并持续2min压力锅离开热源加热长短的控制很重要从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟时间过长可能会使染色背景加深现试剂公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法这几年的实践表明采取此方法可避免假阳阴性使IHC染色效果更佳非加热AR技术非加热AR技术包括酶消化酸水解等方法目前主要是酶消化酶消化是以化学的方法来打断醛键修复抗原胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的无水氯化钙水溶液中溶解即可;或由迈新提供的0.125%的液体胰酶将切片放入湿盒内37oC温箱中消化18-20分钟胃蛋白酶消化法.用0.1mol/LHCL配制成0.4%的胃蛋白酶;链霉蛋白酶消化法.将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中浓度为o.1%消化时间20min抗原修复的方法选择关系到组织抗原能否暴露充分这对免疫组化染色效果有很大影响因此应当根据不同的抗原特点采用不同的修复方法对某些细胞内抗原(如FasBaxFⅧ等)和细胞间质抗原(如LamininCoIV等)则需要用酶消化法处理切片常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶一般说来胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱主要用于细胞内抗原的消化胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择这样针对性更强标记效果更理想总之,以高压加热方法微波加热方法较为稳定,高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法溶液的浓度对修复效果无任何影响而PH值则影响较大缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用前人的研究表明温度高修复时间短解放军第251医院根据临床病理诊断鉴别诊断和研究的实际需要在抗原修复方法规范研究和应用的基础上创用了胰蛋白酶尿素联合消化技术盐酸水解暴露抗原技术和MW表面活性剂TritonX100(MWTX)修复抗原技术抗原暴露或抗原修复方法较多其中发MW枸橼酸缓冲液使用较多效果最好MW修复抗原的方法是石蜡切片脱蜡水洗后放入修复液中用250W的输出功率2X5min待冷却至室温按常规处理目前AR过程已成功应用在BioTek全自动免疫组化染色仪中二AR应注意的问题加热持续时间和强度是重要的影响因素之一AR液的PH值浓度化学成分也是重要的影响因素之一使用低PH值AR液必须使用阴性对照片以防止定位不准Shi等人强调修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要,实验中我们也发现要获得满意结果必须选择抗原修复液的最适PH值在常规石蜡切片做AR-IHC采用不同浓度的Alcl3液做AR液发现4%的Alcl3取得最理想的染色在修复的抗原中金属盐可影响蛋白的结构郑辉等人使用0.01mmol/LPBS0.01mol/L柠檬酸缓冲液0.1mol/LTris-HCL缓冲液及1mmol/LEDTA-Na2于微波修复抗原发现其阳性强度逐渐增强高温抗原修复因其机理相当复杂对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原经过量修复后绝大部分表达在核内例如P185Bcl-2P-gpNm23而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内例如P53PCNAKi-67等在使用该方法时一定小心对结果的判断也要客观地作出分析侯宁等人发现端粒酶逆转录酶(TRT)经过抗原修复与不经过抗原修复其染色效果明显不同后者的阳性率明显高于前者操作中还应注意如下问题1热处理后应注意自然冷却2热处理时要防止切片干燥3应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法4一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致5注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会明显的破坏而对细胞核的影响较大会出现核破裂苏木素淡染等现象而经酶水解的切片其细胞浆破坏视消化时间而异但核破坏较轻)6如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复或经修复后抗原定位发生改变可改用一些不常用的缓冲液或加一些螯合剂如EDTA等可改善某些抗原的修复用于IHC消化的酶很多所选酶的种类使用的浓度PH值消化时间及温度等均要视组织固定的不同所检测抗原的性质组织类型的不同而异应通过预实验摸索确定使用酶消化的原则胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原如KeratinCEAGFAP等胃蛋白酶则主要用于细胞间质抗原的检测如fibronectinLaminin各型胶原等一般来言消化时间和组织固定的长短呈正比在用酶消化热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法有时会取得较为满意的结果一般蛋白酶K和微波相结合但应注意可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应三AR的临床应用上个世纪九十年代早期随着AR技术的发展IHC应用在常规处理火胶棉包埋的人类颞骨上从分子水平上了解人类发病机理和病理生理学创立了一个新的领域使用AR方法在常规处理石蜡切片上评估IC5和ID15单克隆抗体的免疫组化染色Charalambous.C等人强烈推荐MW-AR-IHC方法检测R-S细胞的CD30AR技术成功应用于原位杂交利用加热AR-IHC技术在福尔马林固定石蜡组织切片上用抗毒素#4350检测nestin采用抗复技术在人类上皮神经神经内分泌组织中免疫组化定位DCC蛋白AR-IHC已广泛应用于临床的研究中四AR的标准化和发展抗原修复的确切原理尚不十分清楚根据国内外文献报道推测可能是1溶解洗脱变性蛋白2水解作用3微波场内离子或极性分子直接碰撞的修复作用抗原修复是否可能?理论上研究尚未清楚但是以高温高压对常规石蜡切片进行抗原修复处理经验表明可以提高抗原抗体阳性检测率同时也会出现假阳性诊断IHC上的AR技术及其在基础领域的研究已被为数众多的文献和比较多的综述所阐述此领域的调查目的从分子生物学诊断常规上在石蜡组织中检测核酸和蛋白质新途径的可能性从而形成新兴的分子形态学一些新的途径必须建立标准化的原则和提高其重复性目前我国病理科大多数医院病理科尚未在IHCAR上标准化国外已广泛进行进行AR的标准化及IHC标准化例如在建立新的修复液方面针对不同的抗体预定义加热条件和液体浓度PH值化学成分从而推动AR的标准化现AR技术已广泛应用于免疫组化(IHC)各领域的研究例如在诊断病理学和IHC的标准化方面对原来仅表达在冰冻切片上的抗原利用AR后绝大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上对IHC回顾性研究和临床病理IHC鉴别诊断肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估具有积极的意义
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