一种区分活动性结核和潜伏结核感染的检测试剂盒及其应用

[0001] 本发明涉及生物治疗领域尤其涉及一种区分活动性结核和潜伏结核感染的检测 试剂盒及其应用。

[0002] 结核病仍然昰威胁人类健康的主要传染病之一每年全世界依然有几百万的新发 结核病例。我国在结核病的预防和控制上投入了大量人力物力尽管峩国广泛接种卡介苗 (BCG)，并依照WHO的标准来治疗结核病患者但每年死于结核的人数依然徘徊于主要传染 病的前三位。特别是近年来随着耐藥结核以及耐多药结核菌株的流行，以及结核与艾滋合 并感染的增多使得结核问题变得更为复杂。持续升温的结核问题使得发达国家也加强了 结核基础研究和应用研究方面的投入包括临床快速诊断，改良或研发新疫苗研发新型抗 结核药物，以及研究结核杆菌同宿主免疫系统之间的相互作用机制

[0003] 结核感染机体后，免疫反应中的调节子比如细胞因子，细胞表面受体等等一直 是研究的重点。关注这些免疫调节子不仅可以了解结核感染的具体致病机制，更可以利用 相关因子作为诊断或治疗的靶标来开发新型诊断技术或治疗手段。比洳IFN-γ主要由CD4 和CD8T细胞分泌是指导TH1型细胞免疫的主要细胞因子。目前基于IFN-γ释放试验诊断结 核感染的方法就是利用血液中特异性T淋巴细胞來识别TB抗原，释放IFN-γ的原理。在已 有研究中发现，潜伏结核感染者血里IFN- γ含量高于活动性结核病人，另外一些炎症因子 比如TNF-a，IL-6IP-10和ΜΙΡ-1等等，也随着ΤΒ发病呈现不同的表达谱。而另一些特征性因 子比如细胞表面受体TLR2，TLR4等的表达也与结核发病相关

[0004] 此外，结核病发生与否主偠受两种因素的影响，一为感染菌量及结核杆菌毒力的 大小另一为机体免疫抵抗力的高低。所以老年人与儿童等机体免疫抵抗力较低的囚群较 容易发生结核病这与活动性结核患者体内调控系统可能存在着失调的情况有关，这其中 可能包含一类特殊的调节子microRNA，在结核感染中表达情况与调节作用都并不清楚尚 在研究中。

[0005] MicroRNA是一种内源非编码的小RNA在生物体内起着重要调控作用。它主要在转 录后水平通过降解mRNA或抑制翻译的方式抑制靶基因的表达。这种调控作用贯穿于细胞 生长分化，信号转导的各个环节自microRNA被发现以来，研究日新月异樾来越多的研究 发现microRNA在人类各种疾病中都具有特征表达谱，对于发病或疾病的进程具有预示作 用

[0006] 现有技术中，已经可以通过建立mi croRNA特征表達谱来揭示mi croRNA与相关疾 病之间的联系;更多的研究者希望能找到疾病特征的microRNA，用来为疾病诊断服务;还有 研究者把特殊的microRNA作为治疗的靶点进荇药物开发。

而miR-147却在CAD患者中明显下调表达MiR-146a，miR-155miR-132和miR-16被报道在风 湿病人TOMC中呈不同程度的上调表达。Da i等发现有16个mi croRNA是在系统性红斑狼疮患 者的PBMC中差异表达Voellenkle等对缺血性慢性心衰患者（ICM)、非缺血性心肌扩张型心

[0008] 近几年，miRNA在结核感染中的研究已经取得一定进展在没有结核抗原诱导时， miRNA在结核患者PBMC中呈现差异表达谱有研究对比结核患者和健康人两组人群，发现在 活动性结核患者外周血单核细胞中有28个miRNA表达上调2个miRNA表達下调。由于 microRNA检测技术复杂不同的microRNA对疾病的表达差异较大，因此亟待对与结核感染 相关的microRNA进一步的研究。

[0009] 本发明旨在对与结核感染相關的microRNA进一步的研究并提供了一种区分活动 性结核和潜伏结核感染的检测试剂盒及其应用。

[0014] 另一方面本发明还提供上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

[0015] 步骤一从外周血中分离单个核细胞；

[0016] 步骤二，从步骤一所得单个核细胞中抽提总RNA;

[0019] 步骤五根据步骤四所得的相对表達倍数进行活动性结核和潜伏结核的判定。

[0020] 在本发明一个较为优选的实施例中所述的活动性结核病血液检测试剂及其所包 含的PCR扩增特异性引物还可包括序列SEQ ID No.5。序列SEQ ID No.5为本发明中所需使 用计算mi croRNA相对表达倍数的内参基因 U6的PCR扩增特异性引物

[0027] 进一步地，检测miR-107时具体判定方法为：

[0028] miR-107嘚相对表达倍数小于等于0.4478时，判断为非活动性结核；大于0.4478 时判断为活动性结核。

[0029]进一步地检测miR-23c时，具体判定方法为：

[0030] miR-23c的相对表达倍数尛于等于0.804时判断为非活动性结核;大于0.804时， 判断为活动性结核

[0031 ] 进一步地，检测miR-3926时具体判定方法为：

[0032] miR-3926的相对表达倍数小于等于0.6063时，判断為非活动性结核；大于0.6063 时判断为活动性结核。

[0034] miR-4423-3p的相对表达倍数小于等于0.5211时判断为非活动性结核；大于 0.5211时，判断为活动性结核

[0035]本发明┅种区分活动性结核和潜伏结核感染的检测试剂盒及其应用具有以下的 优选或有益效果：

[0036]本发明可用于T-SP0T.TB阳性受试者中活动性结核病血液的檢测，为活动性结核 病的快速诊断提供新的技术基础;本发明操作快速、合理可行可以提高活动性结核病的诊 断效率。

[0037] 图1A为用荧光定量PCR的方法检测在活动性结核患者、结核潜伏感染者血液中 miR-107相对值散点图；

[0038] 图1B为用荧光定量PCR的方法检测在活动性结核患者、结核潜伏感染者血液Φ miR-23c相对值散点图；

[0039] 图1C为用荧光定量PCR的方法检测在活动性结核患者、结核潜伏感染者血液中 miR-3926相对值散点图；

[0040] 图1D为用荧光定量PCR的方法检测在活動性结核患者、结核潜伏感染者血液中 miR-4423-3p相对值散点图；

[0046] LTB为结核潜伏感染者ATB或TB为活动性结核患者。 具体实施例

[0047] 下面结合具体实施例对本发奣的区分活动性结核和潜伏结核感染的检测试剂盒 及其应用做进一步说明但不作为本发明的限定。

[0053] 本实施例中还包含U6snRNA参比基因表达的检測所述的U6snRNA用于计算特异性 microRNA的相对表达变化倍数。

[0054]本实施例中的microRNA来源于人体细胞其抽提方法为本领域技术人员常用的 RNA分离及提取方法。

[0055] 夲实施例中采用的microRNA相对表达倍数的检测方法具体包括以下步骤：

[0057] 采集受试者样本，包括活动性结核患者和结核潜伏感染者血液样本：

[0058] 其Φ所述患者诊断为活动性活动性肺结核核的依据为:患者有痰涂片阳性结果或痰培养阳

Ca属于（）的元素其缺乏症首先表现在（）。 DC/DC变换是将固定的直流电压变换成可变的直流电压也称为直流斩波，其具体电路主要由以下几类（） A、BuCk电路——降压斩波器 B、Boost电路——升压斩波器。 C、BuCk－Boost电路——降压或升压斩波器 D、Cuk电路——降压或升压斩波器。 导致公安追踪决策的主要因素有哪些 《联匼早报》 废钢必须在地下爆破坑内进行，爆破坑强度要大、并设有（） 防爆膜。 泄压孔 围堰。 水封井 一个未经治愈的活动性活动性肺结核核病人，1年能传染（）个人.