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实验4 质粒.jpg (70.22 KB, 下载次数: 56)
质粒DNA电泳图
19:05 上传
上图是大肠杆菌提取纯化后的DNA电泳图，除了上下量排第一孔是MARKER，其他都是不同组的实验结果（样品，操作都相同），为什么没有出现别人成功的实验图中六条带的情况：①蛋白质、②染色体DNA、③开环质粒DNA、④线性质粒DNA、⑤超螺旋质粒DNA、⑥RNA，而是染色体的DNA很亮，质粒的DNA好模糊，而且没有不同形态的DNA，是不是提取纯化没成功，原因是什么，希望能有人解答下。PS:
电泳的maker分子量从小到大依次为：250 500 750 00 00 00
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你的质粒多大啊？
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lucly 发表于
你的质粒多大啊？
不知道&&只知道老师给的应该是大肠杆菌 不知道提取出来的是什么，一般puc19的大小是2690bp
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玄滉 发表于
不知道&&只知道老师给的应该是大肠杆菌 不知道提取出来的是什么，一般puc19的大小是2690bp
你这个跑的比marker还要大 ~& &连质粒大小都不知道 你跑它做什么用？
而且直粒大小得线性化后才能够与Marker比大小啊
还有质粒提得好应该是没有基因组DNA污染，并且绝大多数是 cccDNA构型， 而不是你所述的 N多种，那些带都出现的人 提的质粒是没办法用的~ 是技术严重不过关的人~ 一般会有两种构型~ 大部分跑得快的cccDNA也有少量的ocDNA~
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lucly 发表于
你这个跑的比marker还要大 ~& &连质粒大小都不知道 你跑它做什么用？
而且直粒大小得线性化后才能够与Ma ...
其实不需要知道质粒的大小啦，只想知道提取的质粒的浓度和纯度，有看到别人跑出来是六条带的，就是cccDNA,ocDNA,线性DNA都有的，染色体DNA是比MARKER还大是没错，我总觉得是老师给的marker不对或者琼脂糖的浓度太大（此次用的是1%）。不懂的是为什么是拖带那么长而没有条带出来
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你这RNA好多，不是试剂盒提的吧
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仗剑走天涯 发表于
你这RNA好多，不是试剂盒提的吧
应该是RNA酶没反应完全
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是不是溶液一没加RNA酶啊？？？
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你这RNA好多，不是试剂盒提的吧
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质粒如果抽得好就是应该只有一条带的,酶切后才可能有3条带,你说的那么多的带肯定是提取的不是很好的情况下吧.
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逛了这许久，何不进去瞧瞧？测序竟说没抽到质粒，大家帮我看看这张电泳图，我跑出来的难道不是质粒和酶切片断(质粒,酶切,测序,电泳图) - DNA技术 - 生物秀
标题: 测序竟说没抽到质粒，大家帮我看看这张电泳图，我跑出来的难道不是质粒和酶切片断(质粒,酶切,测序,电泳图)
摘要: [测序竟说没抽到质粒，大家帮我看看这张电泳图，我跑出来的难道不是质粒和酶切片断(质粒,酶切,测序,电泳图)] 相关疾病：白癜风帖子修改规范后归还1分！上个星期做TA克隆，我挑了4个白斑，1个蓝斑，抽提质粒后酶切跑电泳，发现酶切后有目的条带，但是奇怪的很，蓝斑也有目的片断，当时我认为这个蓝斑是个假阴性，所以我将一个白斑菌液送到生工测序。但是生工说他们细菌内没有抽到质粒，下面是我的质粒和酶切片断的电泳图，请大家帮我看看。难道我跑出来的不是质粒吗？从左至右，左边一道marker1，二、四道是两个白斑的未酶切的质 关键词:[质粒 酶切 测序 电泳图 白斑 酶切图 质粒电泳图]……
帖子修改规范后归还1分！上个星期做TA克隆，我挑了4个白斑，1个蓝斑，抽提质粒后酶切跑电泳，发现酶切后有目的条带，但是奇怪的很，蓝斑也有目的片断，当时我认为这个蓝斑是个假阴性，所以我将一个白斑菌液送到生工测序。但是生工说他们细菌内没有抽到质粒，下面是我的质粒和酶切片断的电泳图，请大家帮我看看。难道我跑出来的不是质粒吗？从左至右，左边一道marker1，二、四道是两个白斑的未酶切的质粒电泳图，第三道和第五道是质粒酶切图，第六道是我送检细菌的质粒电泳图，第七道质粒酶切图，第八道DL-2000 Marker图。
回复生工的测序技术令人担忧，换换地方试试！回复最近我再生工测序也遇到了匪夷所思的结果，我开始以为是自己的东西有问题，后来问了问周围的实验室的同学，发现大家一致对生工最近的技术微词，同样的东西送到了宝去测序，一点问题也没有。建议换个地方试试回复Hi,jianlanjiang 你提的质粒质量很好，用的是试剂盒吗？你的目的片段的Size是?回复我用的是试剂盒，v-gene的，4元/次，我的目的片断201bp，加上质粒上的18bp，酶切片断应是219bp，我用marker算了一下，正好。你们说蓝斑也有酶切片断除了假阴性还有什么可能，我觉得实在不是基因租污染，而且也不会是EcoRI的星活性，因为我的酶量用的并不多，5u，37度3小时回复斑竹，我的帖子已经修改规范了，难道图不能直接帖出来吗？我是第一次将图帖出来，有什么不对，请指正！拜托，把那宝贵的一分还给我吧回复从你的酶切图来看，确实有问题。你第二、四道为未酶切的质粒而第三、五道未酶切图，而你说你的酶切片断只有219bp。请你注意第二、四道和第三、五道大片段之间相差很大，而绝对不可能只差219bp。我估计至少差2kb。另外，不知道你的质粒是什么，从你送测序的质粒电泳图来看，你的质粒大该在2kb左右，应该不到3kb。但是从二、四道看，你的质粒可能在5～6kb，或者更大。因此你挑的克隆肯定有问题。而且，不知道你酶切的时候加了多少的质粒，因为从第三道来看，你的质粒没有完全被酶切。星号活性跟酶的总量没有关系，二十跟你酶切体系的甘油浓度和离子浓度有关，所以酶切时可以加大酶切体系，保证酶的体积<总体积的10％。另外，蓝斑不一定就不是阳性。我以前碰到过这样的问题，特别是在克隆片断是小片断的时候。如果你克隆进去的片断比较小，而且刚好没有改变lacZ的读码筐，那么由于目的基因比较小，阴性克隆可能会出现蓝色。回复
我一直有个困惑，不知道为什么我每次抽的质粒都不以超螺旋为主，我的质粒是promego的PGEM-T easy 载体，3018bp，二、四、六道是同一次转化所挑的不同白斑抽的质粒，为什么二、四道的质粒是这样，而第六道的质粒又是这样，我实在匪夷所思，这难道是质粒不同状态所决定的？（我觉得又不象基因租DNA的污染）所以我没有送第二、四道抽的质粒，而送了第六道的质粒去测序，我右边的marker是DL-2000，最上面一道是2000bp，所以我觉得我酶切后的质粒3000左右，差不多，酶切片断是下面一道很淡的。谢谢你告诉我第三道是酶切不全，我的质粒我测出来的量是0.4ug/ul，我觉得不准，偏大，我就加了5ul的质粒，20ul的酶切体系，5u的Eco RI，37度3小时。但是奇怪的是，我将原来抽第六道质粒的细菌（放在4度冰箱10天左右）重新摇菌后，细菌长得很好，但挑质粒，竟然也没有抽到质粒（和生工所说的一样），难道在摇菌的过程中质粒真的会丢失，我在培养时加了AMP的，没有质粒细菌怎么长得起来的?实在令我困惑不已，难道是我的AMP失效了，我放在4度冰箱2个星期左右。目前一片困惑中，准备重配AMPA再摇菌试试，不过我重挑了一个蓝斑又有酶切片断，搞不清，不过我的板子上，蓝斑有二三十个，但白斑只有四五个，会不会真的有很多是假阴性，困惑中，原来觉得蓝白斑出来后就OK了，哪知道还有这么多麻烦，郁闷！回复
从你的第2、4道来看你的质粒提的质量是不错的，小提达到这种水平应该是非常的好了。至于酶切，你可以切4个小时，特别是质粒酶切，我一般切4个小时以上。AMP的LB板和培养基放在4度两个星期是没有问题的。提质粒的质量跟细菌的状态很有关系，处于对数生长期也就说活化度好的细菌超螺旋的比率高。综合你所说的情况来看可能是质粒的污染。建议：1. 重新作一次连接、转化，尽量用新的培养基、抢头和板子，以免交叉污染。2. 作一次二次筛选，也就是说从第一个板子上挑一些白斑道第二块AMP + IPTG&X-gal的板子上，看看培养后是否仍然呈现白色。3. 先用PCR进行菌落PCR，也就是说以菌液为模板进行PCR鉴定，这样可以省去提质粒的一部。4.对PCR阳性的菌落，进行提质粒酶切鉴定。这样一般是没有问题了的。
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电话：021-胶回收后跑电泳没有了条带是怎么回事呀?如何解决呢(胶回收,跑电泳,条带) - DNA技术 - 生物秀
标题: 胶回收后跑电泳没有了条带是怎么回事呀?如何解决呢(胶回收,跑电泳,条带)
摘要: [胶回收后跑电泳没有了条带是怎么回事呀?如何解决呢(胶回收,跑电泳,条带)] PCR产物做胶回收后,跑电泳却没有了条带,该如何解决呀 关键词:[胶回收 跑电泳 条带]……
PCR产物做胶回收后,跑电泳却没有了条带,该如何解决呀
回复大概回收的浓度太低把回复用核酸浓缩仪浓缩一下回复用核酸浓缩仪浓缩一下核酸浓缩仪是什么东西，我不知道实验室里有没有呢，可不可以把胶回收的东西再回收一遍呀回复既然都没收回来，再回收效率就更低了回复我用的是胶回收试剂盒回复我也是用的胶回收试剂盒回收的，上海生工的，就再没有办法了吗回复我也不是太清楚,是不是切胶的时候有问题(比如时间太长变异了),或胶回收时那步出错了。仅供参考。回复核酸浓缩仪就是把回收的ＤＮＡ中的多余的水分蒸发掉，以提高浓度。回复我有一个办法，但不知可行不可行。你可以把回收的样品放在３７度培养箱中，放置一段时间，让它蒸发掉多余的水份。嘿嘿，我也没这样做过。你可以参考。嘿嘿回复我感觉回收的产率都比较低，你多上点量就好了回复同意楼上的你可以册一下浓度回复同意楼上的你可以册一下浓度是用那个260/280的吗回复可以用氮气吹干机吹一下回复可以用醋酸钠沉淀一下乙醇洗涤浓缩，一般没有这个必要，PCR浓度都很高的，如果你需要浓缩可以试试，回复不知你的回收片段是多大？很多胶回收试剂盒回收片段的大小是有范围的，片段过长或过短回收效率就会变低，有些试剂盒建议当片段小于500bp时，应在适当的步骤加入适量的异丙醇就可以解决小片段回收率低的问题。回复PCR产物做胶回收后,跑电泳却没有了条带,该如何解决呀你的片段多长呀，用什么试剂盒回收的，详细描述问题，大家也可以帮你分析一下。一点都没有的话：如果你胶上观察带很亮，说明回收的步骤除了严重的错误。不然即使效率不高也会回收到一些。如果带弱，片段又小，建议多做几孔PCR，3个空切到一个管里回收如果量少，而加ELUTION BUFFER 太多，而点样又少，很可能看不到带。原因实在太多
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电话：021-关注今日：0 | 主题：276608
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【求助】质粒DNA电泳结果图，不知道质粒DNA是否提取出来了，用试剂盒提取的
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这是我前天刚跑的质粒DNA图，60V电压电泳2小时，大家帮我看看我的质粒都提取出来了吗。最后，为什么质粒不是条带呢，是点样的量太大了吗？
不知道邀请谁？试试他们
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我取得是15个样，其中5个样来自同一菌体，但是在电泳图中，为什么同样的菌体，提取得到的质粒DNA大小不一样呢，是不是**作的问题
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本公司提供专业的质粒提取服务MDlbiotech高端自主品牌
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先说你这个胶，多久没有换电泳液了，表面这么多杂质，荧光到处都是，还有质粒提的不怎么样，蛋白质有点多，还有一个问题，你这个质粒是怎么转进去的，连接产物么？有没有跑一个空载体，有木有阴性对照，好多东西你没有交代清楚
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还有一个，1?tae缓冲液跑电泳，能用60v跑两个小时，你们实验室是这么跑的？
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好细心的战友，太谢谢你的回复了。电泳缓冲液是新配的，图片拿手机照的，不知道怎么了，就这个德行，不过其他胶跑出来都是很干净的。质粒是连接后热激转进去的，不过你说的阴性对照，我们还真没有想到这一点。太谢谢你了，祝你每天开心哦。领导让我们在60v下跑2小时的。
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参照你的MARK，跑成这样不奇怪，TAE有问题，DNA量也稍多。60V跑2H太浪费时间了。而且质粒DNA是否提取出来这个命题本身有点怪，如果是为了辨别你提取的东西是不是你需要的质粒，一般酶切或者送测更保险，跑条带出条带根本不能说明什么，只表示这个样品你可以继续做其他鉴定，不能完全表明是否是你需要的质粒，尤其是对连接产物转化而言。
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又涨知识了，知识真的就是这样在探讨与摸索中积累的，谢谢您。
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“领导让我们在60v下跑2小时的&领导存在的意义就是用来质疑的，呵呵
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你们这个boss真心不靠谱，跑俩小时，胶都跑热了。
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关于丁香园酶切质粒的常规问题，很简单，做过的都会(质粒,酶切,电泳,跑电泳) - DNA技术 - 生物秀
标题: 酶切质粒的常规问题，很简单，做过的都会(质粒,酶切,电泳,跑电泳)
摘要: [酶切质粒的常规问题，很简单，做过的都会(质粒,酶切,电泳,跑电泳)] 我用试剂盒提取出了质粒，跑电泳加5ul结果挺好的，下面想做酶切，两个酶切位点离得很近，是不是要分别切？能一起切吗？说明书上说酶切的时间1-16小时，一般多长时间能切出来？
我买的酶的说明书上说20ul体系加1ul酶1ul DNA(1ug ul) 这么少的量切完了电泳能看出来吗？是不是应该多加些DNA,然后按比例多加酶，提高总反应体系啊？多加的话应该加多少呢？
还有，质粒 关键词:[质粒 酶切 电泳 跑电泳 总反应 酶切位点 试剂盒]……
我用试剂盒提取出了质粒，跑电泳加5ul结果挺好的，下面想做酶切，两个酶切位点离得很近，是不是要分别切？能一起切吗？说明书上说酶切的时间1-16小时，一般多长时间能切出来？
我买的酶的说明书上说20ul体系加1ul酶1ul DNA(1ug/ul).这么少的量切完了电泳能看出来吗？是不是应该多加些DNA,然后按比例多加酶，提高总反应体系啊？多加的话应该加多少呢？
还有，质粒切开后和没切时电泳有什么区别？质粒应该保存在4度还是零下二十度？
我没做过酶切，请高手赐教！
回复你在选择酶切位点的时候就应该选择双酶切的位置，你可以查你所用酶公司的说明，最常用的takara书上有写的，如果不是你可以先双酶切试试，不行再换单酶切。一般2-3小时足够了。电泳是可以的，不需要很多DNA，1ug足够了。切开后就不会有没切时的三种状态了，只有载体和目标片段两条带，都是直链。通常长期保存在-20度回复1、两个酶的反应温度是否一样，如果一样，可以同时酶切。2、两个酶的酶切位点很近：切下来的小片段长度是多少？假如有100bp以上，2%琼脂糖凝胶电泳跑的时间长点，可以分辨出来。但同时要加Marker和没有酶切的质粒做双重对照。Marker和切下来的小片段比较；没有酶切的质粒和酶切的质粒对比，切开的质粒（线性化DNA）要比没有酶切的质粒（环状DNA）跑的慢。3、一般情况下，1u的酶，在最适条件和温度下，1h可以切开1ug的DNA。4、一般酶切时间3h足够，但有的质粒不好切，也可以酶切过夜。每隔几小时根据电泳分离情况而定。5、根据你的情况，两个酶切位点离得很近，估计切下来的小片段没有多大，所以酶切体系要加大，酶要相应的加大，质粒的量要多加一些（可加3~5ug）。因为质粒的量太少的话，切下来的小片段DNA，电泳鉴定有可能看不见。6、质粒最好保存在-20度。回复多谢两位，不过我突然发现提取的质粒有点不对头，电泳不是两条带或三条带，而是只有一条带，等我照张相发上来帮我分析一下。做实验真难啊，每取得一丁点的进展都要费很多周折。。。。。。。回复电泳的时候看你的loading buffer是什么，如果放得不对头的话就是一条带回复你切的目的是想要干什么？克隆进新的片段？如果是要克隆的话就不用管这些，跑个胶回收提纯后就直接连，连了之后再检测就一切都简单了。回复loading buffer有很多种选择吗？我一般就用买酶时附带的呀会有影响吗回复建议先学习分子克隆3。回复一般酶都需要三个保护碱基才能保证切开，如果两个酶切位点离得很近，还想做双酶切，就保证两个酶切位点间不要少于6个bp；其次要看这两种酶是否有共用的buffer，在此共用buffer中，两种酶的活性怎样？是否有星号活性。如果只能选择两个单酶切，要先用低盐buffer的酶先切。酶切时间与酶的性质有关，有的酶如EcoR I 5分钟几乎可达到完全酶切，而有些酶20小时还不能保证酶切完全，你可以上网查查相关信息，我一般做酶切是切4个小时，如果构建质粒切载体一般是过夜切。Loading buffer可以用买酶带的，也可以自己按照TaKaRa说明书自己配（0.01g 溴酚兰，1%的SDS，50%甘油，配10ml），我们实验室喜欢用自己配的，随酶附带的loading buffer 太粘稠，不太好用。回复我是指你跑胶时用的buffer。如果只用水一般就只会跑出一条带来回复这是我电泳的图片，左边是MARKER2000，加了2ul。旁边是质粒，也加了2ul。质粒我稀释1000倍后测OD260=0.038，计算得1.9 ug/ul，浓度应该不低了吧，可电泳条带不是很亮。我酶切后是想构建载体，按照说明书酶切，20 ul反应体系里只加1 ul质粒，相当于被稀释了20倍，酶切后再跑电泳就什么都看不见了。是因为我的质粒浓度太低吗？loading buffer就是用的买试剂带的。分子克隆实验指南我也看了，但没有人指导还是不行啊。多谢各位热心人！！！！！回复有人能帮我分析一下吗？我看别人的质粒电泳条带都很亮，带很宽，我的怎么一点都不亮啊，这是怎么回事啊？谢谢了回复BamHI,XhoI用什么Loading buffer啊？
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