复旦大学 博士学位论文 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 姓名：崔杰峰 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：刘银坤 博士论史 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质纰学研究 中文摘要 转移复发是影响HCC术后生存的最大障碍。转移复发的发生与癌细胞的生物 学行为(黏附、运动、增殖)、细胞外基质、机体免疫与肿瘤血管生成等许多因 素有关。比较蛋白质组学作为多基因、多因素复杂病理机制研究的有效手段，可 高通量，大规模地筛检在疾病发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子，运用该 研究策略，可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物，新关键分子，极大地 丰富诊断标志物的选择组合及复杂致病机理的全面阐明。本研究通过对转移潜能 全蛋白质组表达谱差异分析，筛出一些有潜在应用价值的差异蛋白，同时采用反 义核酸技术和与侵袭生物学特性有关的鉴定方法对差异蛋白annexinl和SIOOA4 进行了功能分析和验证。 第一部分 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学分析 本部分工作的主要目的：(1)优化双向凝胶电泳(2-DE)相关技术，建立相 对稳定、适合本实验室的标准技术平台。(2)运用优化后的2一DE结合液相色谱 一电喷雾一串联质谱(LC—ESI—MS／MS)技术，对转移潜能不同人肝癌细胞系中全蛋 白质差异表达谱进行分析，筛查在转移过程中发挥重要作用的差异蛋白质分子。 2一DE技术是比较蛋白质组学研究的重要支撑技术之一，在比较蛋白质组学 分析中，它所起的作用主要是对复杂蛋白质样品进行分离并显示差异蛋白的数量 和位置。保持2一DE技术的稳定标准是比较蛋白质组学成功的关键。我们针对影 响2-DE蛋白质图谱质量较大的环节，如上样方式(杯上样、溶涨上样)、银染方 法(双胺银染法和非双胺化学显色银染法，固定时间)、细胞裂解液组成(离液 剂浓度)分别进行了优化比较分析。结果发现同一细胞系MHCC97L采用杯上样、 双胺银染法获得的平均蛋白斑点数为1092+40个(n=3)，明显多于溶涨上样、非 双胺化学显色银染获得的平均蛋白斑点数784+14个(n=3)。非双胺化学显色银 染的图谱背景明显深于双胺银染结果，杯上样的碱性区、酸性区蛋白质分离效果 明显优于溶涨上样。由于采用双胺银染法获得的蛋白斑点数远多于非双胺化学显 色银染，前者胶中表达弱的点在后者胶中有匹配，说明双胺银染法敏感性优于非 双胺化学显色银染法。与溶涨上样相比，杯上样可显著提高碱性区、酸性区蛋白 质分离效果。 同一L02细胞系经含不同浓度离液剂的细胞裂解液处理，平均获得的蛋白斑 博士论文 人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学研究 点的获得影响较大。 不同固定时间(双胺银染法)影响蛋白质条带的显示，固定方式A(40％乙醇 10％乙酸固定1h，后5％乙醇5％乙酸固定过夜)条带显示最多；固定方式B(40％ 乙醇10％乙酸固定lh。)条带显示次之；固定方式C(5％乙醇5％乙酸固定过夜) 条带显示最少。固定方式A得到的蛋白质银染图谱理想，建议用于蛋白成分复杂 图谱的显示。 3种转移潜能不同人肝癌细胞系的蛋白质样品，在相同条件下分别进行3次 点数最多的一块MHCC97L图谱作为参考胶，Hep3B与其匹配的平均匹配点数为 与其匹配的平均匹配点数为589+51个(n=3)，平均匹配率分别为65．7％，72．1％， 以上的上调点有47个，相差10倍以上的下调点有52个。质谱鉴定出SIOOA4， SIOOA6，SIOOAll，annexin1等26种胶内差异蛋白质。部分差异蛋白如annexinl 和$100A4等在转移与不转移人肝癌细胞系中为最新发现。由于转移性肝癌细胞 系全蛋白质表达谱与不转移人肝癌细胞系比差异明显，推测肝癌侵袭转移性与细 胞内多种差异蛋白的改变相关。 第二部分转移潜能不同人肝癌细胞系差异蛋白的

博士论文 正文 点相关的5’侧翼序列的lkb区域上(避免高CpG区域)随机选择7个靶点序列并 145细胞内， 序列同源性。(2)化学合成以上候选dsRNA并分别转染到PC．3和DU 每种细胞系中分别设置对照组(包括空转染MOCK组和对照dsRNA转染)和候 表达，根据基因的表达水平筛选出相对高效激活功能的dsRNAs分子(我们将相对 倍以上)。使用Western blotting方法进一步验证功能性激活dsRNA的作用效果。 果。 【结论】E．cadhein基因启动子区域同时存在着可以被dsRNA上调或下调的靶点 序列，这些靶点序列具有序列特异性；基因启动子区域存在着可以被dsRNA调控 的靶点可能是一个普遍现象，可能可以通过设计、合成、转染靶定位于基因启动 子区域的dsRNA来调节基因的表达。 分子机制探讨 【目的】探讨功能性dsRNA转录水平调控E—cadherin基因表达的相关分子作用机 制。 【方法】(1)使用激光共聚焦显微镜观察荧光Cy3标记的dsRNA在细胞内的定位 反义链RNA转录本；(3)根据功能性dsRNA的序列设计出正义链和反义链碱基 small RNA，asRNA)，检测非对称小RNA 数目不相等的非对称小RNA(asymmetric 调节E．cadhefin基因表达的效果，从而推断出功能性dsRNA中哪一条链是真正发 挥基因调节功能的真正引导链以及相应靶标链；(4)分别构建Ago一1和Ago一2基 因稳定沉默的细胞株，在以上两种细胞模型中分别转染功能性dsRNA并检测转染 dsRNA调控基因表达过程中发挥作用。 博士论文 正文 区域存在着内源性非编码RNA正义链和反义链转录本，这些非编码RNA转录本 E．cadherin启动子区域的DNA正义链或者启动子区域的非编码RNA正义链转录本 很可能为小激活RNA的靶标序列；(4)小干扰RNA(dsE．604)的正义链为引导链， 而与引导链相互配对的E．cadherin启动子区域的DNA反义链或者启动子区域的非 编码RNA反义链转录本很可能为小干扰RNA的靶标序列；(5)Ago．2在功能性 dsRNA介导的基因转录水平调控中发挥决定性作用，激光共聚焦显微镜结果显示 Ago．2主要表达定位在细胞浆中提示了Ago．2可能在dsRNA进入细胞浆中加工递 呈发挥作用； 而主要表达定位在细胞核中的Ago．1在小干扰RNA介导的基因转 录水平沉默中起着决定性作用。 动子区域的非编码RNA转录本很可能是介导功能性dsRNA转录水平调控 干扰RNA(dsE．604)的引导链和靶标序列完全相反，导致其功能活性也完全相反； (4)Ago．2在功能性dsRNA介导的基因转录水平调控中发挥决定性作用，而主要 表达定位在细胞核中的Ago．1在小干扰RNA介导的基因转录水平沉默中起着决定 性作用。 第四部分非对称小激活RNA上调E．cadherin对前列腺癌细胞的 治疗作用及相关分子机制探讨 一、aaE一217上调E-cadherin对前列腺癌细胞的治疗作用 列腺癌细胞PC．3的增殖、凋亡、克隆形成、转移和侵袭等生物学行为的影响，从 而初步评价非对称小激活RNA对前列腺癌细胞的治疗作用。 【方法】(1)首先根据本课题第三部分结论将以往文献报道的靶定位于E．cadherin 基数不相等的非对称小IⅢA——a止．217；(2)然后将aaE一217转染入PC．3细胞 4 博士论文 正文 细胞增殖生长情况；使用ANNEXINV-FITC细胞凋亡检测试剂盒评估转染后前列 癌细胞迁移和侵袭能力的改变。 达的同时，可以明显抑制前列腺癌细胞PC．3生长；流式细胞仪检测显示aaE-217 痕实验显示aaE．217处理组与同时间点