刘学平（湖北省天门夏钢医院检验科&& 431700）
【摘要】目的& 通过观察我院收治的对宫颈病变患者的临床诊断资料，探讨分析采用实时荧光PCR检测高危型HPV的价值。方法 对我院收治的158例宫颈病变患者患者，进行实时荧光PCR检测，分析检测结果，并与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)的检测结果对比。结果 HPV在宫颈癌患者阳性表达率达90%以上,与HC-Ⅱ相比，差异无统计学意义；PCR检测宫颈病变与HC-Ⅱ的检测结果的阳性率分别为：74.7%与70.9%，差异无统计学意义（P&0.05）；但两种方法检测HSIL的HPV阳性率明显高于宫颈炎症、湿疣（P&0.01），除LSIL外，其他病变中的PCR检出率均略高于HC-Ⅱ。结论 采用实时荧光PCR检测高危型HPV，可用于确诊患者是否患有宫颈癌，提示高危型HPV感染与宫颈病变、宫颈癌发生有一定的相关性，值得进一步推广与应用分析。
【关键词】高危型HPV& 实时荧光PCR& 检测
【中图分类号】R446&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文献标识码】A&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文章编号】（5-02
The Analysis Of The Result In The Real-Time Fluorescent PCR Detection Of High-Risk Type HPV
【Abstract】 Objective after observed the Clinical diagnosis&s information of the patients with the cervical lesions in our hospital,To analyse the value of the real-time fluorescent PCR detection of high-risk type HPV . Method& Used the Real-time fluorescent PCR in the 158 cases of patients with cervical lesions ,analysed the detection,and contrasted with the method of generation of hybrid capture 2(HC -Ⅱ) test results .Result The HPV in cervical cancer patients with positive expression rate was more than 90%,Compared with the HC-Ⅱ, there was no statistically si The PCR detection of cervical lesions with HC-Ⅱ of positive test results, was 74.7% and 70.9%,respectively,there was no statistically significant difference(P&0.05),But the two methods of detecting HPV positive rate of HSIL was obviously higher than that of cervical inflammation , condyloma(P&0.01), except the LSIL, other lesions of PCR detection rates were slightly higher than the HC-Ⅱ.Conclusion The real-time fluorescence PCR of high-risk type HPV, can be used in the diagnosis of patients that can be suffered from cervical cancer,it prompt that high-risk type HPV infection is related to the cervical disease,and cervical cancer, it is worthy of further popularization and application analysis.
【Keywords】high risk type HPV&&& real-time fluorescence PCR&& detection
&&&&&&& 宫颈癌是比较常见的妇女恶性肿瘤之一，近年来该病在我国的发病率有增高趋势，发病年龄日趋年轻化[1]。而人乳头瘤病毒（HPV）是一种球形DNA病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒[2]，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖,目前高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染被认为是宫颈癌的确切致病病毒[3]。本文亦根据此问题，对我院收治的宫颈病变患者均进行实时荧光PCR检测，并与正常宫颈标本以及HC-Ⅱ检测结果进行对比，取得显著的研究结果，具体过程汇报如下。
&&&&&&& 1& 资料和方法
&&&&&&& 1.1 临床资料
&&&&&&& 我院2010年4月～2012年12月年共收治宫颈病变患者158例，患者年龄23-69岁，平均47.6&2.3岁。其中，宫颈癌患者10例，宫颈炎患者19例，湿疣患者62例，ASCUS24例，LSIL20例，HSIL23例。所有病例手术切除前均未行放疗及化疗，样本检查前24h内禁止性生活，3天内无阴道内冲洗、上药，检查前不进行醋酸或碘液涂抹。同时选取30例正常者的宫颈组织切片作为对照，年龄范围在23-70岁，平均48.1&1.6岁。
&&&&&&& 1.2 方法
&&&&&&& 158例宫颈病变患者患者，均分别进行实时荧光PCR检测与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)检测，具体检测方法如下。
&&&&&&& 1.2.1 检测材料
&&&&&&& 采用美国爱迪旺斯医疗科技有限责任公司生产的赛泰-细胞/组织人乳头瘤病毒检测试剂盒；常规试剂（PBS磷酸盐缓冲液、复染试剂等）、HC-Ⅱ试剂检测以及荧光PCR检测试剂。
&&&&&&& 1.2.2 检测方法
&&&&&&& （1）HC-Ⅱ检测：取样使用一次性宫颈脱落细胞采集器，将其放入宫颈口处，单方向旋转4-5周以获得足量的上皮细胞样本，取出后放入样本管中充分搅拌，HC-Ⅱ试剂检测13种高危型HPV&DNA，即16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58、59与68。
&&&&&&& （2）荧光PCR检测：采用免疫组织化学检测样本管中子宫颈细胞核中浓度低于0.01pg(10－12g)的HPV壳蛋白的抗原，仅有一个被染色的细胞核呈红色即可做出阳性诊断，采用多亚型HPV和HPVl6／18荧光PCR检测试剂，分别检测lO种高危型HPV.DNA(16、18、31、33、35、45、52、53、56、58)和HPVl6、18两种高危亚型，具体实验步骤按试剂盒说明书操作。
&&&&&&& 1.3 统计方法
&&&&&&& 每张样本切片由2名医师双盲观测10个视野(&400),阳性表达率用1000个细胞阳性细胞的百分数表示[4]，采用双评分半定量法分别对染色强度和阳性细胞百分比进行统计评分。再用SSPS12.0统计软件处理数据,计数资料用&2检验及确切概率法(较小样本量)分析，P&0.05表示差异具有统计学意义。
&&&&&&& 2& 结果
&&&&&&& 2.1 PCR与HC-Ⅱ对宫颈癌患者HPV的检测结果对比
&&&&&&& 正常宫颈组织和宫颈癌鳞状细胞癌、腺癌和其他宫颈癌的HPV表达差异，其中，正常宫颈组织HPV阳性检测结果占比3.33%，宫颈鳞癌100.0%，宫颈腺癌100.0%，其他宫颈癌100.0%，宫颈癌患者HPV的检测结果均达到90%以上，而HC-Ⅱ检测法，对宫颈癌患者HPV的检测结果亦为100%，二者差异不显著。
&&&&&&& 2.2 两组检测方法测不同宫颈病变的阳性率对比情况
&&&&&&& PCR检测宫颈病变与HC-Ⅱ的检测结果的阳性率分别为：74.7%与70.9%，二者差异不显著（P&0.05），而两种方法检测HSIL的HPV阳性率明显高于宫颈炎症、湿疣（P&0.01），除LSIL外，其他病变中的PCR检出率均略高于HC-Ⅱ,具体情况见表1。
&&&&&&& 表1两组检测方法测不同宫颈病变的阳性率对比表
&&&&&&& 注：与同法检测宫颈炎、湿疣比较，*P&0.01
&&&&&&& 3& 讨论
&&&&&&& 宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，是鳞状上皮内瘤由低度向高度发展，最后恶化到浸润癌的复杂病理过程，癌基因的激活及抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础，其发生与转移与细胞增殖活性及某些基因突变有关。宫颈癌多发生在25-40岁，每年新增病例50余万，近年来该病有年轻化的趋势。按照癌细胞病理特点的分类，分为鳞状细胞癌[5]（80％-90％）、腺癌（10％-15％）和其他腺鳞癌。宫颈癌分型与癌病变的分子标志物有很大的联系，分析宫颈癌病理变化过程中分子标志物的临床实验参数将有助于更好地理解宫颈癌的病理变化过程[6]，确诊宫颈癌的分型，根据不同的宫颈癌分型临床采取适合的治疗方案，提高疗效，降低死亡率。
&&&&&&& 人乳头瘤病毒是一种双链闭环小DNA病毒，属于乳头瘤病毒科，具有种属特异性的嗜上皮生物特性。流行病学研究表明，HPV感染与宫颈癌的发生密切相关，现已知20余种与癌症相关的HPV型别，根据HPV与宫颈癌病理变化程度的关系，可将HPV分为低危型和高危型两种。有关研究资料表明，高危型人乳头瘤病毒持续感染是宫颈癌发生的必要条件和首要因素。本文研究显示90%以上宫颈癌患者受人乳头瘤病毒感染，故HPV检测数据可用于确诊是否患有宫颈癌。
&&&&&&& HPV在宫颈癌患者阳性表达率达90%以上，说明宫颈癌的HPV表达率较高，可以作为临床上诊断该疾病的方法之一；而PCR检测宫颈病变与HC-Ⅱ的检测结果的阳性率分别为：74.7%与70.9%，二者差异无统计学意义（P&0.05），对于不同宫颈病变症状，两种检测方法的符合率较高，这一点在沈云岳等[7]人的研究中，作出更具体的阐述，在其结果中提出二者检测结果符合率为85.0%，而本次研究中，两种方法检测HSIL的HPV阳性率明显高于宫颈炎症、湿疣（P&0.01），说明，高危型HPV感染与宫颈病变、宫颈癌发生有一定的相关性，而除LSIL外，其他病变中的PCR检出率均略高于HC-Ⅱ，但二者对比差异无统计学意义，可能由于样本含量较少，导致数据对比无统计学意义，需要进一步扩大样本容量分析，此外，在其研究中发现PCR检测HPVl6/18可作为临床上筛选宫颈癌症状的有效方法，这一点需要本文研究进一步取证进行分析。
&&&&&&& 综上所述，采用实时荧光PCR检测高危型HPV，可用于确诊患者是否患有宫颈癌，提示高危型HPV感染与宫颈病变、宫颈癌发生有一定的相关性，值得进一步推广与应用分析。
[1]张立冬,裴静,张慧敏等.不同型别人乳头瘤病毒感染不孕患者治疗方法的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志,):227-229.
[2]卢妙莲,王方金,王建兵等.双重实时荧光PCR检测在宫颈癌筛查中的应用[J].广东医学,):78-79.DOI:10.3969/j.issn...
[3]李泉,祖洪勇,杨清平等.实时荧光聚合酶链反应技术与第2代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒的比较[J].重庆医学,): .
[4]钟磊,祝建军,许晓燕等.杂交捕获法与荧光定量PCR法在高危型HPV检测的比较[J].中华检验医学杂志,):948-949.
[5]朱小霞,程浩,张行等.荧光定量PCR检测尖锐湿疣皮损Toll样受体的表达水平[J].中华微生物学和免疫学杂志,):560-563.
[6]谭黎明,谢良伊.基于TagMan探针实时定量PCR技术在高危型HPV感染检测中的应用[J].中华医院感染学杂志,):.
[7]沈云岳,刘华,王蕾等.实时荧光PCR和HC-Ⅱ检测高危型人乳头瘤病毒的临床价值[J].山东医药,):77-78.
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人乳头瘤病毒HPV-DNA检测――检测高危型HPV感染 防止宫颈癌发生
来源：　　
日期: 15:58
编辑:廖医生
　　[内容摘要]：人乳头瘤病毒(英文缩写为HPV)是导致宫颈癌的主要原因之一。因此，定期HPV&DNA检测，尤其是检测高危型HPV感染非常重要，可以预测发生宫颈癌的风险。目前，武汉仁爱医院采用的HC2&HPV&DNA检测技术，是国际上最先进的HPV&DNA检测技术。该技术可以精密的对人乳头瘤病毒进行检测，以确定其是否是高危型感染，使更多的患者有效地防止宫颈癌的发生。
　　什么是人乳头瘤病毒(HPV)及其对怀孕的影响?
　　人乳头瘤病毒(简称HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性。长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如宫颈癌、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤等。
　　(1)HPV的分类
　　在临床上，根据HPV致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为低危型和高危型两大类。
　　1、低危型HPV：一般来说通过自身的免疫系统就能自身消除。
　　2、高危型HPV：它可引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤，其种类达百十多种，临床上最危险的有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58型等。
　　(2)高危型HPV感染患者是否能够怀孕?
　　女性宫颈的HPV感染是比较常见的一种疾病，可以引起宫颈炎、尖锐湿疣、宫颈内皮瘤样变，甚至宫颈癌。其中持续的高危型HPV感染已经证实和宫颈癌的发生密切相关。所以高危型HPV感染还是值得高度重视的。
　　高危型HPV患者是否能够怀孕，这是许多人关注的问题，据相关报道，高危型HPV感染是可以怀孕的，但前提是在不引起其他病变的前提下，如尖锐湿疣，宫颈的恶性病变等。
　　所以，武汉仁爱医院专家提醒：首先对高危型HPV病毒的感染要早发现早给予彻底治疗，其次是治好宫颈病变，然后再准备怀孕。然而想要彻底治愈HPV病毒的感染，需要有先进的检测方法，只有精确的检测结果才使HPV感染的治疗和预后会更好。
　　常用的HPV检测方法有什么?
　　常用的HPV检测方法主要包含以下几个：
　　1、核酸印迹原位杂交：适用于HPV分型和HPV-DNA分子量鉴定，灵敏度高，但操作复杂，需新鲜组织标本，不便于临床推广。
　　2、斑点印迹 ：其敏感度和特异性均低于核酸印迹原位杂交法，经济实用，但实验过程中存在有放射性污染。
　　3、原位杂交：通过非放射性探针对石蜡组织进行检测，且能做定位检测，假阳性率低，但灵敏度不高。
　　4、杂交捕获法(即HC2&HPV-DNA检测) ：现武汉仁爱医院就是采用此领先方法，检测HPV的分型以及对宫颈造成的危害程度，弥补了细胞学检查的不足，从而为治疗HPV提供临床治疗依据，以达到早发现、早治疗，远离宫颈疾病，健康怀孕的目的。
　　多久进行一次HPV检测?
　　1、首次HPV 检测：如果已经30岁以上(特殊人群应提前)，且从未进行过HPV检测，则应在细胞学检查的同时行一次HPV检测。
　　2、如果在20-30岁之间，只有当细胞学检查结果为临界，即非典型细胞的改变(简称&ASC-US&)的情况下需要进行HPV检测。
　　3、HPV 复查：如果已经30岁以上，HPV检测的频率取决于上一次检查的结果。如果细胞学和HPV检测的结果都显示正常，可每3年进行一次复查。
　　什么是&HC2&HPV-DNA检测&技术?
　　HC2 -HPV-DNA是HPV第二代杂交捕获技术,此技术配有专用的标本采集保存器，常温下标本可保存2周，阴性预测值99.9% ，不受采样、阅片者之误差影响，可有效地降低CINⅢ和宫颈癌的漏诊率。
　　它主要是检查人类乳突病毒(HPV)的分型、HPV感染的程度，提早发现宫颈癌，并对宫颈癌的预后有预测作用的方法。目前，它是唯一经美国食品和药品监督管理局(FDA)、欧洲CE和中国食品药品监督管理局(SFDA)共同认证的领先检测技术，并且被众多国内外临床指引推荐。
　　&HC2&HPV-DNA检测&技术原理
　　1、原理：杂交捕获法(即HC2&HPV-DNA检测) 是利用分子杂交化学发光，使信号放大的原理，无需基因扩增，使复杂的核酸检测变得像免疫分析般简单。首先使DNA双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链，DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体，特异性抗体将RNA-DNA杂合体捕获，偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA-DNA杂合体的结合，碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂合体的含量，其检测低限为HPV-DNA 0.2～1.0ng/L。
　　2、检测探针:
　　A、采用8000多碱基对的全长RNA探针，特异性高，当病毒发生基因突变时，也不会影响检测结果，具有较高敏感性，且重复性好。
　　B、针对每一种特定的高危型HPV型别都有各自独立的RNA探针，不使用共同引物，避免了不同亚型间的竞争性抑制，准确率高。
　　&HC2&HPV-DNA检测&有什么优势?
　　1、唯一同时获得FDA、CE和SFDA认证的HPV DNA检测方法。
　　2、HC2检测技术被众多国内外临床指引推荐：美国阴道镜和宫颈病理协会指引(ASCC)、中国宫颈癌筛查及早诊早治指引、生殖健康专家协会(ARHP)、世界卫生组织国际癌症研究所(IARC WHO)、国际宫颈癌防治联盟指南(ACCP)等公认、推荐检测HPV的有效方法。
　　3、HC2可检测到世界卫生组织(WHO)确认引起宫颈癌的13种高危型HPV病毒。目前WHO认可的高危型HPV病毒只有13种(16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68)。
　　4、HC2采用专利的全长8000个碱基对的RNA探针，避免因病毒发生变异或缺失而导致假阴性的检测结果，减少临床漏诊率。大多数采用PCR方法的HPV检测技术，在病毒DNA扩增时所使用的引物只有20至几百个碱基对，一般不会超过450。但事实是，对于HPV高度当L1节段丢失后,就会引起假阴性的误诊结果。
　　5、HC2有统一的判定标准：&1.0pg/ml为阳性(相当于5000拷贝/次)，减少临床误诊率。
　　6、临床发现高度病变的平均敏感度为94% 。
　　武汉仁爱医院专家提醒：
　　以下人群应定期做&HC2&HPV-DNA检测&：
　　1、女性开始性生活，或21岁之后大约3年后每年应当进行定期的HC2-HPV-DNA检测。
　　2、超过30岁的妇女：因为30岁以前的女性虽然处于性生活活跃的阶段，感染的机会很高，但30岁前的妇女抵抗能力比较强，绝大多数可以自身清除HPV。而超过30岁还有HPV感染的，可能就是持续的HPV感染，发展成宫颈病变甚至得宫颈癌的机会就增加了。所以建议30岁以上的妇女都应该接受HC2&HPV&DNA检测。
　　3、其它特殊人群：如首次性生活较早、早婚、早育、多子女、月经初潮较早、体内携带有阴道厌氧菌代谢物(正丁酸)等人群应该提早检测。
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