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【求助】人淋巴细胞免疫组化
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各位老师，大家好！我想做从人外周血中提取的淋巴细胞免疫组化。请问如何保存细胞以及等标本收集齐后如何制片？期待大家给予我帮助，谢谢你们！
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先给你提供些资料吧：免疫组化相关理论：1 抗原：是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，并能与相应的抗体或致敏淋巴细胞在体外或体内特异性结合的物质。常有完全抗原和半抗原之分。•
2 免疫原性：抗原刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。又称为抗原性。•
3 反应原性：抗原、抗体在体外或体内发生特异性结合并产生免疫反应的特性。•
4 抗原决定簇：抗原分子表面的一小部分具有化学活性基因的区域，此区域与相应抗体中的某些部位是互补的。 术语•
5 肿瘤抗原：是指细胞在癌变过程中出现的 具有免疫原性的大分子物质，常分为肿瘤特异性抗原和相关抗原。•
6 抗体；使机体发生免疫应答的关键分子，是机体受抗原刺激后，B淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞。由浆细胞分泌的一种能与相应抗原发生反应的一种球蛋白，它在免疫应答中通过免疫网络和各种调节机制发挥重要的免疫效应。•
7 多克隆抗体（PcAb)：利用已知抗原免疫动物后所获得的免疫血清中所提取的免疫球蛋白。1890年抗毒素的出现，标志着第一代抗体－多克隆抗体的产生。它的特异性相对低于McAb,但亲和力高。术语•
8 单克隆抗体（MAb):通过杂交瘤技术制备出的只针对一种抗原决定簇的抗体。1975年抗绵羊红细胞抗体的出现，标志着第二代抗体－单克隆抗体的产生。它特异性及纯度都比较高，但产量较低。•
9 基因工程抗体（GEAb):利用基因工程技术，以抗体的分子结构、编码基因及抗体多样性产生机制为基础，有目的的对抗体基因进行改造和重组而人工合成的抗体。1984年鼠－人篏和抗体的出现标志着第三代抗体－基因工程抗体的产生。特异性更高，针对性更强，人抗鼠抗体（HAMA）产生少，更适于人肿瘤的导向治疗，有望大规模生产。术语•
10 噬菌体抗体：通过模拟抗体多样性的机制，把人B细胞谱中的VH和VL基因片段通过PCR技术进行克隆和扩增，并随机重组到丝状噬菌体载体中，继而感染大肠杆菌；经过增殖、筛选、经点突变或链置换而获得的高亲和力⒏咛匾煨缘目固濉８每固宓牟??靡嬗?989年噬菌体抗体库（组合文库）技术的建立。该抗体制备方法简单、快速（几周），产量大，应用前景广。•
11 杂交瘤细胞：用一种肿瘤细胞（如骨髓瘤细胞）与淋巴细胞（如脾细胞）融合所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞。它既保留了瘤细胞无限增殖的能力，又有淋巴细胞分泌免疫球蛋白及免疫因子的一些特性。术语•
12 癌基因：动物细胞或病毒内存在的能引发癌瘤的一段核酸顺序。分为病毒癌基因（V-onc）,细胞癌基因（C-onc）。•
13免疫荧光技术：1941年发明的用荧光素标记抗体，然后进行抗原、抗体反应而形成抗原、抗体、荧光素复合物，再使用荧光显微镜进行观察、定性、定位的技术。•
14免疫酶化学技术：六十年代发展起来的，利用抗原抗体特异性结合的原理，通过标记酶的化学反应，催化酶底物显色；达到标记细胞内某种抗原性物质的定性、定位的检测技术。术语•
15 免疫电镜技术：1959年发明的利用免疫组织化学反应将高电子密度物质标记于组织或细胞内的大分子物质（抗原）上，再用电子显微镜进行亚细胞水平上的定位、定性的技术。•
16原位分子杂交技术（ISH）：始于七十年代早期的应用含互补序列标记的DNA或RNA（探针），在适宜的条件下与组织细胞内特定的DNA或RNA以碱基互补的原则，形成稳定的杂交体。再应用与标记物相对应的检测系统在组织原位形成带颜色或荧光的物质，以进行定性、定量的技术。术语•
17 聚合酶链技术（PCR）：1985年Mullis等发明的一种在体外模拟复制、合成某一DNA或RNA的新技术。此技术可以在短时间内进行大量的基因扩增，使极微量的基因物质得以快速、简便、有效地显现。•
18激光扫描共聚焦显微镜技术（TCLSM）：始自于八十年代的，采用共聚焦显微成像的原理，在荧光显微成像的基础上加装了激光扫描装置，再利用计算机进行图像处理。可对组织细胞内部进行立体断层扫描，达到了动态观察的一种全新的技术。有细胞CT之称。术语•
19 生物芯片技术：九十年代发展起来的把不同点阵密度（高、中、低）的已知或未知的探针分子（如寡核苷酸或cDNA）或蛋白质固定于玻片或硅片等支持物上后，与标记的样品分子进行杂交反应，通过激光共聚焦显微扫描等的检测，对杂交或反应信号进行实时、灵敏而准确的分析，从而获取待测样品的名称、克隆鉴定、强度和比例、归一化参数和可信限等生物学资料的一门技术。现包括基因芯片、蛋白质芯片、抗体芯片。日公布的人类基因组工作草图得益于此项技术。1998年该技术被美国列为当年度自然科学领域的十大进展之一。术语•
20 免疫脂质体的靶向治疗技术：载药脂质体与单克隆抗体或基因抗体供价结合成免疫脂质体，借助抗体与靶细胞表面抗原或受体结合的作用，经接触释放、吸附、吞噬、吞饮及融合等方式，释放出包封的药物,来特异性的杀伤靶细胞，而达到治疗的目的的技术。•
免疫脂质体具有制备工艺简便，无毒、无免疫原性及可被生物膜利用的特点，它携带、保护及释放药物的能力高于Mab,是现阶段抗体靶向治疗的研究热点。二、细胞免疫组化的操作步骤：1 脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 （1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； （2）无水乙醇中浸泡5分钟； （3）95%乙醇中浸泡5分钟； （4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2 抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。（1）抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 （2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3 免疫组织化学染色 SP法 （1）脱蜡、水化； （2）PBS洗2～3次各5分钟； （3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟； （4）PBS洗2～3次各5分钟； （5）抗原修复； （6）PBS洗2～3次各5分钟； （7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 （8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 （9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。（10）PBS洗3次各5分钟；（11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；（12）II抗中可加入0.05%的tween-20。（13）BS洗3次各5分钟；（14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；（15）PBS或自来水冲洗10分钟；（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；（17）自来水冲洗10～15分钟； （18）脱水、透明、封片、镜检。 SABC法 （1）脱蜡、水化。 （2）PBS洗两次各5分钟。 （3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 （4）抗原修复。 （5）PBS洗5分钟。 （6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 （7）滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 （8）PBS洗三次每次2分钟。 （9）滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 （10）PBC洗3次每次2分钟。 （11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。 （12）PBS洗4次每次5分钟。 （13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。 （14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 （15）脱水、透明、封片、镜检。 内容仅供参考 ，希望对你有帮助！！
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谢谢您给我提供这么详细的资料！但是我想用细胞来做免疫组化，而且细胞蛮少，不能用沉淀物做切片，想做涂片的。有哪个好心人做过可以给我建议啊
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【求助】Ki67免疫组化 检测组织细胞增殖
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不知道园子里有没有战友做过Ki67的免疫组化，我刚才搜索了一下没有找到很多，归档贴有一个不过也是没有人给予回答的了。Ki67作为一种核抗原，近些年来被认为是一种测定细胞增殖的一个重要指标。最近做IHC检测肿瘤组织与非肿瘤组织中细胞的增殖情况，因为是第一次做，参考抗体说明，并设置了三个不同的稀释度，方法按照常规免疫组化步骤进行，PBS代替一抗作隐形对照，ABC staining systerm 显色，苏木素复然20sec。但是三个抗体稀释度的结果都不是很理想：1、不论是胞浆还是核染色普遍较浅；2、感觉Ki67的特异性不是很好，没有很好的细胞定位，本来应该与细胞核中的Ki67抗原结合吧，但是却会在胞浆中发现有棕色出现。 针对这两个问题不知道各位战友有何看法，希望各位不吝赐教 谢谢补充说明：检测的小鼠胃组织（发生肿瘤），IHC-P；Ki67抗体（Imgenex公司）；ABC（Santa）。
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没有人响应哈 呵呵 自己再顶一下
别石沉大海了哦问题还没解决，做过的没做过的 希望各位能给予一些建议 谢谢！！
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免疫组化，核抗原一般选用碱修复，你先看看你的抗体说明书上用什么修复方法，修复时间是多少？表达不好，很大的原因是修复没有控制好。一般需要注意两个方面，修复的时间，修复的酸碱度，这两个对结果有很大影响。
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再就是Ki67在临床上是一个很常用的IHC指标，国内有很多公司也卖，有很成熟的工作液可以选择。一般定位在细胞核。你在摸下条件，并看看抗体说明书上说的阳性定位。
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你好，我们公司有做过这个！不过做的不是小鼠的组织，是人的！上传一张图给看看，一张是商品买的，一张是我们公司自制的！另外寻问一个问题，你做的小鼠组织脱水处理是怎么处理的，我一直苦于组织脱水问题！望指教
商品Ki67 组织是乳腺癌
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自制Ki67 乳腺癌
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