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人表皮生长因子基因的克隆、表达及其在植物中的遗传转化研究
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下载文档:人表皮生长因子基因的克隆、表达及其在植物中的遗传转化研究.PDF&&&&摘要：猪表皮生长因子是猪乳中含量最丰富的生长因子之一，是一种强有力的细胞有丝分裂原，具有许多重要的生理功能。本文综述了猪表皮生长因子的生理特性及对胃肠道的作用，阐明了猪表皮生长因子与早期断奶仔猪胃肠道发育的关系，探讨了猪表皮生长因子作为早期断奶仔猪饲料添加剂的发展前景。关键词：猪；表皮生长因子；生理作用；应用&&&&表皮生长因子(epidermal&growth&factor，EGF)是动物乳中含量最丰富的生长因子之一，它主要由颌下腺腺管细胞合成分泌，合成后被释放到唾液、胃液、肠液、尿液、乳汁、血液、精液、前列腺液和羊水等体液中。EGF是一种强有力的细胞有丝分裂原，具有刺激细胞分裂、增殖与分化、促进离子交换和细胞外基质合成等生物学特性。猪表皮生长因子(porcine&epidermal&growth&factor，pEGF)是猪乳中含量较高的一种生长因子，其功能和结构与人、牛、鼠等动物的EGF类似。据相关文献报道：pEGF有利于猪早期胚胎发育、能提高母猪的窝产仔数、提高仔猪成活率。以及促进断奶仔猪的生长。目前，EGF与动物消化道关系方面的研究受到人们的普遍关注，并已成为研究的热点之一，但针对pEGF的研究报道还相对较少。关于pEGF的研究限于：pEGF在原核生物、单细胞生物中的表达及其生物活性的鉴定；pEGF对早期断奶仔猪胃肠道发育的影响；pEGF对某些特定生理指标的影响。本文综述了国内外有关pEGF生理作用，pEGF产品的开发及其在养猪生产中的应用研究进展，以期为pEGF作为新型饲料添加剂产品的工业开发和在养猪生产中的应用提供参考。1猪表皮生长因子的生理作用&&&&猪表皮生长因子(porcine&epidermal&growth&factor，pEGF)是含有53个氨基酸的单链多肽，分子质量为6&ku。作为一种丝裂原，pEGF能刺激培养细胞的分裂增殖，同时也能促进表皮细胞及其他组织的生长与分化。pEGF在猪常乳中的相对含量约为124ug/l，初乳中的含量是l&500ug/比常乳高10倍；而人初乳中的含量为350ug/l比常乳高70倍。研究表明，pEGF在哺乳仔猪胃肠道中比较稳定而不易被消化，甚至部分能被完整吸收进入循环而作用于外周器官，且乳中的EGF对初生动物胃肠道生长发育具有重要作用。1．1&&促进肠道上皮细胞的增殖和分化&&&&EGF是一种强烈的细胞分裂刺激物，主要作用是促进上皮组织的细胞增殖与肠细胞分化。，对胚胎的发生和生长以及组织修复和再生均有调节作用，并能增加DNA与蛋白质的合成。研究表明，EGF能显著增加回肠黏膜DNA的合成与上皮细胞的增殖，调节肠细胞分化，刺激胃肠组织生长。EGF能显著增加初生大鼠胃的重量、泌酸黏膜细胞DNA和RNA含量¨5|，用3H．胸苷掺入DNA作为生长的短期指标，EGF能加速3H一胸苷掺人初生大鼠小肠的DNA，饲喂EGF的泌乳大鼠小肠重量、长度及DNA、RNA含量均高于对照组；在乳中加入EGF抗体则抑制小肠生长，这表明EGF对新生大鼠小肠生长有促进作用；用EGF对吮乳大鼠处理3&d后显著增加小肠单位长度的重量，而断奶大鼠则无此现象。本文来自搜猪网&。1．2增加胃肠黏膜血流量并抑制胃酸分泌&&&&EGF能显著增加胃黏膜血流量，在胃黏膜的防御功能中起重要作用。Ishi&kawa等报道，EGF能显著降低缺血再灌注损伤，治疗组黏膜损伤指数由40％±6％降至17％±6％，组织学坏死深度亦减轻，表明EGF能保护黏膜微血管，改善微循环，发挥了细胞保护作用。Hui等观察对照组及行颌下腺切除组大鼠的胃黏膜血流量，发现在生理状态下，两者无明显差异；但给予乙醇后，颌下腺切除组的胃黏膜血流量明显下降，当给予大剂量EGF灌胃后，黏膜血流量明显增加，黏膜损伤程度减轻。由此提示在生理状态下，EGF对血流影响较小，当使用大剂量时，可显著增加血流量并参与黏膜早期的修复过程。此外研究证实，EGF能抑制组胺刺激的胃酸分泌，其抑制壁细胞分泌是通过诱导鸟氨酸脱羧酶活性和增加多胺合作而发挥作用。1．3影响肠道生物酶的活性&&&&pEGF对断奶仔猪胃肠道的发育有非常重要的影响。断奶使得乳源性EGF突然中断，仔猪的消化系统还未发育完全，抵抗力较弱，断奶仔猪的胃肠黏膜难以适应饲料，从而引发断奶应激。断奶应激会造成仔猪肠道损伤、绒毛高度降低和腺窝深度增加，同时伴随黏膜上皮细胞刷状缘的水解酶(乳糖酶、蔗糖酶等)活性降低及养分吸收能力下降。利用外源EGF调节黏膜刷状缘消化酶的活性，改善机体对养分的消化利用是促进初生动物生长的有效措施。研究表明，EGF能提高新生仔猪或小鼠小肠黏膜刷状缘水解酶及胰腺消化酶的活性，加强小肠和胰腺的分泌功能，从而明显加快初生动物肠道的成熟。同时，GF能显著增加乳糖酶活性。研究表明，对3&~13龄仔猪使用EGF可使肠道乳糖酶和麦芽糖酶的活性升高。EGF能使新生小鼠蔗糖酶活性提前升高，增加海藻糖酶、葡萄糖淀粉酶、乳糖酶、碱性磷酸酶活性。对5&~13龄前大鼠施用EGF可增加空肠蔗糖酶和氨基肽酶的活性，同时能促进其胃和十二指肠鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性。每l3给予断奶仔猪124&ug或372ug&EGF，空肠蔗糖酶及乳糖活性提高，且呈浓度依赖性。1．4促进胃黏膜黏液糖蛋白的合成及受损胃肠组织的恢复&&&&糖蛋白是胃黏膜屏障的主要成分，可形成具有强烈黏滞性的糖蛋白凝胶，覆盖在胃黏膜上皮细胞表面，保护胃黏膜免受各种损伤因子的侵蚀和攻击，同时，覆盖黏液可提供有利于细胞增殖的良好碱性环境，有利于黏膜的修复。EGF具有促进猪肠黏膜细胞分化和刺激黏液释放的作用，同时外源性EGF也有助于受损胃肠组织的恢复。感染旋转病毒的新生仔猪代用乳中添加0．5或1．0&m9／L&EGF，其小肠绒毛高度与乳糖酶活性的增加呈剂量效应。20&kg重的猪每天按0．5ugkg腹腔注射EGF&5&d，能增加防止胃被损伤的张力强度。此外有试验证实，EGF能防止E．coli等病菌侵入兔、大鼠等动物肌体，并改善其受损肠道的消化机能。&&&&EGF具有促有丝分裂和非促有丝分裂二重活性，能刺激外胚层、中胚层和内胚层细胞增殖和分化，促进组织生长、发育和成熟。EGF在伤口愈合过程中能刺激角膜上皮细胞增殖、趋化和移行。在体外培养的牛角膜内皮细胞中，EGF表现出潜在的有丝分裂原的特性，增加细胞数量，促进DNA合成和有丝分裂。在器官培养的人角膜内皮损伤模型中，EGF促进内皮细胞的DNA合成，加速损伤区愈合的动物模型中，EGF增加角膜内皮损伤愈合速度，刺激内皮细胞增殖。&&&&本文来自搜猪网&。&&&&此外，EGF还具有增加体内物质的转运和糖代谢、增加前列腺素的合成和释放、维护皮肤细胞外基质、促进皮肤毛细血管的生成、促进细胞存活、延缓皮肤衰老及抑制皮肤癌变的作用。并且在猪体细胞克隆胚胎体外发育胚胎培养基中添加10&ng／mL&EGF或FGF能提高猪克隆胚胎的囊胚发育率。2猪表皮生长因子产品开发及其应用&&&&，2．1猪表皮生长因子产品开发2．1．1利用基因工程技术开发&&&&汪洋等人采用人工合成的pEGF基因为模板，通过PCR扩增获得pEGF一6His片段，将其克隆到载体pPIC9构建重组质粒pPIC9一pEGF并电转化毕赤酵母，。获得毕赤酵母pEGF工程菌。对工程菌的表达产物，用His-ta9亲和层析纯化方法，可使重组pEGF的纯度达到95％以上。&&&&&&
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多角体人表皮生长因子融合蛋白基因（PhEGF）在家蚕细胞和幼虫中表达研究.pdf88页
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仅表皮生长因子 hEGF 是从人尿中提取的由;:个氨基酸组成的小
分子活性多肤，是促进细胞增殖和分化至关重要的生长因子护为大量获
得 EGF，本研究利用家蚕杆状病毒表达系统，以家蚕作为生物反应器，
在家蚕细胞和幼虫中表达人表皮生长因子。
她pET22-EGF质粒中分离出末端带His-tag的EGF基因，对位融合
于多角体蛋白N端 116个氨基酸基因序列的下游
命名为Ph-EGF ，并
在两段基因间设计了凝血酶Xa蛋白酶切位点，经过酶切、测序等鉴定正
确后，克隆至 pBacPAK8中，使 Ph-EGF融合基因置于多角体蛋白
polyhedrin,ph 基因启动子控制之下，构建成重组转移载体
pBacPh-EGF。重组转移载体DNA与经Bsu36I酶切线性化的修饰型病毒
Bm-BacPAKDNA共转染家蚕BmN细胞，两轮空斑筛选和纯化，获得重
组病毒 :BmBacPh-EGF，经PCR扩增、DNA点杂交等方法鉴定证实重组
病毒中己正确插入Ph-EGF融合基因。
将重组病毒rBmBacPh-EGF以lOMOI感染BmN细胞，72小时后收
集培养细胞和上清:培养上清和经超声波处理的细胞样品ELISA检测发
现胞内样品中存在能与EGF抗体免疫反应的产物，粗略估计表达量约6-7
ug/2X106个细胞
相当于EGF标准品 ;重组病毒rBmBacPh-EGF穿刺
接种5龄家蚕幼虫，每隔24h收集蚕血淋巴，经ELISA检测发现第4天
表达量最高，根据 EGF标准曲线计算蚕血淋巴的表达量约 32ug/
ELISA定性实验还发现正常蚕血也存在与EGF抗体间交叉反应的物质。
蚕血淋巴SDS-PAGE和Westernblotting分析发现在19kD的位置有特异
性条带，与预期表达的融合蛋白大小相一致。
用小鼠Balb/c3T3成纤维细胞和MTT法测定表达产物的促细胞增殖
作用，发现重组病毒感染家蚕细胞72小时的胞内样品与
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