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大肠埃希氏菌对喹诺酮类药物的耐药现状及防治
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　　摘要：喹诺酮类药物（Quinolones，Qs）是一类合成广谱抗菌药，自20世纪60年代萘啶酸被运用于临床医学以后，同时喹诺酮类药物的耐药问题便接踵而至，这使得喹诺酮类药物成为开发最活跃，更新换代最迅速的药物。由于其具有抗菌谱广，抗菌活性强，与常用抗菌药物无交叉耐药，已成为临床治疗感染性疾病的主要药物之一。然而，随着喹诺酮类药物在人医和兽医临床的广泛、长期、大量盲目滥用，使得其耐药性近年呈蔓延增长趋势，耐药程度越来越重，耐药菌株越来越多。其中，大场杆菌对喹诺酮类药物的耐药性问题是当前国内外研究的热点。本文综述了大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药现状及特点，并分析了其耐药机制，简要综述了减缓耐药性的一些防治策略。 中国论文网 /1/view-5035824.htm　　关键词：大肠杆菌；喹诺酮类药物；基因传递；耐药机制 　　1 大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药现状和特点 　　针对大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药趋势日益严重的情况下，人们进行了大量的调查及科研工作，并取得了一定成果，同时也揭示了大肠杆菌的严重耐药所产生的不良后果。 　　1.1 耐药现状 喹诺酮类药物在国内90年代被广泛使用，由于喹诺酮类药物容易产生耐药且作用机制相似，所以不同喹诺酮类药物之间可能存在交叉耐药。有关大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药调查和研究在国外开展得比较早。美国德克萨斯州休斯顿本.托比综合医院从年从1700例患者中分离出21000株大肠杆菌，其中对氟喹诺酮类药物不敏感大肠杆菌从1999的6%增加2004年的25% [1]。捷克斯洛伐克Zemkova M， Kotlarova J [2]等人做了一项关于尿路感染的大肠杆菌耐喹诺酮类药物的实验，从2001年到2006年从尿路感染的住院患者和门诊患者中收集了11856株大肠杆菌并且测试了他们对喹诺酮类药物的敏感性，结果显示：住院患者中的耐药大肠杆菌比例从2001年的2%增加到2006年的10%，门诊患者耐药大肠杆菌比例从1%增加到11%。 　　在兽医临床上，一相有关欧洲八国动物用三代喹诺酮类药物"马波沙星"的监测研究表明，从年，"马波沙星"在家禽和动物的MIC90： 从1.275ug/ml增加到5.098ug/ml（P=0.]。西班牙Sabaté M 4[4] 等人，对分离出的85株大肠杆菌（43株，25株，14株，1株分别来源于鸡、人、猪、牛的废水），进行遗传系谱、致病岛（pathogenicity islands，PAIs）、喹诺酮类药物耐药分析，结果显示：人源性的耐氟喹诺酮类药物大肠杆菌从鸡传递给人的可能性要比人自身肠内大肠杆菌因氟喹诺酮的应用选择出耐药大肠杆菌的可能性要大，但同时有实验表明禽类大肠杆菌耐药性可能通过禽类制品食物链传递给人类[5，6]。 　　我国使用喹诺酮类抗菌药物之初，大肠杆菌对喹诺酮类药物敏感性极高，但随着喹诺酮药物的广泛运用，各个地区都出现了耐药性菌株的激增。北京医科大学临床药理研究所研究发现，临床分离的大肠杆菌对环丙沙星耐药菌株1993年为3.3%，1996年上升到44.2%，1998年高达62.8%。年，复旦大学华山附属医院联合国内主要地区（北京、上海、浙江、广州、武汉、重庆、甘肃、新疆）较有代表性的医院从临床分别分离出6072株和6527株大肠杆菌，06年对环丙沙星耐药率为61.7%[7]，而07年产ELBL的E.coli耐药率为71.8%，不产ELBL者为44.8%[8]。 　　我国兽医临床上的大量长期使用喹诺酮类药物导致了严重耐药的境况，有研究[9]利用药敏实验自动监测系统（trek Diagnostic System，Westlake，OH）分析了71株鸡源大肠杆菌分离菌株对9种喹诺酮类药物的耐药性，结果表明临床分离菌株对沙拉沙星、恩诺沙星、环丙沙星、二氯沙星、单诺沙星、奥比沙星和萘定酸呈现很高的耐药性，耐药率分别为69%、69%、55%、76%、69%、76%和99%；对盖特沙星和左氧氟沙星有轻度的耐药性，耐药率分别为11%和13%。在71株分离菌株中，只有1株没有耐药性，对3种以上药物有耐药性的菌株占74%（52/72），对6种以上药物有耐药性的菌株占70%（49/70），呈现多重耐药性，多重耐药性甚至可能通过使用抗生素的种类、时间和剂量来进行调节。另外，赵春燕[10]报道， 20世纪90年代前、9O年代、9O年代以后（鸡、猪）耐药菌株百分比分别为： 28.73 %、43.19% 、53.47% ，说明大肠杆菌耐药性逐渐增强，目前病原菌对大多数喹诺酮类药的耐药率达50% 以上。国家细菌耐药性监测中心收集的从年常见菌种对环丙沙星耐药率的变迁可以看出，国内大肠杆菌对环丙沙星的耐药率自1994 年开始一直维持在50%～60%左右[11]，而到了2000年～2003年从全国11个省份分离出家禽和猪源性大肠杆菌393株，药敏实验表明他们对环丙沙星的耐药率已经达到了74.8%[12]。 　　综合以上可以看出，虽然我国90年代以后才开始大量使用喹诺酮类药物，但国内大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药率与国外相比则后来居上，那么人源性大肠杆菌对喹诺酮类药物的高水平耐药率，是否和喹诺酮药物在兽医临床的大量长期的使用有关，耐药基因是否可能通过动物种群传递给人，有关研究提出了这个可能性 [5，13，14]。 　　1.2 大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药特点 美国休斯顿本.托比综合医院[1]从用药时间，患者年龄，菌株的标本来源等方面分析大肠杆菌的耐药性，有如下特点：①用药时间越长，大肠杆菌对氟喹诺酮类药物不敏感率增加，通过二元回归分析（P65岁患者中耐药株占到29%，而<65岁者为13%，两者有明显差异（P<0.001）。③住院患者的耐药率高于门诊患者。④ 痰样本分离的菌株耐药率最高。
　　2 大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制 　　通过近年来的研究表明，大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药性产生主要有以下相关耐药机制。 　　2.1 喹诺酮类药物作用靶位的改变 喹诺酮类药物的作用靶位主要在细菌的DNA回旋酶（gyrase）和拓扑异构酶Ⅳ（TOPOⅣ）。DNA 回旋酶是由2个A亚基（97-kDa）和2个B亚基（90-kDa）构成的四聚体，分别由gyrA 和gyrB基因编码。拓扑异构酶Ⅳ是由2个C亚基和2个E亚基组成的四聚体，分别由parC和parE基因编码。两种酶作用机制相似，回旋酶作用DNA产生负超螺旋，并可以切断和连接DNA环。TOPOⅣ同样能松解正、负超螺旋，在切断DNA环功能上要优于DNA 回旋酶。这两种酶一起作用于DNA的复制、转录、重组和修复 [15]。喹诺酮类药物与酶-DAN结合为药物-酶-DAN复合物，这种复合物是药物作用的基础，它干扰了TOPOⅣ和DNA回旋酶的活性，干扰阻止DNA环的修复从而抑制DNA 的合成起作用 [16]。gyrB基因和parC基因突变可促进gyrA基因突变，导致耐药性的产生。在抑制与反抑制的较量中，细菌编码回旋酶的基因突变，亦然成了耐药株的来源。喹诺酮耐药决定区（quinolone resistance determiningregion，QNDR）即是A亚基或C亚基涉及关于氨基酸替代导致耐药的区域，QNDR多位于与DNA结合的酶表面。对大肠杆菌而言，它的DNA回旋酶氨基酸替代区域位于第51-106位点之间的氨基酸，其中，发生突变最多的是83（Ser→Leu）和87（Asp→Gly）位氨基酸。这种突变导致了喹诺酮类药物与酶-DAN亲和力的降低，导致耐药的产生。 　　2.2 大肠杆菌对喹诺酮药物的主动外排 根据能量来源的不同，主动外排系统可分为质子依赖型多药耐药泵和ATP依赖型多药耐药泵2种类型，大肠埃希菌以前者为主。RND家族是大肠埃希菌产生多药耐药性最重要的家族之一，其中AcrAB-TolC系统为主要代表，是目前耐药研究中的热点，属于质子依赖型，能够产生对多种抗菌药的高水平的多重耐药，该系统主要由细胞内膜泵（AcrB）通过跨膜融合蛋白（AcrA）与外膜的排除泵（TolC）连接而组成，它有较宽的作用底物范围，包括了喹诺酮类、氯霉素、四环素等多种抗生素、染料和去污剂等。用基因敲除技术人工去除acrAB或tolC基因时，大肠埃希菌对上述药物的敏感性明显增加。目前还发现，药物分子外排主要和H 相偶联，它们构成一个反向转运蛋白，通道开放后，H﹢由于浓度梯度内流，药物分子随即外排[17]。 　　2.3 外膜通透性下降 有研究[18]表明，大肠杆菌的外膜在耐药过程中起着重要的作用。 大肠杆菌的外膜对许多抗菌药物的通透性较低，形成一道天然的屏障，阻碍抗菌药物进人菌体细胞内发挥抗菌作用.然而大肠杆菌外膜上存在的多种外膜蛋白质，对大多数疏水性药物具有良好的通透性。亲水的氟喹诺酮类药物均主要通过大肠杆菌外膜孑L蛋白（OmpF和OmpC，主要是OmpF）进入细胞内发挥抗菌作用.然而，膜通透性的改变只能引起大肠杆菌低程度的耐药。 　　2.4耐药基因的传递 目前大家最为关注的问题是耐药的菌株是否可能将耐药基因传递给人类并导致感染性疾病，国外有一些实验能够给出较为肯定的答案。A.E.van den Bogaard等收集了作为常规加抗生素喂养的火鸡、肉鸡和不作为常规加抗生素喂养的蛋鸡粪便中的E.coli，收集了喂养这些家禽的饲养者以及屠宰火鸡、肉鸡的工人粪便中的E.coli，并将上述获得的E.coli做环丙沙星耐药实验及PFGE分型。耐药结果显示：源于火鸡、肉鸡及其饲养者和屠宰者耐药率高于来源蛋鸡及其饲养者耐药率，并有显著差异；PFGE分型：来源于两个农场之间的E.coli PFGE分型存在差异，但来源于同一农场的火鸡、火鸡饲养者和屠宰者Ecoli的PFGE分型一致，这些结果强烈的暗示耐药菌株的耐药基因可能从家禽传递给人类；但同样在荷兰，一个肉牛农场常规使用喹诺酮药物近20年，却没有发现广泛的耐药质粒流行，这种现象是否和动物种属有关，有待于进一步研究。 　　在西班牙的巴塞罗那，有研究者集了117株E.coli，其中，35株源于人血培养，33株源于人粪便，49株源于鸡粪便，通过环丙沙星耐药实验，毒力基因测定（papA、sfa/foc、iha、cnf1、fyuA、iutA、iss等21个毒力基因），RAPD和PFGE分型。结果：人源性耐药Ecoli与敏感Ecoli的毒力基因具有较大差异但与鸡源性耐药Ecoli的毒力基因较为接近。 　　氟喹诺酮抗性质粒在耐药性传递方面一直被认为只是一个诱因。Martínez-Martínez L等应用细菌结合试验研究了氟喹诺酮抗性质粒的存在与否对E coli耐环丙沙星和奈啶酸突变频率的影响，结果发现来自肺炎克雷伯氏菌的一个多重耐药质粒pMG252转入外膜孔道蛋白不完整的肺炎克雷伯氏菌可使其对环丙沙星的MIC达到32 mg/ml。这一质粒在其它肠球菌和假单胞菌有广泛的宿主菌并能表达氟喹诺酮抗性。含有该质粒的E.coli其耐药性突变的频率比不含质粒的菌株的高100倍，且对环丙沙星的MIC值增高到原菌株的16倍。 　　3 防治对策 　　3.1 合理用药 减缓细菌对氟喹诺酮类药物耐药的关键在于合理用药。在一些发达国家大肠杆菌对氟喹诺酮类耐药率为10%左右，而在我国达5O%以上，并且出现了较强的交叉耐药性，主要是由于滥用、误用引起。所以在用药前需要做药敏试验，选择应用高敏药物，同时注意经常更换或交叉使用其他药物以提高疗效。除了参考药敏试验外，还应根据药物在体内的分布特点选择药物和剂量。 　　3.2 严格控制人兽共用抗菌药的运用 目前，我国兽用与人用抗菌药物之间没有严格区分，有的则把刚上市的人用新药转到兽医临床应用，这是细菌产生耐药性传递的一个重要途径。所以，各级药政部门要严格把关，对人用抗菌药转为兽用应该慎重对待。
　　3.3 联合用药 通过联合用药可扩大抗菌谱、增强疗效、减少用量、降低或避免毒副作用，减少或者延缓耐药菌株的产生。有报道氟喹诺酮类与头孢菌素合用时对它们各自的耐药株具有协同作用。还有人证实，将多重耐药泵抑制剂利血平与氟喹诺酮类药物联合运用能显著抑制细菌对氟喹诺酮类药物耐药性的发生，碱化局部环境也可显著提高氟喹诺酮类的抗菌活性[9]。 　　3.4 重视生态环境 抗菌素能够在来源于医院、制药厂和喂抗生素饲料的养殖场的下水道和污水中找到，细菌耐药可能从一个生态系统传到另一个生态系统。面对细菌耐药，要求我们不仅在医院严格执行消毒制度，规范使用抗生素；也要求整个社会与抗生素相关的各行各业肩负起对抗细菌耐药的责任。 　　3.5 研制新药 研制新药是解决氟喹诺酮类药物耐药问题的重要途径之一。氟喹诺酮类药物不是天然药物，因此对其结构进行改造将是非常有效的方案，现已开发出第四代氟喹诺酮类药物，但是我们仍然要警记，细菌的耐药速度越来越快，解决耐药的根本途径在预防。 　　4 展望 　　细菌耐药性的日益严重，迫使人们采取各种对策以保护人类自身的生存安全。喹诺酮类药物不失为一类疗效确切、抗菌广谱的药物，该类药物尽管已经出现了不容忽视的耐药性问题，但仍为许多疾病的治疗首选药。抗生素选择压力与细菌耐药性的发展呈正相关，合理而有效地使用，杜绝乱用、滥用，除了在临床抗感染治疗中应合理使用氟喹诺酮类药物；还要在农业、畜牧业中规范使用氟喹诺酮类药物，这不仅保护了人类自身，也保护了一类抗菌药。只有这样，才能延缓甚至阻断耐氟喹诺酮类药物细菌的传播和蔓延。 　　参考文献： 　　[1]Boyd LB， Atmar RL， Randall GL， et al. Increased fluoroquinolone resistance with time in Escherichia coli from >17，000 patients at a large county hospital as a function of culture site， age， sex， and location[J] BMC Infect Dis， ）：. 　　[2]Zemkova M， Kotlarova J， Merka V， et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in Escherichia coli isolates at the department of clinical hematology [J].New Microbiol， ）：423-430. 　　[3]Meunier D， Acar JF， Martel JL， et al. Seven years survey of susceptibility to marbofloxacin of bovine pathogenic strains from eight European countries[J].Int J Antimicrob Agents， 2004 ，24（3）：268-278. 　　[4]Sabaté M， Prats G， Moreno E， et al. Virulence and antimicrobial resistance profiles among Escherichia coli strains isolated from human and animal wastewater [J].Res Microbiol， （4）：288-293. 　　[5]Johnson JR， Sannes MR， Croy C， et al. Antimicrobial drug-resistant Escherichia coli from humans and poultry products， Minnesota and Wisconsin， . [J]. Emerg Infect Dis， ）：838-846. 　　[6]de Jong A， Stephan B， Silley P. Fluoroquinolone resistance of Escherichia coli and Salmonella from healthy livestock and poultry in the EU[J]. J Appl Microbiol. （2）：239-245. 　　[7] 汪复，2006年中国CHINET细菌耐药性监测[J].Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，）：1-9. 　　[8] 汪复，2007年中国CHINET细菌耐药性监测[J].Chinese Journal of Infection and Chemotherapy，2008， 8（5）：325-333. 　　[9] 杨汉春 ，陈声 ，Jianghong Meng，等。鸡源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的多重耐药性[J]. 畜牧兽医学报，）：398-404. 　　[10] 赵春燕，易世红，王放，等.大肠埃希氏菌耐药性监测及耐药质粒的研究[J].微生物学杂志，）：41-42. 　　[11] 李景文.氟喹诺酮类药物的临床应用与不良反应[J].中华医药杂志，）：64-65. 　　[12]LEI Lian-cheng， ZHENG Dan， HAN Wen-yu， et al. Antibiotic Sensitivity Detection and Analysis of Escherichia coli Isolated Clini-cally in China[J].Chinese Journal of veterinary， ）：470-473. 　　[13]Xia LN， Tao XQ， Shen JZ， et al. A survey of β-lactamase and 16S rRNA methylase genes among fluoroquinolone-resistant Escherichia coli isolates and their horizontal transmission in Shandong， China[J]. Foodborne Pathog Dis. ）：. 　　[14]Deng Y， Zeng Z， Chen S， et al. Dissemination of IncFII plasmids carrying rmtB and qepA in Escherichia coli from pigs， farm workers and the environment[J]. Clin Microbiol Infect. ）：. 　　[15] Jacoby GA. Mechanisms of resistance to quinolones [J]. Clin Infect Dis， 2005 ，15（41）：120-126. 　　[16]Webber M， Piddock LJ. Quinolone resistance in Escherichia coli[J].Vet Res，2001， 32（3-4）：275-284. 　　[17]Nishino K， Yamada J， Hirakawa H， et al. Roles of TolC-de-pendent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to beta-lactams [J].Antimicrob Agents Chemother，2003 ，47（9）：. 　　[18] 张小林，汪复，朱德妹.多重耐药大肠杆菌外膜屏障机制的研究[J].中华传染病杂志，）：195-197. 　　编辑/许言
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耐甲氧西林葡萄球菌的临床检测及耐药性分析
【摘要】：采用药敏实验与MRS的检测均采用琼脂扩散法(K-B)法检测,测定耐甲氧西林金黄色葡萄糖菌(MRSA)及耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄糖球菌(MRCNS)。结果 MRSA、MRCNS对头孢唑啉、苯唑西林、红霉素、氨苄西林的耐药率均为100%,明显高于其他抗菌药物,差异均有统计学意义(P0.05),对复方新诺明耐药率分别为100%,93.26%,对哌拉西林、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星耐药率均70%,对诺氟沙星耐药率分别为55.26%、89.72%,对呋喃妥因、氯霉素、利福平、阿米卡星耐药率均30%左右及以下,未检出对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁的耐药菌株。MRS具有多重耐药性,应积极进行病原学监测,为临床合理用药提供帮助,有效控制感染的发生。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R446.5【正文快照】：
葡萄球菌是临床是临床较常见的感染菌。随着临床上大量β-内酰胺抗生素的使用,近年来,耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)检出率及多重耐药性有显著上涨趋势,其是医院感染的一种主要病原菌[1]。MRCNS是MRS的一种致病菌,其具有低毒力,感染后无显著症状,发生多重耐药,给临床诊治工作造成很
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年夕月/日多粘菌素联合左氧氟沙星对防耐药突变研究? 叫气廿
研究生杨杰
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导师阚全程教授
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PFGE和质粒图谱分析人和猪来源德尔卑沙门菌多重耐药株的同源性
【摘要】：目的分析人和猪来源的德尔卑沙门菌的分子同源性,为研究多重耐药性在人畜之间传播提供分子生物学技术依据。方法药敏试验检测人和猪来源的德尔卑沙门菌多重耐药株对10种抗菌药物的敏感性;用脉冲凝胶电泳方法(PFGE)检测菌株间的分子同源性;结合实验或电转移试验获得目标质粒,质粒酶切图谱检测质粒的同源性。PCR分析染色体介导喹诺酮耐药基因gyr A和par C,质粒可介导的喹诺酮耐药基因qnr A/qnr B/qnr C/qnr S、aac(6′)-Ⅰb-cr、qep A和oqx AB。结果共收集48株德尔卑沙门菌,经药敏试验筛选获得11株多重耐药株(MDR),人源性8株,猪源性3株。11株菌除对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺和四环素(R型:ACSSu T)耐药外,所有菌株也对萘啶酸和环丙沙星耐药,6株对左氧氟沙星耐药,5株对头孢曲松耐药。PFGE分析,11株菌共分为6个克隆,3株动物源性菌株与8株人源性菌株无克隆相关性。喹诺酮耐药基因分析显示,有5株和3株动物源株检测到gyr A的Ser83Leu或/和Asp87Asn突变,6株人源株和3株动物源株检测到par C的Ser80Ile或/和Thr57Ser突变。质粒电泳分析显示,所有菌株都存在1-4条质粒条带,大小介于2~180kb,其中3株人源性菌株和1株动物源性株都存在4kb左右大小的质粒;2株动物源性菌株仅存在20 kb大小质粒。用结合实验和电转移方法,分析4kb质粒结构,证实4个质粒的酶切图谱完全一致,质粒中均存在介导外排基因oqx AB和喹诺酮耐药基因aac(6′)-Ⅰb-cr。结论人和猪来源的德尔卑沙门菌多重耐药株中质粒介导的外排基因oqx AB和喹诺酮耐药基因aac(6′)-Ⅰb-c是喹诺酮重要的耐药机制,可能在沙门菌间传递,导致对喹诺酮类高耐药性。通过人和猪的接触或间接途径,沙门菌有传播喹诺酮耐药性的风险,同一种质粒可在人和动物中转移而传播该耐药机制。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R378【正文快照】：
多重耐药性沙门菌一般指同时耐5种抗生素:氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺和四环素(R型:ACSSu T),但近年国内外流行病学分析发现,对喹诺酮敏感性下降或耐药的沙门菌比例呈上升趋势,尤其是非伤寒沙门菌属更为明显。年广东省腹泻病例分离的非伤寒沙门菌耐药性分析,3
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