杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种X染色体隐性遗传疾病，于上世纪80年代发现。杜氏肌营养不良在全球范围内的发病率约为1/3500-1/5000（新生儿），在美国，每年约有400-600例男孩患病。DMD患者一般在3-5岁开始发病，症状最早表现为进行性腿部肌无力，12岁时失去行走能力，20岁-30岁时常因因呼吸衰竭而死亡。到目前为止，临床应用中尚无能够治愈此类疾病的疗法。DMD基因与突变1987年，科学研究首次鉴定出引发DMD疾病的基因突变，该基因因此被命名为DMD。DMD基因编码dystrophin蛋白（抗肌萎缩蛋白），dystrophin主要分布于骨骼肌和心肌细胞，通过其N端和C端分别与细胞骨架和细胞膜，起支架作用，可以保护肌细胞膜在肌肉收缩时不受损伤。DMD基因的突变会引起多种肌肉系统疾病，根据突变的位点不同，患病的严重程度有所差别，DMD为其中较为严重的一种病症，除了DMD， Becker muscular dystrophy（BMD）也是由DMD基因突变所引起，但BMD症状较轻。虽然DMD和BMD均由DMD基因突变所引发，但导致这两种疾病的DMD基因突变类型不同：DMD基因突变类型为移码突变（读码框移动）或无义突变（生成一个终止密码子），这两种突变将导致dystrophin蛋白翻译的提前终止从而导致一个截短的dystrophin蛋白产生；而导致BMD的DMD突变类型为整码突变（in-frame mutation），该突变将导致dystrophin蛋白缺失一部分（由46-54号外显子编码的部分），但读码框未发生移动，dystrophin蛋白的N端和C端功能较为重要的一些序列得以保留，因此与DMD相比，BMD的症状相对较轻（如下图所示）。DMD疗法关于DMD的治疗，目前广泛采用的疗法是皮质激素，该药物作用有限且副作用大，在此不再赘述（对DMD疗法的历史感兴趣的同学可以阅读PMID31508685），下文将对目前研发中的基因和干细胞等疗法进行总结。截止到目前为止，已经有三款DMD药物上市，分别为PTC公司的ataluren（EMA批准上市）以及Sarepta Therapeutics公司的golodirsen和eteplirsen（FDA批准上市）。除了上述三款药物以外，还有一些药物处在研发阶段，这些药物可分为外显子跳跃（exon skipping）、基因递送（gene addition）、基因编辑（genome editing）、终止密码子通读 （stop codon readthrough）、干细胞疗法（stem cell therapy）等几种类型，如下表所示：表1 DMD上市药物和临床试验1. 基因递送疗法基因递送疗法旨在在患者的肌肉细胞内重新表达健康的dystrophin蛋白。然而目前广泛采用的病毒载体感染肌肉细胞的效率极低，难以完成dystrophin基因的递送。腺相关病毒AAV的某个亚型可以选择性感染肌肉细胞，因此是DMD治疗理想的载体。但AAV也有其弱点：AAV由于病毒大小所限，只能装载长度不超过4.5kb的DNA，然而DMD的mRNA长度超过了14kb，显然远超AAV大小的限制，目前较为可行的方法是表达一个较短的dystrophin（microdystrophin，如下图所示）。Microdystrophin保留了相对重要的ABD1、ABD2和Cys结构域，能完成大部分dystrophin蛋白的功能：在表1肿瘤列出的基因递送疗法的三项临床试验中，总体上来看，病人的肌肉纤维均得到了一定程度的改善。其中有部分病人80%的肌肉细胞中均能监测到全长的dystrophin表达，这些临床试验已经证明了AAV载体在治疗DMD上的安全性以及一定程度的有效性。但需要注意的是，AAV病毒并不能够整合到基因组当中去，随着时间的延长，病人体内的dystrophin含量会逐步降低。此外，约50%的患者体内会产生针对AAV载体的抗体，这样的患者在再次使用AAV载体进行治疗的时候难度将会加大。2. 外显子跳跃外显子跳跃指的是利用反义RNA或单链DNA与突变的DMD基因转录出来的pre-mRNA结合，使其无法被剪切从而被“跳过”（如下图所示）。目前已经有2款药物获批上市：即Sarepta Therapeutics的Eteplirsen（商品名Exondys 51，于2016年获FDA加速批准上市）与相同公司的Golodirsen（商品名为Vyondys 53，经美国FDA加速批准于2019年12月上市），另有针对45/51/53号外显子的外显子跳跃药物在研发中。但同时也需要看到，Eteplirsen上市的依据201/202试验只有12个病人，完全无法得出具有统计性差异的结论，这款药物的上市也引起了巨大的争议：FDA仅凭相对正常值增加0.28%的肌营养蛋白这一微弱优势的替代终点批准该药物，可以说是在患者及家属对DMD药物迫切需求的压力下降低了科学性标准（感性战胜了理性？）。 此外，外显子跳跃疗法在临床治疗中也面临着一些技术难题。例如，采用怎样的技术手段能使外显子跳跃技术所采用的反义寡核苷酸递送效率更高？针对这个问题，目前采用的主要是修饰、肽段偶联等方法。此外，如何增加反义寡核苷酸的半衰期也是一项巨大的挑战，目前来讲，外显子跳跃药物需要每隔两周进行一次肌肉注射。3. 基因编辑如下图所示，基因编辑是指采用基因编辑技术将突变的外显子完整地切掉，从而直接转录后续的外显子，因为突变的外显子已经被删除，后续的外显子能够以正确的读码框进行翻译。目前最热门的基因编辑技术当属CRISPR/Cas9，它在时效、成本、编辑效率等方面表现突出，综合性能超过TALEN、ZFN等技术。虽然基因编辑技术是对DNA进行永久的改变，但由于被切除某个外显子的dystrophin蛋白仍然以完全具备野生型dystrophin蛋白的功能，因此即使肌肉细胞某个细胞核的基因被成功修改，该细胞核在未来的一段时间里仍然会发生损伤和凋亡。目前一般采用AAV载体运送Cas9酶和sgRNA至肌肉细胞内部。AAV载体的大规模生产仍然是这项技术的瓶颈之一，因此涉及AAV载体的技术费用也一直居高不下。但随着技术的不断发展，AAV载体技术成本的降低应该是可以期待的。4. 终止密码子通读虽然大部分造成DMD翻译提前终止突变类型为移码突变，但仍有约13%的DMD患者其基因突变为生成一个终止密码子的错义突变。错义突变并不改变DMD基因的读码框，对于这样的突变可以采用终止密码子通读（stop codon readthrough）疗法来使终止密码子变得“可读”。比如，有一些化合物能够和转录蛋白复合物结合，使其在读至某个终止密码子的时候并不发生终止，而是使转录继续进行下去。2014年5月，欧洲药品管理局（EMA）向PTC Therepeutics公司的药物ataluren颁发了有条件上市许可，该药物也是针对杜氏型肌营养不良症的首种有效药物。临床实验结果表明ataluren会明显减缓病情恶化速度。5. 干细胞疗法研究表明，干细胞移植在组织损伤修复等方面具有重要功能。使用干细胞治疗DMD需要从正常人体内分离出肌肉干细胞体外培养，然后注射到DMD患者的肌肉组织内。目前干细胞疗法最大的局限性在于干细胞移植效率太低。由于肌肉组织非常致密，异体移植的肌肉干细胞很难在患者体内存活，即使部分干细胞得以在患者体内存活，也只限于在注射位点附近生长，难以扩展到其他部位。除了肌肉干细胞之外，目前也有研究对成肌细胞、诱导多能干细胞（iPSCs）进行尝试。除了干细胞的存活能力和组织分布之外，DMD患者体内由于肌肉退化而处在慢性炎症的环境当中，而这种慢性炎症环境是否能够诱导干细胞向正确的方向分化还很难说。总结虽然已经有三种DMD药物获批上市，但总体上而言，DMD患者的处境仍然不容乐观。需要注意的是，目前已经上市和临床试验中的疗法只能够在一定程度上对DMD患者的肌肉萎缩情况进行缓解而非彻底根治，DMD领域仍然缺乏一款真正有效的药物。相信随着基因编辑技术与干细胞领域技术的进步，这一领域的疗法能够不断取得突破，尚处黑暗之中的DMD患者最终将会迎来黎明的曙光。参考文献Verhaart I E C, Aartsma-Rus A. Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy[J]. Nature Reviews Neurology, 2019, 15(7): 373-386.Werneck L C, Lorenzoni P J, Ducci R D P, et al. Duchenne muscular dystrophy: an historical treatment review[J]. Arquivos de neuro-psiquiatria, 2019, 77(8): 579-589.Jones D. Duchenne muscular dystrophy awaits gene therapy[J]. Nature biotechnology, 2019, 37(4): 335.Aartsma-Rus A, Ginjaar I B, Bushby K. The importance of genetic diagnosis for Duchenne muscular dystrophy[J]. Journal of medical genetics, 2016, 53(3): 145-151.}