本发明涉及基因敲除技术领域，尤其涉及一种利用crispr/cas9和cre-loxp系统构建的基因条件性敲除方法。

基因敲除技术是转基因动物构建中不可替代的组成部分。基因的表达具有时间和空间特异性，对体内关键基因进行敲除和替换等方式的基因编辑，往往导致动物胚胎死亡，阻碍基因的功能研究。条件性敲除方法的出现解决了上述问题，可以使目标基因的表达或缺失发生在动物发育的某一特定阶段或某一特定组织器官。条件性基因敲除技术作为新一代基因敲除技术，能够实现基因在空间和时间上的特异性表达，相对于组成型基因敲除有着明显的优势和广泛的应用前景。

传统的基因条件性敲除方法利用在目的敲除序列的两端插入位点特异性的重组酶识别位点，在重组酶的诱导下，通过两侧序列的缺失或倒置获得无效等位基因。因此，重组酶介导的条件性敲除成为研究特异性细胞类型和不同发育阶段中的基因功能极有价值的工具。但是这种条件性敲除技术在构建载体时需要消耗大量的时间和精力，不仅要利用bac克隆和基因重组等技术，基因型鉴定还需要长片段pcr、northern等方法，而且基因敲除效率也相对较低。

目前主要基于cre-loxp系统对基因进行条件性敲除，该系统包含cre重组酶和loxp序列。cre重组酶是大肠杆菌噬菌体p1中cre基因编码表达的由343个氨基酸构成的蛋白质，它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别细胞内基因或dna上的loxp序列，并根据loxp序列的位置和序列之间的方向介导dna序列发生特异性重组反应。cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用，因此cre重组酶的编码基因可以置于组织、器官特异的启动子的调控之下，诱导重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下表达，进而发挥作用。loxp是一段长34bp的dna序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。任何序列的dna，当其位于两个loxp位点之间的时候，在cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxp位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxp位点的方向相反)。

基于cre/loxp系统的基因条件性敲除技术需要两步：(1)在细胞的基因组中引入loxp序列，靶向载体的构建和对同源重组细胞的筛选来实现。(2)通过cre介导的重组来实现靶基因编辑。cre/loxp系统既可以在细胞水平上用cre重组酶识别loxp位点将靶基因切除，同时可以在个体水平上将含有loxp的转基因动物与cre转基因动物杂交，得到目的基因条件性敲除得动物，或者将cre基因置于可诱导的启动子控制下，通过诱导表达cre重组酶而将loxp位点之间的基因切除(诱导性基因敲除)，实现目的基因在特定时间或者特定组织中的敲除。cre/loxp系统构建的基因条件性敲除细胞或转基因动物，避免了某些基因完全敲除所导致的胚胎致死效应，现已广泛应用于免疫学、动物疾病模型构建及疾病相关基因功能鉴定等领域。

虽然cre/loxp系统在理论上已十分成熟但在实际应用中仍存在不足和限制：

(1)利用cre/loxp技术进行基因的条件性敲除首先要构建打靶载体，扩增长度约为4-5kb的同源臂，同时还需要bac克隆和基因重组技术。将loxp片段靶向导入细胞基因组，这一步发生同源重组的概率极低，并且需要通过长片段pcr和northern杂交等复杂的筛选工作，才能鉴定靶向成功的细胞。因此，该步骤需要大量的时间和精力，是利用cre/loxp系统进行基因条件性敲除的限速步骤。

(2)cre酶作为一种外源性重组酶在哺乳动物中表达后具有一定的潜在毒性，会引起细胞增殖异常、dna错配和染色体缺失等问题。

(3)cre/loxp系统切割效率在70％左右，目的器官或组织中仍有少量敲除基因未被敲除，这些未敲除的目的基因会在特定器官或组织内微量表达。

crispr/cas9技术是一种新型的基因编辑技术，是动物遗传改造和基因功能研究的重要工具。crispr/cas9技术主要通过核酸酶cas9起作用，cas9在化学合成或载体表达的sgrna(向导rna)引导下能够对靶基因进行切割，造成靶基因双链dna断裂。dna损伤可以启动细胞内的修复机制，一种是低保真性的非同源末端连接途径(nhej，non-homologousendjoining)，此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入，从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。第二种dna断裂修复途径为同源介导的修复(hr，homology-directedrepair)，这种基于同源重组的修复机制保真性高，但发生概率很低，在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对dna的切割后可以大幅提高同源重组效率。crispr-cas9系统的rna-dna识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具，该体系另一个重要的优势是cas9蛋白可在多个不同的grna的引导下同时靶向多个基因组位点，crispr-cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括猴子、猪、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。

总之，传统的重组酶介导的基因条件性敲除，其采用自然条件下基因重组，重组效率低。传统的cre/loxp系统将loxp位点插入到基因组中，同源臂长，发生同源重组效率低，极大影响了基因条件性敲除的效率。

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于crispr/cas9系统构建的基因条件性敲除方法，本发明简化并且加速了基因条件性敲除的过程，极大的提高了传统基因条件性敲除的效率和便利性。

本发明提供了一种利用crispr/cas9系统构建的基因条件性敲除方法，包括以下步骤：

(1)构建目的基因左侧打靶质粒和右侧打靶质粒：

在敲除区域左侧和右侧分别选取loxp-抗生素-loxp序列待插入位点和frt-抗生素-frt-loxp序列待插入位点；然后在待插入位点的上下游各选取500bp-1kb的左右同源臂，通过pcr方法扩增左右同源臂并纯化，利用限制性内切酶酶切、连接和转化等步骤，将左臂和右臂片段分别插入到loxp-抗生素-loxp或frt-抗生素-frt-loxp打靶质粒中，得到左侧打靶质粒和右侧打靶质粒；

(3)将cas9质粒、第一grna表达质粒和左侧打靶质粒同时转入到目的细胞中，转染48-72小时后用抗生素进行筛选，处理5-9天后，通过pcr基因型鉴定的方法，筛选出双等位基因导入loxp-抗生素-loxp片段的目的细胞；

(4)用4-羟基他莫昔芬(4-oht)处理双等位基因导入loxp-抗生素-loxp片段的目的细胞3-6天，以诱导cre-loxp介导的同源重组，从而使loxp-抗生素-loxp片段仅剩余loxp位点，得到出loxp双等位基因导入的目的细胞；

(5)将cas9质粒、第二grna表达质粒和右侧打靶质粒同时转入步骤(4)得到的loxp双等位基因导入的目的细胞中，转染24-72小时后用抗生素进行细胞选择，选择5-9天后，筛选出插入frt-抗生素-frt-loxp片段双等位基因导入的目的细胞；

(6)用阿霉素(doxycycline)处理步骤(5)得到的细胞3-6天，以诱导flp-frt介导的同源重组，筛选出待敲除区域右侧frt-loxp双等位基因靶向导入的目的细胞，待敲除区域两侧被loxp环绕，简称为floxed细胞；

(7)用4-羟基他莫昔芬处理步骤(6)处理后的细胞3-6天，诱导cre-loxp介导的同源重组，以敲除目的基因。

进一步地，在步骤(1)中，敲除区域为目的基因的调控区域(启动子、增强子等)，非编码rna或目的基因上的基因间隔区等dna片段。

进一步地，在步骤(1)中，左臂利用kpnⅰ和ecorⅰ限制性内切酶进行酶切，右臂用bamhⅰ和sacⅱ进行酶切。

进一步地，在步骤(1)中，采用axypreppcr纯化试剂盒、omega胶回收试剂盒等dna纯化试剂盒进行纯化。

进一步地，在步骤(3)中，目的细胞为哺乳动物细胞，如小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞、hela、293t等细胞。

进一步地，在步骤(3)-(7)中，筛选方法为挑取单个菌落并在96孔板中扩增，然后进行基因型鉴定。

进一步地，在步骤(1)、(3)、(4)、(5)和步骤(6)中，抗生素为新霉素、潮霉素或嘌呤霉素。步骤(3)中的抗生素与loxp-抗生素-loxp序列中的抗生素一致，步骤(5)中的抗生素和frt-抗生素-frt-loxp中的抗生素一致。

进一步地，潮霉素的浓度为50-1000μg/ml。

进一步地，嘌呤霉素的浓度为1-10μg/ml。

进一步地，在步骤(4)和步骤(7)中，4-羟基他莫昔芬的浓度为0.8μm-1.2μm。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明利用crispr/cas9技术介导同源重组，将重组酶识别位点插入到基因组区域，提高了基因重组效率，节省了时间和人力成本。

本发明解决了传统的cre/loxp系统在基因敲出过程中同源臂长，发生同源重组效率低，基因条件性敲除效率低下的缺点。通过crispr/cas9介导的同源定向修复，只需要设计较短的同源臂便可以在目的基因组区域周围插入loxp位点元件，通过简单的方法便可以产生几个基因的条件性敲除克隆。

本发明解决了传统条件性敲除在人胚胎干细胞等细胞中重组效率低下的问题。crispr/cas9技术在人胚胎干细胞中能介导较高的同源重组效率，因此极大的提高了loxp位点靶向导入敲除区域的成功率，为研究在人胚胎干细胞中关键基因的调控功能呢提供了便利条件。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

图1是本发明利用crispr/cas9系统构建的基因条件性敲除方法的流程示意图(抗生素使用新霉素)；

图2是本发明实施例1和2所用的打靶载体lnl和fnfl的图谱；

图3是本发明实施例1中eed基因敲除流程图；

图4是本发明实施例1中eed敲除克隆的基因型鉴定结果；

图5是本发明实施例1中eed敲除克隆的测序结果；

图6是本发明实施例2中srcap敲除克隆测序结果。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明以下实施例中，loxp-抗生素-loxp序列中和frt-抗生素-frt-loxp中的抗生素均选择新霉素，因此分别简称为lnl和fnfl。

本实施例提供了一种选择性敲除小鼠胚胎干细胞(目的细胞)中eed基因(目的基因)的方法，具体包括以下步骤：

(1)构建eed基因左侧打靶质粒：在eed基因2号外显子上游适当位置选取lnl序列待插入位点，该位点上下游各选取500bp至1kb范围的左右同源臂，使用高保真phusiondna聚合酶(m0530s，neb)扩增lnl序列待插入位点左右同源臂，然后用axypreppcr纯化试剂盒纯化，左臂利用kpnⅰ和ecorⅰ限制性内切酶消化pcr产物，右臂用bamhⅰ和sacⅱ消化，插入到含有lnl序列的质粒中，构建目的基因左侧打靶质粒。

(3)eed左侧打靶质粒整合基因组中：将cas9质粒，步骤(2)构建的grna的表达质粒和目的基因左侧打靶质粒同时转入到目的细胞中，转染后48小时用浓度为250μg/mlg418进行细胞选择。在g418选择6天后，挑取单个菌落并在96孔板中扩增用于随后的基因分型，选择成功插入了目的基因左侧打靶质粒的细胞。胚胎干细胞培养条件为：37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养

(4)cre酶介导的细胞同源重组：用浓度为1μm的4-oht(h7904，sigma)处理成功插入了目的基因左侧打靶质粒的细胞5天，诱导cre-loxp介导的同源重组，挑取单独的菌落进行pcr基因分型，确认目的基因左侧成功插入loxp位点。

(5)构建eed右侧打靶质粒：在目的基因右侧适当位置选取fnfl序列待插入位点，该位点上下游各选取500bp至1kb范围的左右同源臂，使用高保真phusiondna聚合酶(m0530s，neb)扩增fnfl序列待插入位点左右同源臂，然后用axypreppcr纯化试剂盒纯化，左臂利用kpnⅰ和ecorⅰ限制性内切酶消化pcr产物，右臂用bamhⅰ和sacⅱ消化，插入到含有fnfl序列的质粒中，构建eed右侧打靶质粒。

(7)eed右侧打靶质粒整合基因组中：将cas9质粒，步骤(6)构建的grna的表达质粒和eed右侧打靶质粒同时转入到目的基因左侧成功插入loxp位点的目的细胞中，转染后48小时用浓度为250μg/ml的g418进行细胞选择。在g418选择6天后，挑取单个菌落并在96孔板中扩增用于随后的基因分型，选择成功插入了目的基因左侧和右侧打靶质粒的细胞。

(8)flip酶介导的细胞同源重组：用强力霉素(doxycycline)处理步骤(7)中成功插入了目的基因左侧和右侧打靶质粒的细胞5天，诱导flp-frt介导的同源重组，挑取单独的菌落进行pcr基因型鉴定，确认eed基因左侧和右侧均成功插入loxp位点。

(9)cre酶介导的细胞同源重组：用浓度为1μm的4-oht处理目的基因左右侧成功插入loxp位点的细胞5天，诱导cre-loxp介导的同源重组，挑取单独的菌落进行pcr基因分型，成功敲除了小鼠胚胎干细胞中的eed基因。

本实施例提供了一种条件性敲除小鼠胚胎干细胞(目的细胞)中srcap基因(目的基因)的方法，具体包括以下步骤：

(1)构建srcap基因敲除区域左侧lnl打靶质粒：选取srcap基因的5号-8号外显子作为目的敲除区域，以5号外显子上游某位置作为lnl插入位点。首先以小鼠基因组为模板，利用pusion高保真dna聚合酶在插入位点的上下游扩增出500bp至1kb大小的左右同源臂，而后用axypreppcr纯化试剂盒纯化；接着用kpnⅰ和ecorⅰ限制性内切酶消化左臂pcr纯化产物，右臂则用bamhⅰ和sacⅱ消化，之后将两个同源臂依次连接到lnl载体上得到靶向目的敲除区域左侧的lnl质粒。

(3)目的敲除区域左侧打靶质粒lnl盒整合至基因组：将cas9质粒，步骤(2)构建的grna的表达质粒和lnl靶向质粒同时电转到目的细胞中，转染48小时后用浓度为250μg/ml的g418进行筛选，将胚胎干细胞于37℃且含有5％二氧化碳的培养箱中培养，并保持一定湿度。g418选择6天后，挑取单个菌落并在96孔板中扩增用于随后的基因型鉴定，并获得基因组中双等位基因靶向导入lnl序列的细胞。

(4)cre酶介导的细胞同源重组：用浓度为1μm的4-oht(sigma，h7904)处理步骤(3)中筛选获得的细胞5天，让其于37℃且含有5％二氧化碳的培养箱中培养，并保持一定湿度，以诱导cre-loxp介导的同源重组，挑取单菌落进行pcr基因型鉴定，确认细胞基因组上loxp双等位基因插入。

(5)抗neomycin捕获盒的药耐性缺失：将步骤(4)获得的lnl捕获盒缺失的细胞扩增两份，一份加入浓度为250μg/ml的g418处理3天，另一份不作加药处理。观察到加药处理的细胞死亡，确认细胞中的lnl捕获盒缺失。不加药的细胞用作后续实验。

(6)构建目的敲除区域右侧fnfl打靶质粒：在目的基因srcap的8号外显子下游位置选取fnfl序列待插入位点。首先以小鼠基因组为模板，利用pusion高保真dna聚合酶(m0530s，neb)在插入位点的上下游扩增出500bp至1kb大小的左右同源臂，而后用axypreppcr纯化试剂盒纯化；接着利用kpnⅰ和ecorⅰ限制性内切酶消化左臂pcr纯化产物，右臂则用bamhⅰ和sacⅱ消化，之后将两个同源臂依次连接到fnfl载体上得到靶向srcap目的敲除区域右侧的fnfl质粒。

(8)目的敲除区域右侧打靶质粒fnfl整合至基因组：将cas9质粒，步骤(7)构建的grna表达质粒和步骤(6)构建的fnfl打靶质粒同时转入到待敲除区域左侧成功插入loxp位点的目的细胞中，转染后48小时后用浓度为250μg/ml的g418进行细胞筛选。在g418选择6天后，挑取单个菌落并在96孔板中扩增用于随后的基因型鉴定，选择基因组上成功插入了右侧打靶质粒fnfl序列的细胞。

(9)flip酶介导的细胞同源重组：用强力霉素(doxycycline)处理步骤(8)中目的敲除区域右侧成功插入fnfl序列的细胞5天，诱导flp-frt介导的同源重组，挑取单独的菌落进行pcr基因型鉴定，确认fnfl捕获盒缺失剩一个frt位点和一个loxp位点。至此，目的敲除区域(srcap基因5号外显子)基因组上下游分别含有一个loxp位点。

(10)cre酶介导的细胞同源重组：用浓度为1μm的4-oht处理步骤(9)中获得的目的敲除区域左右侧各有一个loxp位点的细胞5天，诱导cre-loxp介导的同源重组，挑取单独的菌落进行pcr基因型鉴定，确认成功敲除了小鼠胚胎干细胞中srcap基因的5号-8号外显子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。