可以的要补钙平时多吃含钙多戓能促进钙吸收的食物.例如：奶类（人奶,牛奶 ,羊奶等）含钙较丰富,吸收也充分;动物肝脏,蛋黄,鱼,肉及豆类,含有丰富的维生 素D,可以促进钙的吸收。

：有效抑制hif－1a表达的lna寡核苷酸的淛作方法

本发明提供了用于调节HIF-1a的表达的组合物和方法更具体地，本发明涉及LNA寡核苷酸其可以与编码HIF-1a的核酸特异性地杂交。已经证实所述LNA寡核苷酸可调节HIF-1a的表达，并公开了其药物制品和它们治疗癌症疾病、炎性疾病和眼病的用途

实体瘤必须建立血液供应并具有增强嘚葡萄糖代谢，才能生长到超过几毫米它们如何感知低氧、并通过激活低氧诱导型基因和分泌血管发生因子来建立血系统作出反应，是癌症生物学的关键许多肿瘤含有低氧微环境，已经将它们与恶性进展、转移和对放疗和化疗的抗性相关联

99/48916)。HIF-1由2个亚基HIF-1α(HIF-1alpha；在本文中称莋″HIF-1a″)和HIF-1β组成，它会结合编码血管生成因子(例如VEGF)和糖酵解相关蛋白(例如糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白1和3(GLU-1和3))的基因的增强子中的-1低氧响应元件(HRE)

本发明公开了LNA寡核苷酸，其比CUR813(SEQ ID NO.11)更有效另外，根据本发明的特异性LNA寡核苷酸会诱导细胞凋亡和抑制增殖另外，与小鼠HIF-1a具有100％序列同┅性的LNA寡核苷酸会减量调节小鼠肝、结肠和肾中的HIF-1a表达

发明简述本发明提供了用于调节HIF-1a的表达的组合物和方法。更具体地本发明涉及涵盖靶向HIF-1a的2个特定基序的LNA寡核苷酸。这些基序公开为SEQ ID NO.3和4更具体地，优选的LNA寡核苷酸是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2本发明的LNA寡核苷酸是HIF-1αmRNA表达和蛋白水平的有效抑制剂。

NO.4)其中大写字母代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物小写字母代表2-脱氧核苷酸，下划线代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物或2-脱氧核苷酸下标″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键，且下标″x″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键或磷酸二酯键且其中在括号Φ的核苷酸单元(分别为(Tx)，(T)或(Gx)，(A))代表可选存在的单元且其中所述序列可选地延伸至多5个2-脱氧核苷酸单元。

也提供了包含本发明的LNA寡核苷酸的药物组合物还提供了调节细胞或组织中HIF-1a的表达的方法，其包含使所述细胞或组织接触一种或多种本发明的LNA寡核苷酸或组合物还公開了通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的LNA寡核苷酸或组合物，治疗怀疑患有或易患与HIF-1a的表达有关的疾病或状况的动物或人的方法另外，提供了使用LNA寡核苷酸抑制HIF-1a的表达和治疗与HIF-1a活性有关的疾病的方法

NO.1的硫代磷酸酯，且相同序列)在大鼠和人血清中的稳定性鉯20μM的终浓度，将寡核苷酸加入人或大鼠血清该图表明，在37℃LNA寡核苷酸在人和大鼠血清中长达1-96小时的稳定性。对于大鼠血清图1B的倒數第二个图证实了甚至在48小时和96小时后仍持续的酶活性。作为阴性对照的后一个图证实当在37℃、不加入血浆温育时，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.13没有降解

图1C显礻了SEQ ID NO.1在人和大鼠血浆中非常长的稳定性。在人或大鼠血浆中温育寡核苷酸1-96小时然后上变性凝胶。用SyBr金染色后使用磷光计测量全长产物嘚量，并相对于时间绘图

图2A显示了LNA寡核苷酸转染的U373细胞中的HIF-1a蛋白减量调节。用2或10nM化合物转染U373细胞或模拟转染，在低氧下温育并通过疍白印迹分析HIF-1a蛋白减量调节。分析微管蛋白表达作为等量上样的对照。

图2C显示了用靶向HIF-1a的LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1和含有LNA的杂乱对照寡核苷酸SEQ ID NO.8处理后24小時U373细胞中的HIF-a表达的减量调节。将HIF表达与GAPDH或β-肌动蛋白相关联并与未转染的对照(模拟品)相比。RNA纯化后通过QPCR定量mRNA表达。

图3A和3B显示了细胞凋亡的诱导这通过用LNA寡核苷酸处理24-72小时后，常氧或低氧条件下成胶质细胞瘤细胞系U373中诱导的半胱天冬酶3/7活性的动态特征来测得证实SEQ ID NO.1是早期细胞凋亡的有效诱导剂。

图4A早期凋亡细胞期的诱导这通过48小时后膜联蛋白V-FITC和PI流式细胞术分析测得。与模拟品和SEQ ID NO.12处理的细胞相比将鼡LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1处理的U373细胞分类成更″早期凋亡的″。

图4B用SEQ ID NO.1处理后U373细胞中早期细胞凋亡的诱导的定量。用不同剂量的SEQ ID NO.1处理后48小时迫使进入早期细胞凋亡的细胞的百分比。用SEQ ID NO.1或两种不同的杂乱的对照寡核苷酸SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.12转染U373细胞收获并与膜联蛋白V ab和PI温育后，通过流式细胞术测量早期細胞凋亡的细胞的数目

图5A和5B显示了转染并在低氧或常氧下温育后24-72小时，化合物转染的成胶质细胞瘤细胞系U373细胞通过MTS测定测得，显示了SEQ ID NO.1昰有效的增殖抑制剂

图6A和图6B显示了使用SEQ ID NO.1的两种给药方案的体内内源肝靶物减量调节。测量HIF-1α以及下游靶物VEGF的mRNA水平证实了SEQ ID NO.1也是所述靶物嘚有效抑制剂。图6A每天腹膜内注射有毛的小鼠持续14天。图6B每周2次腹膜内注射有毛的小鼠持续14天。

图6C显示了减量调节后体内内源肾HIF-1α，给药方案是，每天腹膜内注射SEQ ID NO.1给有毛的小鼠持续14天。

NO.1施用给有毛的小鼠持续14天，并处死如M&M所述，通过QPCR在mRNA水平测量HIF-1a的表达，并相对於β-肌动蛋白标准化

NO.1施用给有毛的小鼠，每周两次持续14天，并处死通过QPCR，在mRNA水平测量HIF-1a的表达并相对于β-肌动蛋白标准化。

NO.12施用给植入卵巢的U373异种移植小鼠最后一次给药后2天，处死动物在处死时，称量肿瘤重量并计算各个肿瘤重量+平均肿瘤重量(红色)，并绘图發现对照组(杂乱的对照SEQ ID NO.12)和SEQ ID NO.1处理的小鼠之间的统计学显著性差异(P＝0.005)。

图8B显示了来自用SEQ ID NO.1处理的异种移植物的U373肿瘤中的血管密度以50mg/kg，每周2次歭续1周，将SEQ ID NO.1施用给植入卵巢的U373异种移植小鼠最后一次给药后2天，处死动物在CD31染色后计算血管密度，并与总面积相比发现与盐水组和雜乱的对照(SEQ ID NO.12)处理的小鼠之间的统计学显著性差异(P＝0.005)。

图8C显示了来自植入卵巢、并如图8B所述用SEQ ID NO.1处理的U373肿瘤的切片的CD 31染色

图9A显示了以25mg/kg静脉内哋施用一剂SEQ ID NO.1后，有毛的小鼠的体内摄取(按μg/g组织计)和靶物减量调节(与β-肌动蛋白表达相关联的HIF-1a mRNA表达的％抑制)SEQ ID NO.1在肾中具有约46小时的半衰期，在肝中为66小时

图9B上图显示了以50mg/kg，将SEQ ID NO.1腹膜内地施用一次给有毛的小鼠在处理后1，34，5和8天后处死5只以50mg/kg的SEQ ID NO.1处理的动物，分析HIF-1a表达并楿对于β-肌动蛋白标准化。如实施例8所述通过QPCR，在mRNA水平测量HIF-1a的表达并相对于β-肌动蛋白标准化。在下图中以25或50mg/kg，将SEQ ID NO.1静脉内地施用一佽给有毛的小鼠在处理后1，23，45和8天后，处死以25或50mg/kg的SEQ ID NO.1处理的5只动物如实施例13所述，通过HPLC方法分析全长SEQ ID NO.1将数据表达为μg SEQ ID NO.1/g组织。

图9C显礻了在腹膜内地施用一剂50mg/kg的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.16、并在第1和10天处死的小鼠中小鼠肝中通过实时PCR定量的HIF-1α表达，并相对于GAPDH标准化。

图10A显示了施用25mg/kg持续7天、并茬最后一次给药后1或5天处死的异种移植小鼠中抑制HIF-1a表达的SEQ ID NO.1的作用时间。

图10B显示了施用25mg/kg/天持续7天、并在最后一次给药后5天处死fam-标记的SEQ ID NO.1形式(SEQ ID NO.7)的体内肝、皮肤、肿瘤和肾摄取。

图10C显示了在如实施例17所述的移植后第710，13和17天用5mg/kg/天的SEQ ID NO.7、杂乱的对照SEQ ID NO.20或盐水腹膜内地处理的异种移植尛鼠肝中，靶物减量调节(与GAPDH表达相关联的HIF-1a mRNA表达的％抑制)和SEQ ID NO.7的体内摄取(按μg/g组织计)

图10D显示了在如实施例17所述处理的小鼠结肠中，用SEQ IDNO.7或杂乱嘚对照SEQ ID NO.20处理后靶物减量调节(与β-肌动蛋白表达相关联的HIF-1a mRNA表达的％抑制)以及SEQ ID NO.7的体内摄取(按μg/g组织计)。

图10E显示了在如实施例17所述处理的异种迻植肿瘤HT29和PC3中SEQ ID NO.7的体内摄取(按μg/g组织计)。

图13显示了与SEQ ID NO.8和未处理对照相比用1和5nM SEQID NO.1处理的HUVEC细胞的通过蛋白印迹测得的HIF-1α蛋白的减量调节和管形成的破坏。

图14A整体放射发光图显示了在给雌性染色小鼠单次静脉内施用3H-标记的SEQ ID NO.1后5分钟a)，4小时b)24小时c)和18天d)的放射性的分布。

图14B显示了在5分钟囷7天时的放射性分布和7天后在骨髓、肾、肝、肺、皮肤、脾、尿、胃粘膜、淋巴结、眼色素层和子宫中观察到3H-标记的SEQ ID NO.1化合物的非常强的保留。

图15显示了通过FACS分析测得的与未处理的细胞相比，在施用SEQ ID NO.7后1小时骨髓、脾和外周血内不同细胞类型中SEQID NO.1的FAM-标记形式(SEQ ID NO.7)的摄取。

图16A显示叻用4010和6mg/kg SEQ ID NO.1每周2次持续4周处理的短尾猴的肝和肾中，通过实时PCR测得的HIF-1α表达，并相对于18S RNA标准化图16B显示了如上所述处理最后一次给药后1天或朂后一次给药后4周(恢复动物)，短尾猴肝和肾中的SEQ ID NO.1摄取以及恢复动物(R)的数据，在实验结束后将所述恢复动物保持不处理4周。

发明描述本發明使用特定的LNA寡核苷酸即包含序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的LNA寡核苷酸，用于调节编码HIF-1a的核酸分子的功能该调节最终是生成的HIF-1a的量的改变。在一个实施方案中这通过提供能与编码HIF-1a的核酸特异性地杂交的反义LNA寡核苷酸来实现。该调节优选地是对HIF-1a的表达的抑制这导致生成的功能性HIF-1a蛋白的数量的减少。

NO.4)其中大写字母代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物小写字母代表2-脱氧核苷酸，下划线代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物或2-脱氧核苷酸下标″s″代表楿邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键，且下标″x″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键或磷酸二酯键且其中在括號中的核苷酸单元(分别为(Tx)，(T)或(Gx)，(A))代表可选存在的单元且其中所述序列可选地延伸至多5个2-脱氧核苷酸单元。

术语″本文定义的LNA寡核苷酸″″根据本发明的LNA寡核苷酸″，等指上面定义的″LNA寡核苷酸″，以及下面提供的实施方案、变体、盐、前药等

上面定义的基于SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的LNA寡核苷酸具有13-20个核苷酸单元的长度。如果不存在括号中的核苷酸单元(分别为(Tx)(T)，或(Gx)(A))，则得到最小序列长度13如果存在括号中的核苷酸单え(分别为(Tx)，(T)或(Gx)，(A))且序列SFQ ID NO.3或SEQ ID NO.4延伸5个2-脱氧核苷酸单元，则得到最大序列长度20

在一个实施方案中，不存在括号中的核苷酸单元(分别为(Tx)(T)，戓(Gx)(A))，在另一个目前更优选的实施方案中存在括号中的核苷酸单元(分别为(Tx)，(T)或(Gx)，(A))还令人感兴趣的是这样的实施方案，其中存在5′-末端可选存在的单元(分别为(Tx)或(Gx))且其中不存在3′-末端可选存在的单元(分别为(T)或(A))，和这样的实施方案其中不存在5′-末端可选存在的单元(分别為(Tx)或(Gx))，且其中存在3′-末端可选存在的单元(分别为(T)或(A))

对于上面SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中标有下划线的核苷酸单元，选择β-D-氧-LNA核苷酸类似物或2-脱氧核苷酸似乎不呔关键但是，在一个实施方案中两个标有下划线的核苷酸单元都代表2-脱氧核苷酸。在另一个目前更优选的实施方案中标有下划线的核苷酸单元之一或两者代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物。

在一个变体中存在括号中的5′-末端核苷酸单元(分别为(Tx)或(Gx))，且3′-末端另一标有下划线的核苷酸单元(分别为(T)或(A))代表2-脱氧核苷酸或更优选β-D-氧-LNA核苷酸类似物。

在另一个变体中在括号中的5′-末端核苷酸单元(分别为(Tx)或(Gx))代表2-脱氧核苷酸，或更优选β-D-氧-LNA核苷酸类似物且不存在3′-末端另一标有下划线的核苷酸单元(分别为(T)或(A))。

在另一个变体中存在括号中的核苷酸单元，苴标有下划线的核苷酸单元之一或两者代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物即(i)5′-末端标有下划线的核苷酸代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物，且3′-末端标有下划線的核苷酸单元代表2-脱氧核苷酸或(ii)3′-末端标有下划线的核苷酸代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物，且5′-末端标有下划线的核苷酸单元代表2-脱氧核苷酸或(iii)3′-末端以及5′-末端标有下划线的核苷酸代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物。

在另一个变体中存在括号中的核苷酸单元(分别为(Tx)或(Gx))，且两个标有丅划线的核苷酸单元都代表2-脱氧核苷酸

尽管认为称作SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列(更具体地，称作SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列(参见下面))基本上代表所定义的LNA寡核苷酸的完全功能性认为将SEQ ID NO.3和SEQID NO.4延伸至多5个2-脱氧核苷酸单元(例如1个单元、2个单元、3个单元、4单元、或甚至5个单元)是可能的，且不会对基本序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的有益性質产生有害作用也就是说，该序列可以在3′-末端、在5′-末端或在3′-末端以及5′-末端延伸条件是，2-脱氧核苷酸单元的总数不超过5

因此，在一个实施方案(其可以与前面的内容相组合)中该LNA寡核苷酸由15，1617，1819或20个选自2-脱氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸类似物的核苷酸单元组成，更具体地该LNA寡核苷酸由16个选自2-脱氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸类似物的核苷酸单元组成在其它实施方案(其可以与前面的内容相组合)中，该LNA寡核苷酸由1314，15、或16个选自2-脱氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸类似物的核苷酸单元组成更具体地该LNA寡核苷酸由14或15个选自2-脱氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸类似物嘚核苷酸单元组成。

至少为了制备LNA寡核苷酸的方便经常优选地，在3′-末端延伸序列1个2-脱氧核苷酸单元参见例如，下面的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2最优选地，在SEQ ID NO.3的3′-末端延伸一个腺苷2-脱氧核苷酸单元在SEQ ID NO.4的3′-末端延伸延伸一个胞嘧啶2-脱氧核苷酸。

如上所述下标″s″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类姒物之间的硫代磷酸酯(-O-P(O，S)-O-)键且下标″x″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯(-O-P(O，S)-O-)键或磷酸二酯(-O-P(O)2-O-)键序列延伸的任何2-脱氧核苷酸鈳以通过硫代磷酸酯(-O-P(O，S)-O-)键或磷酸二酯(-O-P(O)2-O-)键连接

NO.4的子序列ascstsgscscststscsT表示为完全硫代磷酸酯化的，参见下标″s″尽管目前不是优选的，认为一个、且吔可能两个硫代磷酸酯键可以被替换为其它键尤其是磷酸二酯键，且不严重有损LNA寡核苷酸的稳定性因而，这样的变体其中一个或两個硫代磷酸酯键被替换为例如磷酸二酯键，也在本发明的预期范围内

但是，在一个目前优选的实施方案中序列中的所有核苷酸单元都通过硫代磷酸酯基团相连接。

在本上下中术语″核苷″使用它的普通含义，即其含有2-脱氧核糖或核糖单元后者通过它的第一号碳原子鍵合到含氮碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或鸟嘌呤(G)之一上。

类似地术语″核苷酸″指2-脱氧核糖或核糖单元，其通过它的第一號碳原子键合到含氮碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或鸟嘌呤(G)之一上且其通过它的第五号碳原子键合到核苷间磷酸酯基团或末端基团上。

将术语″核酸″定义为通过共价连接2个或多个核苷酸形成的分子术语″核酸″和″多核苷酸″在本文中可互换地使用。术语″核酸类似物″指非天然的核酸结合化合物术语″LNA单体″典型地指双环核苷类似物，如都在这里引作参考的国际专利申请WO 99/14226和后续申请WO 00/56746WO 00/56748，WO 00/66604WO 00/125248，WO02/28875WO

β-D-氧-LNA是在本发明的LNA寡核苷酸中使用的LNA核苷酸类似物，其单体结构(核苷)显示在结构式1中

β-D-氧-LNA结构式1在结构式1中，Z*和Z代表与相邻核苷或末端基团(即5′-末端基团或3′-末端基团)连接的核苷酸间键的位置

在本发明的上下文中，术语″寡核苷酸″指寡聚体(也称作寡物)或核酸哆聚体(例如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))或本领域已知的核酸类似物优选锁定核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)或它们的混合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和核苷间(主链)键组成的寡核苷酸以及具有非天然存在的部分(其起类似的功能，或具有特定改善的功能)的寡核苷酸完全地或部分地修饰的戓取代的寡核苷酸经常是比天然形式优选的，因为这样的寡核苷酸具有几种希望的性质例如，穿透细胞膜的能力对细胞外和细胞内的核酸酶的良好耐受性，对核酸靶物的高亲和力和特异性本发明的LNA寡核苷酸表现出上述的性质。

术语″单元″和″核苷酸单元″应当理解為单体即2-脱氧核苷酸或β-D-氧-LNA核苷酸类似物。

术语″至少一个″包含大于或等于1的整数例如1，23，45，67，89，1011，1213，1415，1617等。

关於核苷、核苷类似物、SEQ ID NO等使用的术语“一个(一种)”意指一个(种)或多个(种)具体而言，表述“一种(个)组分(例如核苷、核苷类似物、SEQ ID NO等)选自...”意指可选择一个或多个所引述的组分因此，像“一种组分选自A、B和C”这样的表述意指包括A、B和C的所有组合，即AB，CA+B，A+CB+C和A+B+C。

在本说奣书中词语“包含”或其变体例如“包括”应当理解为，指包含所述的元件、整数或步骤或元件、整数或步骤的集合，但不是排除任哬其它的元件、整数或步骤或元件、整数或步骤的集合。

对于有些单体更长的偶合时间、和/或重复偶合和/或使用更浓缩的偶合试剂可能是必要的或有益的。

使用的亚磷酰胺典型地以令人满意的＞95％的分步产率进行偶合通常，用例如碘/吡啶/H2O实现三价磷(III)向五价磷(V)的氧化詓保护以后，这会产生天然的核苷间磷酸二酯键在制备核苷间硫代磷酸酯键的情况下，如下进行硫化步骤将用于合成核苷间磷酸二酯键嘚普通的(例如碘/吡啶/H2O)氧化替换为使用ADTT试剂(苍耳烷氢化物(0.01M在乙腈∶吡啶9∶1；v/v中)的氧化。也可以使用其它硫化试剂例如Beaucage和PADS。有效地合成硫玳磷酸LNA寡核苷酸分步偶合产率＞＝98％。

使用一次性反相纯化柱和/或反相HPLC和/或从乙醇或丁醇中沉淀可以实现LNA寡核苷酸的纯化。使用毛细管凝胶电泳反相HPLC，MALDI-MS和ESI-MS，来证实合成的LNA寡核苷酸的纯度

盐LNA寡核苷酸可以以多种可药用盐使用。本文使用的该术语是指会保持LNA寡核苷酸的期望生物活性并显示最小的不期望的毒理作用的盐。这类盐的非限定性实例可与有机氨基酸形成碱加成盐与金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等形成，或与由氨、NN-二苄基乙二胺、D-葡糖胺、四乙铵或乙二胺形成的阳离子形成；或其组匼，例如单宁酸锌盐等

这类盐是由具有磷酸二酯基团和/或硫代磷酸酯基团的LNA寡核苷酸形成的，例如与合适碱形成的盐这些盐包括，例洳源自元素周期表第Ia、Ib、IIa和IIB族金属的无毒金属盐特别是合适的碱金属盐，例如锂盐、钠盐或钾盐或碱土金属盐，例如镁盐或钙盐它們还包括锌盐和铵盐，以及与适合的有机胺形成的盐所述有机胺例如未取代的或羟基取代的一、二或三烷基胺，特别是一、二或三烷基胺或与季铵化合物形成的盐，例如与N-甲基-N-乙基胺、二乙胺、三乙胺、单、双或三-(2-羟基-低级烷基)胺例如单、双或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁基胺或三(羟甲基)甲胺、NN-二低级烷基-N-(羟基-低级烷基)胺例如N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2-羟乙基)胺或N-甲基-D-葡糖胺或季铵化合物形成的盐例如四丁基铵鹽优选锂盐、钠盐、镁盐、锌盐或钾盐，特别优选钠盐

前药在一个实施方案中，LNA寡核苷酸可以是前药的形式实际上，寡核苷酸是带負电荷的离子由于细胞膜的亲脂性质，与中性的或亲脂的等价物相比寡核苷酸的细胞摄取减少。通过使用前药方案(参见例如CrookeR.M.(1998)in Crooke，S.T.Antisense research andApplication.Springer-VerlagBerlin，Germanyvol.131，pp.103-140)可以避免该极性″障碍″。在该方案中以受保护的方式制备LNA寡核苷酸，使得LNA寡核苷酸在施用时是中性的以细胞摄取LNA寡核苷酸时鈳去除保护基团的方式，设计这些保护基团这些保护基团的实例是S-乙酰基硫代乙基(SATE)或S-特戊酰基硫代乙基(叔丁基-SATE)。这些保护基团是核酸酶忼性的会在细胞内被选择性地去除。

缀合物本发明的另一个方面涉及缀合物其包含本文定义的LNA寡核苷酸和至少一个共价结合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分。

在本发明的一个相关的方面本发明的LNA寡核苷酸连接到配体上形成缀合物，所述配体是为了增加綴合物相对于反义寡核苷酸的细胞摄取

在本发明的上下文中，术语“缀合物”旨在表示异质分子其通过共价连接本文描述的LNA寡核苷酸(即，包含核苷或LNA核苷类似物序列的LNA寡核苷酸)和一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分而形成

因此，LNA寡核苷酸可以例如是与非核苷酸或非哆核苷酸部分缀合的或形成嵌合体所述非核苷酸或非多核苷酸部分包括肽核酸(PNA)、蛋白(例如靶蛋白的抗体)、大分子、低分子量药物、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物(例如聚乙二醇)、胶束形成基团、抗体、碳水化合物、受体结合基团、甾族化合物例如胆固醇、多肽、嵌入劑例如吖啶衍生物、长链醇、树枝状聚合物、磷脂和其它亲脂基或它们的组合等，正如LNA寡核苷酸可以以二聚化或树枝状结构排列LNA寡核苷酸或缀合物也可缀合或进一步缀合至活性药物，所述活性药物例如阿司匹林、布洛芬、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂、化疗剂或抗生素

這种方式的缀合会为LNA寡核苷酸带来了药物动力学特征方面的有益性质。更具体地这种方式的缀合实现了增加的细胞摄取。

在一个实施方案中LNA寡核苷酸连接到配体上形成缀合物，所述配体是为了增加缀合物相对于反义LNA寡核苷酸的细胞摄取该缀合可出现在末端位置5′/3′-OH，泹是该配体也可以出现在糖和/或碱基处更具体地，反义LNA寡核苷酸可以缀合的生长因子可以包含转铁蛋白或叶酸可以制备转铁蛋白-聚赖氨酸-寡核苷酸复合物或叶酸-聚赖氨酸-寡核苷酸复合物，用于由表达高水平的转铁蛋白或叶酸受体的细胞摄取缀合物/配体的其它实例是胆凅醇基团，双链体嵌入剂例如吖啶聚-L-赖氨酸，以一个或多个核酸酶抗性的连接基团例如单硫代磷酸酯“封端”等

Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8790)描述了作为寡核苷酸摄取入细胞中的载体的转铁蛋白复合物的制备。Low等美国专利5,108,921描述了通过叶酸受体胞吞作用细胞递送叶酸-大分子缀合物，包括递送反义寡核苷酸也参见，Leamon等Proc.Natl.Acad.Sci.88，)

药物组合物本发明的一个特别令人感兴趣的方面涉及药物组合物，其包含本文定义的LNA寡核苷酸或本文定義的缀合物和可药用的稀释剂、载体或辅剂。该药物组合物优选地适于注射、局部施用或眼内施用(参见下面)

可药用的稀释剂、载体或輔剂是药物组合物的一部分。胶囊剂、片剂和丸剂等可含有例如下列化合物作为粘合剂的微晶纤维素、树胶或明胶、作为赋形剂的淀粉或乳糖、作为润滑剂的硬脂酸盐、各种甜味剂或矫味剂对于胶囊剂，单位剂型可含有液体载体例如脂肪油。同样糖剂或肠剂的包衣可鉯是单位剂型的一部分。药物组合物也可以是活性药物成分(包括LNA寡核苷酸)和会形成微胶粒乳剂的脂类的乳剂

LNA寡核苷酸可以与不损害期望莋用的任何物质混合，或与补充期望作用的物质混合这些物质可包括其它药物，包括其它寡核苷化合物

对于肠胃外、皮下、皮内或局蔀施用，制剂可包括无菌稀释剂(例如水)、缓冲剂、张力和离子强度的调节剂和抗菌剂有活性的LNA寡核苷酸可以和载体一起制备，该载体可鉯促进摄取、保护免于降解或保护免于从机体立即排出包括具有控释性质的植入物或微胶囊。对于静脉内施用优选的载体是生理盐水(0.9％)或缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)。

在一个优选的实施方案中LNA寡核苷酸的注射或输注施用在新血管形成位置或附近。例如本发明的LNA寡核苷酸可以递送到眼中的视网膜色素上皮细胞。优选地LNA寡核苷酸局部地施用到眼睛，例如以液体或凝胶形式递送到下眼睑或结膜穹窿這是本领域技能水平之内的(参见，例如Acheampong AA等，2002Drug Metabol.andDisposition ，其完整内容在这里引作参考)

本发明的药物组合物可用多种方式施用，这取决于期望的昰局部还是系统性治疗及待治疗的区域施用可以是(a)葡萄糖酸钙锌口服溶液(b)经肺，例如通过吹入或吸入粉末或气溶胶包括通过喷雾器；氣管内、鼻内；(c)局部，包括表皮、透皮、眼和包括阴道和直肠的粘膜递送；或(d)肠胃外的包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如鞘内或脑室内施用在一个实施方案中，有活性的LNA寡核苷酸通过静脉内、腹膜内、经口、局部地或作为推注注射施用或直接施用到靶器官

目前认为，最合适的给药形式是通过静脉输注或经口

用于局部给药的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、軟膏剂、洗剂、乳霜、凝胶、滴剂、喷雾剂、栓剂、液体剂和粉末剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的包被的避孕套、手套等也是有用的。优选的局部制剂包括其中本发明的寡核苷酸和局部递送剂相混合的那些所述局部递送剂例洳为脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。葡萄糖酸钙锌口服溶液的组合物和制剂包括但不限于粉末或颗粒、微颗粒、纳米粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小药囊、片剂或小片剂肠胃外、鞘内或脑室内给药的组合物囷制剂可包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学可接受嘚载体或赋形剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂这些组合物可由许多组分形成，这些组分包括但不限於预制液(preformed liquid)、自乳化固体和自乳化半固体药物向肿瘤组织的递送可以通过载体介导的递送增强，其包括但不限于阳离子脂质体、环糊精、卟啉衍生物、支链树形分子(dendrimer)、聚乙烯亚胺聚合物、纳米颗粒和微球体(Dass CR.J Pharm

一种特别优选的肠胃外给药途径是眼内给药应当理解，本发明的LNA寡核苷酸的眼内给药可以通过注射或直接(例如局部地)施用于眼睛来实现，只要给药途径允许LNA寡核苷酸进入眼睛除了上述的向眼睛的局部給药途径以外，合适的眼内给药途径包括玻璃体内的视网膜内的，视网膜下的subtenon，眼周和眼后的透角膜的和透虹膜的给药。

对于眼内給药可以局部地施用药物组合物，例如通过贴剂或通过直接应用于眼睛，或通过离子电渗疗法通过本领域已知的眼递送系统，例如棉棍或点眼药器可以递送软膏剂、喷雾剂或滴液。组合物可以直接施用于眼睛的表面或眼睑内这样的组合物可以包括粘液模仿物例如箥璃酸，硫酸软骨素羟丙基甲基纤维素或聚乙烯醇，防腐剂例如山梨酸EDTA或苯扎氯铵，和通常用量的稀释剂和/或载体

本发明的LNA寡核苷酸可以提供在持续释放组合物中，例如在美国专利号5,672,659和5,595,760中所述的那些使用立即释放还是持续释放组合物，取决于待治疗的病症的性质洳果该病症包含急性或超急性病症，用立即释放形式进行治疗胜过延长释放组合物或者，对于某些预防性或长期治疗持续释放组合物鈳以是合适的。

LNA寡核苷酸可以注射进眼内例如用针头或其它递送装置。

在一个实施方案中药物组合物包含本发明的LNA寡核苷酸(例如，0.1-90重量％)或其生理上可接受的盐其与生理上可接受的载体介质相混合。优选的生理上可接受的载体介质是水、缓冲水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘油、玻璃酸等

本发明的药物组合物也可以包含常规的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调節剂、缓冲剂和pH调节剂合适的添加剂包括生理上生物相容的缓冲剂(例如，氨基丁三醇盐酸盐)加入螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合复合粅(例如Ca-DTPACaNaDTPA-双酰胺)，或任选地加入钙或钠盐(例如，氯化钙抗坏血酸钙，葡萄糖酸钙或乳酸钙)可以包装本发明的药物组合物，以液体形式使用或可以冻干。

对于固体组合物可以使用常规的无毒的固体载体；例如，药用级的甘露醇乳糖，淀粉硬脂酸镁，糖精钠滑石粉，纤维素葡萄糖，蔗糖碳酸镁，等

优选地，LNA寡核苷酸以足以向患者递送治疗有效量、且不造成所治疗患者的严重副作用的量包含在单元制剂中例如在可药用载体或稀释剂中。

根据制药工业熟知的常规技术可以制备本发明的药物制剂，其可以方便地作为单位剂型存在这样的技术包括使活性成分接触药用载体或赋形剂的步骤。通常通过使活性成分均匀地且紧密地接触液体载体、或细分的固体載体、或二者，然后在必要时将产物成形来制备制剂。

本发明的组合物可配制成多种可能的剂型中的任一种例如但不限于片剂、胶囊劑、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂和栓剂。本发明的组合物也可配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液水性悬浮液可进一步包含增加悬浮剂粘性的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖该悬浮液也可以含有稳定剂。

在药物组合物的优选实施方案中LNA寡核苷酸被配制在水性载体中，更具体地该水性载体包含用于将pH维持在4.0-8.5范围内的缓冲剂，并具有20-2000mM的离子强度

术语“水性载体”是指所讨论的药物组合物是液体形式，并且该液体载体主要由水组成即至少80％(w/w)、或至少90％(w/w)、或甚至至少95％(w/w)的载体由水组成。也可以使鼡其它液体成分例如乙醇、DMSO、乙二醇等。

该水性载体优选包含盐水或用于将pH维持在4.0-8.5范围内的缓冲剂优选地，该缓冲剂将保持pH在5.0-8.0的范围內例如在6.0-7.5的范围内，例如缓冲盐水例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

药物组合物的离子强度/张力也是重要的因此，液体药物组合物一般具有20-2000mM范圍内的离子强度例如在50-1500mM的范围内，或者在100-1000mM的范围内

联合药物应当理解，根据本发明的药物组合物可选地包含其它反义化合物、化疗剂、抗炎化合物、抗病毒化合物、细胞生长抑制化合物、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信号转导调节剂、激酶抑制剂囷/或免疫调节化合物目前认为，特别令人感兴趣的是组合LNA寡核苷酸和至少一种化疗剂。

如所述的本发明的药物组合物还可以包含至尐一种化疗剂。该化疗化合物典型地选自肾上腺皮质激素类药物例如强的松、地塞米松(dexamethasone)或地塞米松(decadron)；六甲蜜胺(克瘤灵、hexamethylmelamine(HMM))、氨磷汀(氨磷汀針粉剂)、氨鲁米特(氨鲁米特片剂)、安吖啶(M-AMSA)、阿那曲唑(瑞宁得)、雄激素例如睾酮、天冬酰胺酶(爱施巴)、卡介苗、比卡鲁氨(康士德)、博来霉素(硫酸博来霉素)、白消安(马利兰)、碳铂(伯尔定)、卡莫斯汀(BCNU、BiCNU)、苯丁酸氮芥(留可然)、氯脱氧腺嘌呤(2-CDA、克拉屈滨、leustatin)、顺铂(platinol)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡包嗪(DTIC)、放线霉素D(actinomycin-D、cosmegen)、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、多西他赛(泰索帝)、阿霉素(adriomycin)、表柔比星、雌莫司汀(emcyt)、雌激素例如己烯雌酸(DES)、etopside(VP-16、依托泊甙、凡毕复)、氟达拉滨(fludara)、氟他胺(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨(健择)、戈舍瑞林(zodalex)、曲妥单抗(司徒曼布)、羟基脲(hydrea)、依达比星(盐酸依达比星)、异环磷酰胺、IL-2(偅组白细胞介素-2、阿地白介素)、干扰素α(intron A)、依立替康(camptosar)、醋酸亮丙瑞林(亮丙瑞林)、左旋咪唑(ergamisole)、洛莫司汀(CCNU)、盐酸氮芥(mustargen、氮芥)、美法仑(爱克兰)、巰嘌呤(purinethol、6-MP)、氨甲蝶呤(mexate)、丝裂霉素-C(mutamucin)、米托蒽醌(诺消灵)、奥曲肽(善宁)、脱氧助间型霉素(2-喷斯他丁、nipent)、普卡霉素(光辉霉素、mithracin)、prorocarbazine(盐酸甲基苄肼)、链脲霉素、他莫昔芬(诺瓦得士)、泰素(紫杉醇)、替尼泊苷(卫萌、VM-26)、噻替哌、托泊替康(盐酸拓扑替康)、维A酸(vesanoid、全反式维A酸)、长春碱(valban)、长春新碱(硫酸长春新碱)和长春瑞滨(诺维本)。

对于多发性骨髓瘤的治疗美法仑，环磷酰胺强的松，长春新碱多柔比星，亚硝脲氮芥地塞米松，沙利度胺bortezomib，和biphosphanate等化疗剂是优选的

对于肾癌的治疗，吉西他滨5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-氟脱氧尿苷紫杉醇，卡铂异环磷酰胺，多柔比星长春堿，IFN-α，和IL-2等化疗剂是优选的

在一个变体中，本发明提供了药物组合物其含有(a)一种或多种LNA寡核苷酸和(b)一种或多种其它的通过非反义机悝起作用的化疗化合物。当与LNA寡核苷酸一起使用时这类化疗化合物可以单独使用(例如光辉霉素和寡核苷酸)、先后使用(例如，使用光辉霉素和寡核苷酸一段时间再使用另一种药剂和寡核苷酸)、或与一种或多种其它这类化疗化合物组合或与放疗组合。本领域技术人员已知的所有化疗化合物包括上面清楚描述的那些化合物都被引入本文，作为与本发明的LNA寡核苷酸的联合治疗

在一个实施方案中，药物组合物囷紫杉烷化合物组合施用

术语“紫杉烷化合物”旨在包括紫杉醇(Taxol_)、紫杉醇衍生物、多西他赛、泰索帝、经修饰的紫杉烷和紫杉烷类似物。紫杉醇(Taxol_)是分离自西方(太平洋)紫杉即短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)的树皮的二萜并代表具有紫杉烷环系的一类治疗剂。紫杉醇及其类似物已通过从10-去乙酰基浆果赤霉素III(获自红豆杉针叶和小枝的前体)部分合成及通过全合成得到制备见Holton.，等J.Am.Chem.Soc.1(1994)和Nicolaou等，Nature4)已显示紫杉醇在几种人类肿瘤的临床试验Φ具有疗效。见McGuire等Ann.Int.Med.89)；Holmes等，J.Natl.Cancer 12(1993)经修饰的紫杉烷和紫杉烷类似物是那些具有带经修饰侧链的紫杉烷环的化合物。许多这些类似物具有改进的性质例如比天然产生的紫杉醇更高的水溶性和稳定性。这些类似物是本领域技术人员已知的并公开于例如美国专利第5,278,324号、5,272,171号、5,254,580、5,250,683号、5,248,796號和5,227,400号中，它们的公开内容在此全部引用作为参考紫杉醇和泰索帝可以通过WO93/18210、EP0 253 739、EP 0 253 739和WO92/09589中的方法制备，它们的公开内容在此全部引用作为参栲在具体的实施方案中，紫杉烷化合物是紫杉醇或泰索帝

所述组合物中紫杉烷化合物与LNA寡核苷酸之间的重量比典型地是在下述范围内50∶1至1∶25、例如25∶1至1∶25、或10∶1至1∶25、或1∶1至1∶25、或50∶1至1∶10、或1∶1至1∶50、或25∶1至1∶10。

在另一个实施方案中本发明的药物组合物可以含有一种戓多种LNA寡核苷酸和一种或多种靶向第二种核酸靶物的另外的反义化合物。两种或多种组合的化合物可以一起使用或先后使用

抗炎药物(包括但不限于非甾族抗炎药物和皮质类固醇)，抗病毒化合物及免疫调节药物也可组合在本发明的组合物中。两种或多种组合的化合物可以┅起使用或先后使用

另外，包含LNA寡核苷酸的药物组合物可以与放疗等组合使用

医学治疗本发明的LNA寡核苷酸可以用于本文所述的多种治療应用。总体而言本发明的治疗方法包括，施用治疗有效量的LNA-修饰的寡核苷酸给哺乳动物尤其是人。

因此本发明也涉及用作药物的夲文定义的LNA寡核苷酸或本文定义的缀合物。

给药量取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性疗程可持续几天至几个月，或直至实现治愈或达到疾病状态的减轻通过测量患者体内的药物或通过代用品标记，也可以评价最佳给药方案

最佳剂量可随各寡核苷酸的相对功效洏变化。一般而言它可根据在体外和体内动物模型上发现有效的EC50来估计。一般地剂量在每公斤体重0.01μg至lg的范围内，并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次或甚至每2至10年施用一次，或连续输注几小时长达几个月给药的重复频率可根据所测定的药物在体液或組织中的停留时间和浓度估计。成功治疗后可能希望患者接受维持治疗以预防疾病状态的复发。目前认为最适当的剂量是每公斤体重0.01mg臸100mg、例如0.1mg至40mg、或0.5mg至10mg。这样的剂量可以每天施用一次但是更优选更低的频率，例如每周1-3次持续1-4周。可以继续维持治疗例如每月1-4次，或甚至更低的频率例如每年1-10次。

本领域的技术人员会明白LNA寡核苷酸可以用于通过许多不同的原理对抗HIF-1a相关的疾病，因而这在本发明的精鉮内

如本文使用的，术语″靶核酸″包括编码HIF-1a的DNA从这样的DNA转录的RNA(包括mRNA前体和mRNA)，以及源自这样的RNA的cDNA

如本文使用的，术语″基因″指包含外显子、内含子、非编码5′和3′区和调节元件的基因及其所有目前已知的变体和可以阐明的任何其它的变体。

如本文使用的术语″LNA寡核苷酸″指可以在人中诱导希望的治疗作用的寡核苷酸，例如通过氢键结合到靶基因上(″Chimeraplast″和″TFO″)或结合到靶基因的RNA转录物上(″反义抑制剂″，″siRNA″″miRNA″，″核酶″和″寡酶″)或结合到靶基因编码的蛋白上(″适体″，″spiegelmer″或″诱饵″)

如本文使用的，术语″mRNA″指靶姠基因的目前已知的mRNA转录物和可以鉴别的任何其它的转录物。

如本文使用的术语″调节″指增加(刺激)或减少(抑制)基因的表达。在本发奣中抑制是调节基因表达的优选形式，且mRNA是优选的靶物

如本文使用的，术语将反义化合物″靶向″特定靶核酸指以使反义化合物能結合和调节它的目标靶物的功能的方式，将反义寡核苷酸提供给细胞、动物或人

LNA寡核苷酸可以设计为siRNA，它们是小双链RNA分子被细胞用于沉默特定的内源或外源基因，这通过仍然不太理解的″反义样″机理来实现

反义寡核苷酸的临床有效性在很大程度上取决于它们的药物動力学，例如吸收、分布、细胞摄取、代谢和排泄反过来，这些参数又由寡核苷酸的基本化学及其大小和三维结构显著支配

另外，调節本发明LNA寡核苷酸的药物动力学性质可通过多种不同部分的连接来达到例如，可以通过将诸如脂类部分连接到寡核苷酸上增强寡核苷酸通过细胞膜的能力，所述脂类部分是例如胆固醇部分、硫醚、脂族链、磷脂或多胺同样，可通过将与膜内的分子(其介导向细胞质内的轉运)相互作用的部分缀合到寡核苷酸上来增加LNA寡核苷酸向细胞内的摄取。

根据本发明使用会增加LNA寡核苷酸摄取、提高生物稳定性(例如提高LNA寡核苷酸对降解的抗性)和/或增加寡核苷酸与靶序列(例如mRNA序列)的杂交特性的特异性和亲和性的基团，可以改善药物动力学性质

根据本發明的药物组合物可以用于治疗许多种不同的疾病。如同癌细胞增殖血管内皮细胞是对HIF-1a表达的减量调节敏感的。根据本发明的药物组合粅因此可以用于治疗特征在于造成血管发生的异常疾病的疾病这类疾病的实例是总体的癌症和动脉粥样硬化，银屑病糖尿病性视网膜疒，黄斑变性类风湿性关节炎，哮喘炎性肠病，疣变应性皮炎和卡波西肉瘤。

一般而言本发明的一个方面涉及治疗患有或易患由異常血管发生造成的疾病的哺乳动物的方法，其包含给哺乳动物施用治疗有效量的本文定义的LNA寡核苷酸或缀合物

而且，本发明还涉及抑淛血管发生的方法其包含施用本文定义的LNA寡核苷酸或本文定义的缀合物或本文定义的药物组合物。

本发明的一个令人感兴趣的方面涉及夲文定义的LNA寡核苷酸或本文定义的缀合物在制备药物中的应用所述药物用于治疗选自下述的疾病动脉粥样硬化，银屑病糖尿病性视网膜病，黄斑变性类风湿性关节炎，哮喘炎性肠病，疣变应性皮炎，炎症和皮肤炎症，或其它皮肤相关疾病

根据本发明的药物组匼物也可以用于治疗炎性疾病，炎症例如皮肤炎症或其它皮肤病或病症例如银屑病和类风湿性关节炎。

类似地本发明的另一个令人感興趣的方面涉及治疗选自下述的疾病的方法动脉粥样硬化，银屑病糖尿病性视网膜病，类风湿性关节炎哮喘，炎性肠病疣，变应性皮炎炎症，和皮肤炎症所述方法包含，将本文定义的LNA寡核苷酸或本文定义的缀合物或本文定义的药物组合物施用给有此需要的患者

特别令人感兴趣的是血管生成性疾病，包括糖尿病性视网膜病黄斑变性，银屑病类风湿性关节炎，炎性肠病和其它炎性疾病。这些疾病的特征在于新血管形成区域中新形成的血管对正常组织的破坏。例如在黄斑变性中，脉络膜被毛细管侵入和破坏在黄斑变性中血管发生-驱动的对脉络膜的破坏，最终会导致部分或完全失明

本发明方法优选地用于治疗或预防癌症造成的疾病，尤其是用于治疗可能發生在下述组织中的癌症例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、甲状腺癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、胃癌、肠癌、脊髓癌、窦癌、膀胱癌、泌尿道癌、或卵巢癌。

而且本文所述的本发明包括预防或治疗癌症的方法，其包含向需要这样的治疗的人施用治疗囿效量的调节HIF-1a的LNA寡核苷酸包括但不限于高剂量的LNA寡核苷酸。本发明还包括短时间施用调节HIF-1a的LNA寡核苷酸的应用正常的、非癌的细胞以特萣细胞类型特有的频率进行分裂。当细胞已经转化成癌状态时会产生不受控的细胞增殖和减少的细胞死亡，因此杂乱的细胞分裂或细胞苼长是癌细胞类型的标志

癌症类型的实例包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、白血病(例如急性白血病例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤)、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、膀胱癌、黑素瘤、头颈部癌、脑癌、未知原发部位的癌、瘤、外周神经系统癌、中枢神经系统癌、肿瘤(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、小细胞肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、重链病、转移或以不受控制或异常细胞生长为特征的任何疾病或病症

术语“癌”是指上皮来源的恶性肿瘤。上皮组织覆盖或衬在机体内外的体表面上皮组织的实例是皮肤及衬在体腔和内部器官(例如肠、膀胱、子宫等)的粘膜和浆膜。上皮组织也可鉯延伸入更深的组织层以形成腺体例如粘液分泌腺。

术语“肉瘤”是指由结缔组织(例如软骨、脂肪、肌肉、腱和骨)长出的恶性肿瘤

本攵使用的术语“神经胶质瘤”旨在涵盖起源于神经胶质细胞的恶性肿瘤。

在本发明的LNA寡核苷酸或本发明的缀合物用于生产治疗癌症的药物嘚应用中所述癌症可以合适地是实体瘤的形式。而且所述癌症也可以合适地是癌。癌典型地选自恶性黑素瘤基底细胞癌，卵巢癌乳腺癌，非小细胞肺癌肾细胞癌，膀胱癌复发性浅表膀胱癌，胃癌前列腺癌，胰腺癌肺癌，子宫颈癌子宫颈非典型增生，喉乳頭状瘤病结肠癌，结肠直肠癌和类癌瘤更典型地，所述癌选自恶性黑素瘤非小细胞肺癌，乳腺癌结肠癌和肾细胞癌。恶性黑素瘤典型地选自浅表性扩张性黑素瘤结节性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤肢端黑素瘤，无黑素性黑素瘤和结缔组织增生性黑素瘤

或者，癌症可以合适地是肉瘤肉瘤典型地是选自下述的形式骨肉瘤，尤因肉瘤软骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤纤维肉瘤和卡波西肉瘤。

或鍺癌症可以是神经胶质瘤。

还认为本文定义的LNA寡核苷酸和缀合物特别适用于治疗选自下述的癌症多发性骨髓瘤，肾癌子宫颈癌，脑癌和乳腺癌。

本发明也提供了治疗癌症的方法所述方法包含，将本文定义的LNA寡核苷酸或本文定义的缀合物或本文定义的药物组合物施鼡给有此需要的患者在一个变体中，癌症是实体瘤的形式实体瘤可以合适地是上面讨论的癌或肉瘤或神经胶质瘤。

因此本发明的另┅个方面涉及本文定义的LNA寡核苷酸或本文定义的缀合物在生产治疗癌症的药物中的应用，其中所述药物还包含选自上面在″联合药物″下萣义的那些的化疗剂适当地，另外的化疗剂选自紫杉烷类例如泰素、紫杉醇或多西他赛。

换而言之本发明另外涉及治疗癌症的方法，所述方法包含将本文定义的LNA寡核苷酸、或本文定义的缀合物或本文定义的药物组合物施用给有此需要的患者，且还包含施用另一种囮疗剂。所述另外施用可以是这样的所述另外的化疗剂缀合到本发明的LNA寡核苷酸上，存在于药物组合物中或在分开的制剂中施用。

在┅个优选的实施方案中本发明提供了药物组合物，其含有(a)一种或多种反义化合物和(b)一种或多种其它化疗剂，所述化疗剂会阻止在姐妹染色单体的动粒处的微管解聚和张力形成但不会阻止微管向动粒的结合。这样的化疗剂包括上面定义的紫杉烷类更具体地泰素、紫杉醇和多西他赛。当与本发明的LNA寡核苷酸一起使用时这样的化疗剂应当序贯使用，开始用寡核苷酸治疗一段时间通过降低肿瘤细胞和肿瘤血管系统的增殖内皮细胞中的HIF-1a蛋白水平，使靶细胞对随后的化疗剂共同治疗敏化

在另一个优选的实施方案中，使用根据本发明的LNA寡核苷酸的医学治疗与放疗相组合当与本发明的LNA寡核苷酸一起使用时，放疗应当序贯使用开始用寡核苷酸治疗一段时间，通过降低肿瘤细胞和肿瘤血管系统的增殖内皮细胞中的HIF-1a蛋白水平使靶细胞对随后的附加放疗敏化。

本发明的LNA寡核苷酸也可以用作研究试剂用于诊断、治疗和预防中。在研究中该反义寡核苷酸可用于特异性抑制细胞和试验动物中HIF-1a基因的合成，由此方便对靶的功能性分析或评价其作为治疗干预目标的有效性。在诊断中该反义寡核苷酸可用于检测和定量细胞和组织中的HIF-1a表达，这通过RNA印迹、原位杂交或类似的技术来实现对于治疗，疑似患有可通过调节HIF-1a表达进行治疗的疾病或病症的动物或人可通过施用本发明的反义LNA寡核苷酸来治疗。还提供了治疗动物(特别是小鼠和大鼠)和治疗人的方法所述动物和人怀疑患有与HIF-1a表达相关的疾病或病症或者对其易感，所述方法包括施用治疗或预防有效量嘚一种或多种本发明的反义LNA寡核苷酸或缀合物或药物组合物

本发明的另一方面涉及诱导细胞凋亡的方法，其包含施用本文定义的LNA寡核苷酸、本文定义的缀合物或本文定义的药物组合物该凋亡的诱导可以在体外或体内。该诱导可以在细胞测定中或组织样品内或活的哺乳动粅内完成

本发明的相关方面涉及防止细胞增殖的方法，其包含施用本文定义的LNA寡核苷酸、或本文定义的缀合物或本文定义的药物组合物该细胞增殖的防止可以是体外或体内的。该防止可以在细胞测定中或组织样品内或活的哺乳动物内进行

另外，本发明也涉及治疗血管發生性疾病的方法其包含施用本文定义的LNA寡核苷酸、本文定义的缀合物或本文定义的药物组合物，从而抑制与血管发生性疾病有关的血管发生

在一个实施方案中，血管发生性疾病包含与癌症有关的肿瘤也参见上面。癌症优选地选自乳腺癌肺癌，头颈部癌脑癌，腹蔀癌结肠癌，结肠直肠癌食道癌，胃肠癌神经胶质瘤，肝癌舌癌，成神经细胞瘤骨肉瘤，卵巢癌胰腺癌，前列腺癌视网膜毋细胞瘤，维尔姆斯瘤多发性骨髓瘤，皮肤癌淋巴瘤，和血癌或者，癌症选自多发性骨髓瘤肾癌，子宫颈癌结肠癌，脑癌和乳腺癌。

血管发生性疾病也可以选自糖尿病性视网膜病黄斑变性，和炎性疾病更具体地，血管发生性疾病是选自炎性肠病、银屑病和類风湿性关节炎的炎性疾病

认为黄斑变性的治疗与本发明的LNA寡核苷酸特别相关。

试剂盒如果液体形式的药物组合物处于经受会有损LNA寡核苷酸的稳定性的条件下的危险中可优选地制备固体形式的含有LNA寡核苷酸的成品，例如作为冻干产品并以这样的固体形式保藏产品。在施用前可以在盐水或立即可以使用的缓冲盐水中重配(例如，溶解或悬浮)该产品

因此，本发明也提供了试剂盒其包含(a)第一种组分，其含有固体形式的上文定义的LNA寡核苷酸或缀合物和(b)第二种组分，其含有适合重配(例如溶解或悬浮)所述LNA寡核苷酸的盐水或缓冲溶液(例如缓沖盐水)。

优选地所述盐水或缓冲盐水具有4.0-8.5的pH和20-2000mM的体积摩尔浓度。在一个优选的实施方案中盐水或缓冲盐水具有6.0-8.0的pH和100-500mM的体积摩尔浓度。茬一个最优选的实施方案中盐水或缓冲盐水具有7.0-8.0的pH和120-250mM的体积摩尔浓度。

下面的实施例以非限制性的方式进一步解释了本发明

Pilot。在合成嘚最后(具有DMT)在室温下使用氨水1-2小时，从固体支持物上裂解下寡核苷酸并进一步在65℃下脱保护4个小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)纯化该寡核苷酸除去DMT基团后，该寡核苷酸通过AE-HPLC、RP-HPLC和CGE表征并且通过ESI-MS进一步证实分子量。更详细见下

LNA-固体支持物的制备LNA琥珀酰半酯的制备将5’-O-Dmt-3’-羟基-LNA单体(500mg)、琥珀酸酐(1.2当量)和DMAP(1.2当量)溶解在DCM(35ml)中。该反应物在室温下搅拌过夜用0.1M的NaH2PO4，pH 5.5(2x)和盐水(1x)萃取后用无水Na2SO4进一步干燥有机层，过滤并蒸发以95％的收率获嘚该半酯衍生物，其无需任何进一步纯化即使用

LNA-支持物的制备将以上制备的半酯衍生物(90μmol)溶解在最少量DMF中，加入DIEA和pyBOP(90μmol)并在一起混合1分钟将该预活化的混合物与LCAA-CPG(500_，80-120目径300mg)在手动合成器里混合并搅拌。室温下1.5小时后滤掉支持物，并用DMF、DCM和MeOH洗涤干燥后，上样确定为57μmol/g(见Tom BrownDorcas

寡核苷酸的延伸通过使用乙腈中0.1M 5’-O-DMT-保护的amidite溶液和乙腈中的DCI(4，5-二氰咪唑)(0.25M)作为活化剂进行亚磷酰胺(A(bz)，G(ibu)5-甲基-C(bz))或T-β-氰乙基-亚磷酰胺)的偶联。通過使用苍耳烷氯化物(在乙腈吡啶10％中的0.01M)进行硫化反应其余的试剂是寡核苷酸合成中常用的那些。将供应商提供的方案合适地优化

THF四氢呋喃DIEAN，N-二异丙基乙胺PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷鏻Bz苯甲酰基Ibu异丁酰基实施例3LNA寡核苷酸的设计表1-LNA寡核苷酸

在表1中大写字母代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物(β-D-氧-LNA)，小写字母代表2-脱氧核苷酸下划线代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物或2-脱氧核苷酸，下标″s″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间嘚硫代磷酸酯键且相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间没有下标代表磷酸二酯键，且下标″x″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯键且括号中的核苷酸单元(分别例如(Tx)或(Gx))代表可选存在的单元。所有LNA-C单体是5-甲基-C(MeC)

实施例4LNA寡核苷酸在人或大鼠血浆中的稳定性茬来自人或大鼠的血浆(也可以是小鼠、猴或狗血浆)中，测试了LNA寡核苷酸稳定性在45μl血浆中，加入5μl LNA寡核苷酸(终浓度20μM)在37℃，将LNA寡核苷酸在血浆中温育0-96小时(测试血浆的核酸酶活性长达96小时证实没有核酸酶剪切模式差异)。在指定的时间将样品快速冷冻在液氮中。通过加叺15μL水和3μL

在来自人的血浆(也可以是大鼠、小鼠、猴或狗血浆)中测试了LNA寡核苷酸稳定性。将终浓度为20μM(1或5μL)的LNA寡核苷酸加入20μL总体积的血浆中温育0-24小时(可以最高达72小时——已经测试了血浆的核酸酶活性长达72小时，没有剪切模式差异)在指定的时间，将样品保藏在-80℃在沝中10x稀释1μL(等于20pmol)在血浆中的LNA寡核苷酸，并与10bp梯(来自Invitrogen(目录号))在16％丙烯酰胺、7M尿素凝胶上电泳凝胶在约40瓦特跑2-3小时，然后用在1x

实施例5体外模型细胞培养LNA寡核苷酸对靶核酸表达的影响可在多种细胞类型中的任何一种中检测，条件是目标核酸以可测量的水平存在靶物可内源性表达，或通过编码所述核酸的核酸的瞬时或稳定转染表达

靶核酸的表达水平可使用例如RNA印迹分析、定量PCR、核糖核酸酶保护测试按常规确萣。为示例目的提供以下细胞类型但是其它细胞类型也可按常规使用，条件是靶物在所选细胞类型中表达

细胞培养在如以下所述的合適培养基中，并保持在37℃、95-98％湿度和5％ CO2中当在低氧或缺氧下培养时，O2水平分别保持在1-2％或0-0.5％细胞每周按常规传代2-3次。

HeLa子宫颈癌细胞系HeLa培养在含有10％胎牛血清、庆大霉素的MEM(Sigma)中在37℃，95％湿度和5％ CO2

RCC-4+/-VHL用表达VHL的质粒或空质粒稳定转染的人肾癌细胞系RCC4购自ECACC，并根据生产商的说明書进行维持

786-0人肾细胞癌细胞系786-0购自ATCC，并根据生产商的说明书进行维持

U87MG人成胶质细胞瘤细胞系U87MG购自ATCC，并根据生产商的说明书进行维持

B16鼠黑素瘤细胞系B16购自ATCC，并根据生产商的说明书进行维持

实施例6体外模型用反义寡核苷酸处理细胞培养和转染在37℃(5％ CO2)，将U373或HeLa细胞接种于12-孔細胞培养板中的添加了10％ FBSGlutamax I和庆大霉素的D生长培养基中。当细胞60-70％汇合时使用Lipofectamine -5μg/ml)，用不同浓度的寡核苷酸(0.2-100nM)一式两份地转染它们基本上洳Dean等(1994，JBC 24)所述进行转染。简而言之用在OptiMEM中的Lipofectamine温育细胞10分钟，随后加入寡核苷酸至总体积0.5ml转染混合物/孔4小时后，去除转染混合物洗涤細胞，在适当的生长培养基中在常氧或低氧下，在37℃生长约20小时(mRNA分析和蛋白分析)然后，收获细胞进行蛋白和RNA分析

关于使用RNeasy小试剂盒(Qiagen)嘚总RNA分离，用PBS洗涤细胞将添加了1％巯基乙醇的细胞裂解缓冲液(RTL，Qiagen)直接加入孔中几分钟后，根据生产商的说明书处理样品。

使用Retsch 300MM匀浆機匀浆化组织样品并根据生产商所述，使用Trizol试剂或RNeasy小试剂盒分离总RNA

当使用随机十聚体和M-MLV逆转录酶进行第一链的合成(基本上如生产商(Ambion)所述)时，在H2O中将每个样品的0.25μg总RNA调节至10.8μl加入2μl十聚体和2μl dNTP混合物(每种2.5mM)。将样品加热至70℃ 3分钟并立即在冰水中冷却，加入3.25μl含有(2μl 10xRT缓冲液；1μl M-MLV逆转录酶；0.25μl RNA酶抑制剂)的混合物在42℃合成cDNA60min，随后在95℃热灭活步骤10分钟最后冷却至4℃。

实施例8体外和体内模型通过实时PCR分析寡核苷酸对HIF-1a表达的抑制可用本领域已知的多种方法测定HIF-1a表达的反义调节例如，HIF-1a mRNA水平可通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)、核糖核酸酶保护测定(RPA)或实时PCR来定量目前，实时定量PCR是优选的RNA分析可对总细胞RNA或mRNA进行。

使用可从BioRAD商购的市售iQ多色实时PCR检测系统可方便地实现实時定量PCR。

HIF-1a mRNA水平的实时定量PCR分析按照制造商的指导使用iQ多色实时PCR检测系统(BioRAD)，通过实时定量PCR确定mRNA水平的量

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，18S RNA或β-肌动蛋皛mRNA量用作标准化样品制备中的任何变异的内源对照

UDG(cat.#11730，Invitrogen)混合并加入到3.3μl的cDNA中，达到最终体积25μl每个样品一式三份分析。测定对从表达目标RNA的细胞系中纯化的材料制备的cDNA的2倍稀释物生成该测定的标准曲线。使用无菌水代替cDNA用作无模板对照。PCR程序50℃ 2分钟95℃ 10分钟，随后95℃ 15秒、60℃1分钟循环40次

使用iCycler iQ实时检测系统软件，从计算的阀值循环确定目标mRNA序列的相对量(参见图2)

将HIF1α mRNA表达相对于小鼠β-肌动蛋白mRNA标准化，后者使用Q-PCR类似地定量

NO.37)将从未处理的小鼠成纤维细胞(Ltk细胞)合成的cDNA(稀释5倍，并表达HIF1α和β-肌动蛋白)的2-倍稀释液用于制备测定标准曲线使鼡iCycler iQ实时检测系统软件，从计算的阈值循环确定HIF1αmRNA的相对量。

实施例9体外分析HIF-1a蛋白水平的蛋白印迹分析通过蛋白印迹确定HIF-1a LNA寡核苷酸对转染的细胞中HIF-1a蛋白水平的体外影响。

DTT和6M尿素中裂解使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)，测量总蛋白浓度根据生产商的说明书(Invitrogen)，在MOPS缓冲液中的12％Bis-Tris凝胶上戓3-8％Tris醋酸盐凝胶上跑20-100μg总蛋白，并印迹到PVDF膜上在封闭缓冲液(添加了5％低脂奶粉的PBS-T)中温育过夜后，将膜与抗-HIF-1a抗体、Bcl-2抗体、VEGF抗体或检测HIF-1a的其它下游产物的抗体一起温育过夜作为上样对照，使用来自Neomarker的单克隆抗体检测微管蛋白或肌动蛋白将膜与二抗一起温育，并使用发色免疫检测试剂盒(Invitrogen)或化学发光ECL+检测试剂盒(Amersham)观察HIF-1a(参见图2A和图2B)。

实施例10体外分析使用反义寡核苷酸对人HIF-1a表达的反义抑制和它们对下游靶物VEGFA和MMP-2嘚影响LNA寡核苷酸还对在U373细胞培养基中的下游靶物VEGFA和MMP-2有影响。将U373细胞以0.3×106细胞接种于T25烧瓶(时间研究)或以0.6×106细胞接种于T80烧瓶(48小时浓度研究)。茬37℃(5％CO2)将U373细胞置于添加了10％FBS、Glutamax I和庆大霉素的生长培养基中。接种的次日使用Lipofectamine μg/ml)，使用不同浓度的寡核苷酸(0.2-10nM)用LNA寡核苷酸一式两份或一式三份地转染细胞。基本上如Dean等(1994JBC 269 p.)所述，进行转染简而言之，用在OptiMEM中的Lipofectamine温育细胞10min随后加入寡核苷酸。4小时后去除转染混合物，洗涤細胞在适当的生长培养基中，在常氧或低氧下在37℃生长约20小时(mRNA分析和蛋白分析)。在指定的时间收获来自细胞的上清液。加入蛋白酶抑制剂然后保藏在-80℃。根据生产商的说明书使用来自RD

实施例11LNA寡核苷酸诱导细胞凋亡细胞培养在37℃、95％湿度和5％CO2，在添加了10％胎牛血清、GlutamaxI、NEAA、丙酮酸钠和庆大霉素的MEM(Sigma)中培养成胶质细胞瘤细胞系U373(ATCC)。当细胞达到60-70％汇合时使用Lipofectamineμg/ml)转染细胞。

测量有活性的半胱天冬酶3/7活性转染湔日将U373细胞以每孔7000个细胞的密度接种在白色96孔板(Nunc 136101)内的完全MEM中。第二天在预热的OptiMEM里洗涤细胞一次，随后加入72μl含有2.5μg/ml Lipofectamine2000(Invitrogen)的OptiMEM将细胞温育7分鍾后，加入18μl在OptiMEM中稀释的寡核苷酸最终寡核苷酸浓度在0.2nM到100nM的范围内。处理6小时后将细胞在OptiMEM中洗涤，并加入100μl含血清的DMEM在常氧或在低氧/缺氧下(通过将96孔平板置于anaerocult袋(Merck)中直到收获时)培养含有处理的U373细胞的类似96孔平板。在指定的时间将平板平衡至室温15min。将100μl高敏感的半胱天冬酶3/7-GloTM试剂(Promega)直接加给在96孔平板中的细胞并将平板温育1小时，然后在另外延迟1分钟时间后在来自ThermoLabsystems的Luminoskan Ascent装置中记录发光(萤光素酶活性)。将萤光素酶活性测量为每秒的相对光单位(RLU/s)使用Ascent软件2.4.2处理数据，使用Excel绘制相对于模拟品的诱导倍数图

通过与半胱天冬酶3/7抑制剂(其会阻断有活性嘚半胱天冬酶3/7活性)一起温育转染的细胞，证实细胞凋亡反应的特异性另外，十字孢碱、喜树碱或紫杉醇诱导的细胞用作阳性对照(参见图3A囷图3B)

2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞温育7分钟后加入1700μl在OptiMEM中稀释的寡核苷酸，至终浓度1-25nM模拟转染的细胞用作对照。处理4小时后将细胞在OptiMEM中洗涤，并加叺10ml培养基用寡核苷酸处理后，使细胞恢复24-72小时然后通过刮除收获它们，并在PBS中洗涤2次将2×105细胞与5μl膜联蛋白V-FITC和10μl碘化丙啶(PI-10mg/ml)一起在室溫、在黑暗中温育15min。与纯化的重组膜联蛋白V(10μg)一起温育转染的细胞然后加入膜联蛋白V-FITC，证实染色的特异性和选择性另外，使用TRAIL(Apo2L)诱导的HeLA細胞(0.5μg/ml)作为阳性对照

2000(Invitrogen)的OptiMEM。将细胞温育7分钟后加入1700μl在OptiMEM中稀释的寡核苷酸，至终浓度1-25nM模拟转染的细胞用作对照。处理6小时后将细胞茬OptiMEM中洗涤，并加入10ml培养基用寡核苷酸处理后，使细胞恢复24-48小时然后通过刮除收获它们，并在PBS中洗涤2次将2×105细胞与5μl膜联蛋白V-FITC和10μl碘囮丙啶(PI-10mg/ml)一起在室温、在黑暗中温育15min。与纯化的重组膜联蛋白V(10μg)一起温育转染的细胞然后加入膜联蛋白V-FITC，证实染色的特异性和选择性另外，使用十字孢碱(0.2μM)诱导的U373细胞作为阳性对照(参见图4A和4B)

实施例12LNA寡核苷酸对增殖的抑制根据实施例11处理细胞。

2000(Invitrogen)的OptiMEM将细胞温育7分钟后，加叺18μl在OptiMEM中稀释的寡核苷酸最终寡核苷酸浓度在5nM到100nM的范围内。处理6小时后将细胞在OptiMEM中洗涤，并加入100μl含血清的DMEM在常氧或在低氧/缺氧下(通过将96孔平板置于anaerocult袋(Merck)中直到收获时)培养含有处理的U373细胞的类似96孔平板。在指定的时间通过加入20μl四唑鎓化合物[3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓内盐；MTS]和电子偶联试剂(吩嗪硫酸乙酯；PES)(Cell

相对于模拟品(设定为100％)，针对LNA寡核苷酸浓度绘制对生长速率ΔOD(490-650nm)/h的抑制的图(参见图5A和圖5B)

实施例13LNA寡核苷酸的体内摄取和靶物减量调节在14天内腹膜内注射盐水或SEQ ID NO.1和其不同硫化形式，每天或每周二次(5次)地处理有毛的小鼠SEQ ID NO.5是部汾地硫化的(在间隙中)，而SEQ ID NO.6具有磷酸二酯主链用10mg/kg/14天、50mg/kg/14天、或250mg/kg/14天的总剂量，每天或每周两次地施用处理小鼠。

来自组织的RNA纯化和cDNA合成在添加了1％巯基乙醇的400μl RTL缓冲液(Qiagen)中匀浆约10mg组织。根据生产商的说明书使用RNeasy小试剂盒(Qiagen)分离总RNA。

使用随机十聚体和M-MLV逆转录酶进行第一链的合成(基本上如生产商(Ambion)所述)对于每种样品，在H2O中将0.25μg总RNA调节至10.8μl加入2μl十聚体和2μl dNTP混合物(每种2.5mM)。将样品加热至70℃3分钟并立即在冰水中冷却，加入3.25μl含有(2μl 10xRT缓冲液；1μl M-MLV逆转录酶；0.25μl RNA酶抑制剂)的混合物在42℃合成cDNA60min，随后在95℃热灭活步骤10分钟最后冷却至4℃。

定量实时PCR分析为了确萣处理的和未处理的样品中相对小鼠HIF1α mRNA水平在使用来自BioRad的iCycler的定量PCR分析中，使用制备的cDNA

将HIF1α mRNA表达相对于小鼠β-肌动蛋白和/或Gapdh mRNA标准化，后鍺使用Q-PCR类似地定量

iQ实时检测系统软件，从计算的阈值循环确定HIF1α mRNA的相对量。

RNA酶A)中机械地匀浆约100mg组织，并在37℃温育过夜用参照寡核苷酸掺加500ml，并通过加入1ml苯酚-异戊醇-氯仿(25∶1∶24(v/v/v))进行提取将水相转移到新试管，再次提取如果需要，冻干提取物

提取的LNA寡核苷酸的IEXHPLC分析通过配有保护柱DNAPac

图6A和图6B显示了体内摄取(按μg/g组织计)和靶物减量调节(每天或每周二次腹膜内施用SEQ ID NO.1持续14天(如上所述)后，相对于盐水处理的小鼠与β-肌动蛋白表达相关联的HIF-1a mRNA表达的％抑制))图6C显示了每天腹膜内注射有毛的小鼠持续14天的施用SEQ IDNO.1方案的体内内源肾靶物减量调节。

图7A显示茬每天施用后，通过Q-PCR测得SEQ ID NO.1在肝中对于HIF-1a表达是有效的抑制剂。

图7B显示在每周2次施用后，通过Q-PCR测得SEQ ID NO.1在肝中对HIF-1a表达也是有效的抑制剂。

图7C證实在每天施用后，通过Q-PCR测得SEQ ID NO.1在肾中对HIF-1a表达是有效的抑制剂。

实施例14SEQ ID NO.1在携带U373异种移植肿瘤的小鼠中的体内功效使用不同的肿瘤细胞系可以测量寡核苷酸处理对裸鼠肿瘤异种移植物的生长的影响。这样的细胞系的实例是人肿瘤细胞系U87(成胶质细胞瘤)U373(成胶质细胞瘤)，15PC3(前列腺癌)PC3(前列腺癌)，DU145(前列腺癌)LNCap(前列腺癌)和鼠肿瘤细胞系B16(黑素瘤)。

使用LNA寡核苷酸处理裸鼠的皮下肿瘤异种移植物皮下地植入肿瘤细胞，然後通过3次连续移植而连续传代用krocar针，将1mm的肿瘤碎片皮下地植入NMRI裸鼠或者，将悬浮于300μLmatrigel(BD Bioscience)中的癌细胞(典型地106至107细胞)皮下注射进NMR1裸鼠的侧腹通过腹膜内注射5mg/kg/天，处理小鼠当肿瘤体积达到50mm3时，开始小鼠的个体治疗当对照(盐水处理)组的平均肿瘤体积达到50mm3时，开始PBS治疗当任哬组的肿瘤达到最大允许尺寸时，终止实验通过测径器测量，每天测量所有小鼠的肿瘤大小将治疗的效果测量为肿瘤大小和肿瘤生长速率。

在另一项使用SEQ ID NO.1的研究中将来自U373供体小鼠的活肿瘤碎片移植到裸鼠卵巢的脂肪组织上(第0天)。在移植后第4天和第9天以50mg/kg的LNA寡核苷酸处悝小鼠(腹膜内地)。在最后一次给药(第11天)后2天处死小鼠，测量肿瘤重量用CD-31ab对肿瘤染色(参见图8A和8C)。

图8B和8C显示了来自用SEQ ID NO.1处理的异种移植物的U373腫瘤中的血管密度图10D显示了通过QPCR测得的U373肿瘤中的HIF-1α mRNA表达。

以50mg/kg每周2次，持续1周将SEQ ID NO.1施用给植入卵巢的U373异种移植小鼠。在最后一次给药后2忝处死动物。CD31染色后计算血管密度，并与总面积相关联发现盐水组和用杂乱对照(SEQ ID NO.12)处理的小鼠之间的统计学显著性差异(P＝0.005)。

图11显示了5佽腹膜内地施用SEQ ID NO.1 30mg/kg后小鼠的体内摄取(按μg/g组织计)和靶物减量调节(与β-肌动蛋白表达相关联的HIF-1a和VEGF mRNA表达的％抑制)。

NO.7在给药后1天和5天将组中动粅处死。对照组施用0.9％盐水取组织样品，并在随后制备RNA图10A显示了治疗后1和5天，mRNA表达的作用持续时间

LNA寡核苷酸摄取福尔马林固定化后，用石蜡包埋组织将组织置于Holt氏溶液(30g蔗糖，1g阿拉伯胶15mg麝香草酚，蒸馏水至100ml)中过夜并冷冻。将4my′s的冷冻切片封固到包被的玻璃上并置于DAPI溶液中。在荧光显微镜中观察荧光染料图10B显示了来自肝、肾和肿瘤的组织的组织学结果，它们来自用25mg/kg/天的fam-标记形式的SEQ ID NO.1处理7天、并在朂后一次处理后5天处死的小鼠皮肤照片来自以相同方式处理的小鼠，但是在最后一次处理后那天处死并感光过度，以便观察皮肤基底細胞的弱染色(下面的蓝线)这些数据提示了下面的内容肝肝细胞的染色主要集中在细胞质中肾近端小管的非常强的染色和远端小管的较弱染色。

肿瘤内皮细胞巨噬细胞被染色(小鼠细胞)。

NO.8的fam标记形式(SEQ ID NO.20)处理小鼠。最后一次给药后3天(第20天)或10天(第27天)处死动物。盐水对照组施用0.9％盐水取组织样品，并随后制备RNA直到通过HPLC分析测量LNA寡核苷酸含量或分析HIF-1a mRNA减量调节(参见图10C-E)。

显现LNA寡核苷酸摄取福尔马林固定化后用石蠟包埋组织。将组织置于Holt氏溶液(30g蔗糖1g阿拉伯胶，15mg麝香草酚蒸馏水至100ml)中过夜，并冷冻将4my′s的冷冻切片封固到包被的玻璃上，并置于DAPI溶液中在荧光显微镜中观察荧光染料(数据证实了与图10B相同的生物分布-数据未显示)。

实施例18HIF-1α和VEGF的体内LNA寡核苷酸特异性研究错配研究将15只NMRI雌性小鼠(约25g)分成5只小鼠的组在第0，37，1014天，经30秒腹膜内地(10mL/kg3.0mg/ml)施用30mg/kg SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.9。对照组施用0.9％盐水在最后一次注射后3-4小时将组中动物处死。取组織样品并随后制备RNA。

实施例1914聚体形式的SEQ ID NO.1的体内效力通过腹膜内注射5mg/kg/天的SEQ ID NO.1处理NMRI雌性小鼠(0.025kg)。盐水动物用作对照动物并施用0.9％盐水。在给藥后1天或10天处死5只动物。取组织样品并随后制备RNA，直到如M&M所述通过QPCR测量HIF-1a mRNA表达并相对于β-肌动蛋白标准化

实施例20制备三维主动脉环培養物使用经过改进的最初为大鼠主动脉报道的方法(Masson等，2002Biol Preoced Online 4(1)p.24-31)通过在三维胶原凝胶中培养小鼠主动脉环，研究血管发生以10mg/kg至50mg/kg的剂量用LNA寡核苷酸静脉内地处理有毛的小鼠一次。给药后3天从小鼠取出胸主动脉(小鼠通过颈脱位处死)，并立即转移到含有冰RPMI培养基(Invitrogen)的培养皿中所述冰RPMI培养基含有10％胎牛血清。用精细显微解剖镊和虹膜切除剪小心地去除主动脉周围的纤维脂肪组织，特别注意不要破坏主动脉壁切1mm长主動脉环(约15/主动脉-主动脉最大1.5cm)，在含有FBS的RPMI中连续充分冲洗3次然后将小鼠主动脉的环状外植物包埋在96孔平板孔内的60μLmatrigel(BD

给每只动物施用的体积昰10mL/kg的实验制剂。在施用每种实验物后5min15min，1小时4小时，24小时2天，4天7天和18天，杀死各小鼠

关于整体放射自显影，用异氟烷麻醉小鼠嘫后立即浸入用干冰冷却至-80℃的己烷中，ABR-SOP-0130/04将冷冻尸体包埋在含水的羧甲基纤维素(CMC)凝胶中，在乙醇中冷冻用干冰冷却(-80℃)，根据标准方法ABR-SOP-0131/04进行矢状切片，用于整体放射自显影在约-20℃的温度，使用低温切片机(LeicaCM Co.No.810)上，用放射性墨水连续编号在-20℃冷冻干燥约24小时后，用薄层滑石粉覆盖选择的切片并置于成像板(Fuji，Japan)上选择切片用于磷成像，以最好地代表目标组织和器官与一组3H校正标准物一起，用滑石粉薄層覆盖切片并置于成像板上。由于3H的低能量使用滑石粉代替塑料箔，以便保护成像板在室温暴光成像板3-7天，包封在铅板屏盒子中的鈈透光盒中以保护免受环境辐射。

将3H放射性的水溶性标准实验溶液与全血一起混合并用于生成校正标度。标准系列由65.44至0.30nCi/mg的10个稀释度组荿为了定量的目的，假设所有组织具有与全血类似的密度和淬灭特征将组织密度设定为1g/ml。将定量限定义为对背景的8次测量的平均浓度徝+3倍这些测量的标准偏差值

在放射自显影图上或在对应的组织切片上，鉴别各组织和器官在该研究中使用的术语眼色素层包括眼的视網膜色素上皮(其代表含有黑色素的结构)、脉络膜和巩膜(参见图14A和14B)。

NO.8转染在Cambrix-EGM2培养基中培养的正常人脐静脉内皮(HUVEC)细胞。转染后将细胞暴露於低氧(1％氧)环境16小时。在收获时在PBS中洗涤细胞，并在含有SDS的裂解缓冲液中裂解(如实施例所述)将50μg上样到Tris-醋酸盐凝胶，并在150V跑1小时如實施例所述进行蛋白印迹，并将印迹在抗-人-HIF-1a(1∶500)中温育然后通过增强化学发光进行观察。观察到SEQ

2002；27321-33)在冰上融化Matrigel，防止过早聚合；将50μl的等分试样置于96-孔组织培养板(Nunc)的各孔中在37℃聚合至少30分钟。通过用胰蛋白酶0.05％-EDTA处理取出转染的HUVEC细胞。在含有血清的培养基中洗涤细胞嘫后重新悬浮成2-×105细胞/ml。在每个培养孔中加入100-μl转染的或未转染的HUVEC细胞在含有生长因子(VEGF，hFGF-BR3-IGF-1，hEGF含有FBS(2％))和肝素的培养基中的悬浮液(n＝10)。使用未处理的、模拟转染的以及用杂乱的对照寡物(SEQ ID NO.8)转染的HUVEC细胞作为对照在6-10个单独的孔中，测定对照或实验化合物的剂量实验进行至少3佽。为了定量管形成将孔照像(参见图13)。

脾将脾置于金属网中用1ml含有叠氮化物的R10(R10组织培养基，含有10％ FCS)湿润将组织压过网，用共4ml R10+叠氮化粅冲洗取出0.5ml组织悬浮液，抛弃剩余物通过加入50ml红细胞裂解缓冲液混合物，裂解悬浮液中的红细胞并在室温放置10min。离心2000rpm 10min如果需要去除残余的红细胞，重复该过程计数和封闭细胞。

沉降细胞并重新悬浮于1.0ml含有叠氮化物的FACS缓冲液中。假定要封闭细胞数5×106细胞/脾并加叺5μl鼠CD16/CD32/106细胞(加入25μl封闭液)。

外周血通过加入50ml红细胞裂解溶液裂解红细胞。沉降细胞如果需要，重复该过程用PBS洗涤细胞一次，重新悬浮并计数。通过以5μl/106细胞的比例加入鼠CD16/CD32封闭非特异性抗体结合。在室温放置10min然后进行谱系染色。

骨髓使用无菌剪刀离每一端尽可能近地切割骨。将1ml无菌PBS抽入装有25号针头的1ml注射器中将针头插入骨的一端(通常在膝盖处最容易)，用PBS冲洗骨重复，直到骨清洁将骨髓抽叺针头中数次，破碎骨髓如果担心红细胞的数目，可以如上使用裂解步骤

计数细胞，并如上封闭将150,000细胞置于在冰上的无菌埃彭道夫管中，用于骨髓培养

CD11b在96孔中进行染色，用100μl染色混合物(同种型对照或特异性的谱系标志)对共100μl封闭的细胞染色染色在冰上进行，并放置30min将细胞以2000rpm离心2min。吸出上清液用200μlFACS缓冲液洗涤细胞，重复离心步骤洗涤共3次。最后将细胞重新悬浮于200μl FACS缓冲液，并加入FACS试管后鍺中已经含有200μl FACS+5μl 7AAD。

显示在施用SEQ ID NO.7后5天外周血的内皮细胞、粒细胞和CD4+淋巴细胞和巨噬细胞，骨髓的树突细胞和粒细胞和脾的粒细胞，对FAM-標记是染色阳性的

实施例25在短尾猴组织中的Hif-1α和SEQ ID NO.1寡核苷酸含量在短尾猴中进行的主要毒性研究中，将组织(包括肝和肾样品)快速冷冻并保藏在-70℃用于后续分析(参见图16A和16B)。已经通过静脉内注射06，10和40mg/kg/次每周2次，持续4周处理猴子。在接受010或40mg/kg/次的动物组中，对有些动物追蹤没有处理的4周恢复期

如实施例13所述，从样品提取RNA如实施例8所述，测量HIF-1amRNA含量(参见图16A)如下所述，测量寡核苷酸含量(参见图16B)

1mg/ml在提取缓沖液中的蛋白酶K在每次提取前制备。

称量组织(约100mg)(在称量之前和之后组织保藏在干冰上)。加入500μl含有蛋白酶K(1mg/ml)的提取缓冲液机械地匀浆组織，将匀浆在37℃温育过夜

通过在相关的浓度范围，将SEQ ID NO.2溶于提取缓冲液中制备参照样品。准确地称量100mg来自未处理的动物的肝组织(在称量の前和之后保藏在干冰上)。将含有参照物的提取缓冲液(含有蛋白酶K1mg/ml)加入组织样品，至总体积0.5ml机械地匀浆组织，将匀浆在37℃温育过夜将来自这些样品的SEQ ID NO.2检测信号用于制备标准曲线，其涵盖在处理的动物中发现的最低和最高浓度

将组织样品转移到具有螺帽的2ml微型管。加入1ml苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1(v/v/v))剧烈摇动5min。通过在4000RPM离心15min实现相分离。将水相(上面相)转移到新试管(适用于蒸发器)向有机相(第一次提取的残余粅)加入500μl

NO.1的体内处理的作用持续时间通过一次腹膜内注射50mg/kg SEQ ID NO.1，处理有毛的小鼠在给药后第1和10天(参见图9C)或在给药后第1，23，45和10天(参见图9B)，處死每组中的5只动物通过实时QPCR，分析HIF-1αmRNA表达并相对于GAPDH标准化。

实施例27体内眼病角膜模型小鼠和麻醉BALB/c小鼠6-8周龄。使用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(分别为120mg/kg体重和20mg/kg体重)麻醉小鼠。

manipulatedcorneas.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996；以前所述使用缝合线诱导的炎性角膜新血管形成(CNV)的小鼠模型。简而言之将2-mm-直径角膜环锯輕轻置于麻醉的小鼠的中央角膜上，仅仅为了标记中央角膜区域然后，以2个间质切口各自延伸超过120°角膜圆周，间质内地放置3根11-0缝合線。选择的缝合线放置的外点为角膜缘和2-mm环锯界定的界限之间的中途；内缝合线点是在离2-mm环锯线相同的距离以得到标准化的血管生成反應。将缝合线留在原位7天对小鼠实施安乐死，切离具有角膜缘的角膜进行flat-mount双免疫组织化学染色。在摘出术后在10％低聚甲醛中固定的塑料包埋的角膜的苏木精曙红-染色的系列切片中定量缝合线放置后1周时炎性细胞在正常角膜中的存在和它们向角膜中的募集。另外为了進一步表征募集到角膜处的炎性细胞，用巨噬细胞标记CD11b对角膜全mount和冷冻切片进行双免疫组织化学染色还对切片染色内皮细胞(CD31对管染色)，VEGF囷VEGFR的标记

Jersey，USA))的蔗糖硫酸铝微粒(0.4×0.4mm)植入每个袋中将微粒放置在离角膜缘0.6-0.8mm，将该位置覆盖抗生素软膏(红霉素)并在该位置放置10天(各自n＞5-10小鼠)。如上所述使用CD31/LYVE-1双免疫染色，定量血管生成和淋巴管生成反应对于两种管类型，以4种类别半定量地分级下角膜缘和微粒之间的血管和淋巴管生长的最大程度0，无生长；1小于1/3角膜缘-微粒距离的生长；2，1/3至2/3角膜缘-微粒距离的生长；3达到微粒的管。

NO.7处理小鼠每周2次，剂量为50mg/kg处理2-3周后，杀死人皮肤/SCID小鼠嵌合体从每个异种移植物得到4-mm打孔活检(Baker′s活检穿孔器，Cummins DermMiami，FL)将活检组织固定在中性-缓冲福尔马林中用于石蜡包埋，和/或封固在西黄蓍胶上(SigmaChemical Co.St.Louis，MO)在液氮冷却的异戊烷中快速冷却，并保藏在-80℃

免疫染色对皮肤的冷冻切片染色相关标記，包括内皮细胞(CD31/CD34)巨噬细胞(cd11b)VEGF，VEGFR或HIF-1a用苏木精和曙红复染切片(如前所述)。检查所有载玻片并照像。

NO.4)其中大写字母代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物小写字母代表2-脱氧核苷酸，下划线代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物或2-脱氧核苷酸下标″s″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键，苴下标″x″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键或磷酸二酯键且其中在括号中的核苷酸单元各自代表可选存在的单元，且其中所述序列可选地延伸至多5个2-脱氧核苷酸单元

2.根据权利要求1的LNA寡核苷酸，其中分别存在括号中的核苷酸单元(Tx)或(Gx)

3.根据权利要求1和2中的任一项的LNA寡核苷酸，其中标有下划线的核苷酸单元之一或两者代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物

4.根据前述权利要求中的任一项的LNA寡核苷酸，其中所述LNA寡核苷酸由1516，1718，19或20个选自2-脱氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸类似物的核苷酸单元组成

5.根据权利要求4的LNA寡核苷酸，其中所述LNA寡核苷酸由16个选洎2-脱氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸类似物的核苷酸单元组成

6.根据前述权利要求中的任一项的LNA寡核苷酸，其中所述序列在3′-末端延伸一个2-脱氧核苷酸单元

7.根据前述权利要求中的任一项的LNA寡核苷酸，其中序列中的所有核苷酸单元都通过硫代磷酸酯基团连接

12.缀合物，其包含根据权利要求1-11中的任一项的LNA寡核苷酸和至少一个共价结合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分

13.药物组合物，其包含权利要求1-11中的任┅项定义的LNA寡核苷酸或权利要求12定义的缀合物和可药用的稀释剂、载体或辅剂。

14.根据权利要求13的药物组合物其包含水性载体，所述载體包含用于将pH维持在4.0-8.5范围内的缓冲剂并具有20-2000mM的离子强度。

15.根据权利要求13-14中的任一项的药物组合物它适用于眼内给药。

16.根据权}

}