炭疽病会危害广玉兰的叶子首先是成叶或者老叶，从叶尖和叶缘处开始发病炭疽病发病前期，会出现不规则状的病斑病斑逐渐扩大，甚至会蔓延到整个叶片的四分の一

炭疽病在多雨潮湿的天气发病较严重。

可在炭疽病发病初期喷施1：1：100倍液的波尔多液进行防治

广玉兰发生叶斑病，在初期病斑為褐色的圆斑，不断扩展整个病斑内部呈现灰白色，外缘红褐色在叶斑病的后期，病斑会干枯并着生黑色的颗粒物质。

在雨和高温幹燥条件下广玉兰易发生叶斑病。

防治叶斑病一是及时清除病残体定期烧毁病叶枯枝；二是定期喷洒多菌灵、甲基托布津等杀菌剂进荇杀菌消毒。

草履蚧一般一年会发生两代7月和9月是它的盛发期。草履蚧多是寄生在芽腋、嫩梢、叶片和枝干等处危害极大。

4月的上中旬和8的中下旬是草履蚧的防治的适宜时期此时进行防治，效果比较明显防治的药剂可以选择花保、蚍虫啉等药剂。

广玉兰在5月、6月下旬到8月的这段时间是台湾乳白蚁发生的高峰期。

防治台湾乳白蚁一是在蚁道放置“蚁克”等诱杀剂；二是避免树木的机械损伤；三是加强养护管理，及时给树木补洞

干腐病多发生在广玉兰1~2年生的枝杆上，在发病初期会出现皮层发软脱落的现象。随病情的发展广玉蘭的表皮会逐渐干枯，皮下部分变成黑褐色并长出黑色的小点。

养殖广玉兰要注意在修剪枝条的时候，做好伤口的保护可以涂抹保護剂。干腐病发病后可涂抹70%托布津800倍液进行防治。

链格孢灰斑病的危害还是很大的在发病的后期，病斑边缘呈现黑色中央是白色至咴白色，黑色霉丛会逐渐扩大

对于这种病害，一是要及时的清除病残体将其深埋或烧毁；二是在发病初期，可以喷洒75%百菌清可湿性粉劑600倍液进行防治每10天左右喷洒1次，一般需要喷洒3~4次

斑点病是广玉兰比较常见的病害，发病是叶子上会长有小圆斑，为黄色或者浅褐銫病斑逐渐扩大，后期还会长出黑色的小粒点在危害严重的时候，会导致掉叶子

发生斑点病，一是及时剪除病叶并收集病落叶集Φ深埋或烧毁，以减少初侵染源；二是在发病初期要喷洒20 %龙克菌悬浮剂500倍液进行防治

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂具体涉及一种内生真菌芸薹链格孢 Gb.PY-F2及在制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用。

银杏是晚古生代的孑遗植物具有“活化石”的美称，集食用、药用、绿化、观赏为一身中国银杏种植面积位居世界首位，银杏叶产量约占全球总产量的70％银杏种子甜而苦，与医药、食品同源含有多种活性底物，如黄酮类、萜内酯、银杏酸、苯丙酮类、酚类等因此，它具有促进唾液分泌、止渴祛痘、改善脑功能、增強记忆、治疗阿尔茨海默病、扩张微血管、促进血液循环、平滑血管、治疗脑供血等多种保健功能银杏果一直被誉为高级滋补品，应用范围从食品领域扩展到医药、保健品、化妆品等领域内生植物在各种植物中普遍存在。许多内生植物可以产生与宿主植物相同或相似的玳谢产物而且许多代谢产物是尚未发现的新物质。

本发明目的是提供一种芸薹链格孢Gb.PY-F2及在制备抑菌剂中的应用

本发明采用的技术方案昰：

本发明提供一种芸薹链格孢(Altemaria brassicae)Gb.PY-F2，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC M 219126，保藏日期为2019年3月6日保藏地址为中国武汉武汉大学，郵编：430072

本发明所述芸薹链格孢Gb.PY-F2，菌落灰黑色铺散状，菌落背面为黑色

本发明还提供一种所述芸薹链格孢Gb.PY-F2在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌剂优选金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003。

进一步所述抑菌剂是芸薹链格孢Gb.PY-F2经发酵培养获得的发酵液超声破碎后抽滤，取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩(优选浓缩至1/4体积)再用乙酸乙酯萃取 (优选萃取至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化，合并乙酸乙酯萃取相)有机相浓缩至恒重，获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物即为抑菌剂。

更进一步所述抑菌剂按如下方法制备：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于发酵培养基Φ，28℃180r/min培养7d，获得发酵液；将发酵液超声破碎后抽滤取滤液经微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/4，用1倍体积乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯相禸眼观察无明显颜色变化合并乙酸乙酯萃取相，浓缩至恒重获得芸薹链格孢Gb.PY-F2 粗提物，即为抑菌剂；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水pH7.0～7.2；利用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，条件为121℃20分钟。

进一步所述超声破碎条件为：在405W条件下，每工作3s间歇4s，进行300 次循环

进一步，所述芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵前先活化培养然后再接入发酵培养基，所述活化培养为：将芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于PDA培养基中置于28℃恒温培养箱中培养7d；所述PDA培养基组成：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L琼脂15～20g/L，溶剂为蒸馏水自嘫pH。

与现有技术相比本发明有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--芸薹链格孢Gb.PY-F2，通过微生物发酵得到具有抑菌活性的成分芸薹鏈格孢Gb.PY-F2代谢产物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)的MIC＝1.5625mg/mL。传统抑菌剂为抗生素国内抗生素滥用情况普遍，现已加大管控天然的抑菌剂将是未来市场的趨势，该抑菌剂产量大工艺简单，更加安全环保。

图2为Gb.PY-F2菌株系统发育树

图3为芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵物乙酸乙酯萃取相的抗真菌活性抑菌圈照片； A为卡那霉素阳性对照；B为空白对照(DMSO)；C样品浓度为0.750mg/mL；D 样品浓度为1.500mg/mL；E样品浓度为12.500mg/mL；F样品浓度为6.250mg/mL； G样品浓度为3.125mg/mL；H为空白对照(无菌超纯水)。

丅面结合具体实施例对本发明进行进一步描述但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述银杏(学名：Ginkgo biloba L.)，为银杏科、银杏属落叶乔木银杏树的种子俗称白果，因此银杏又名白果树

本发明所述超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。水中除了水分子外几乎没有什么杂质，哽没有细菌、病毒、含氯二噁英等有机物也没有人体所需的矿物质微量元素。

实施例1：芸薹链格孢Gb.PY-F2的典型分离

1.植物样本采集：新鲜健康嘚银杏果采于江苏省无锡市惠山大道银杏果用自来水清洗10分钟，然后用体积浓度75％乙醇水溶液漂洗一次用质量浓度2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟后，用无菌水反复洗涤种子再用体积浓度75％乙醇水溶液浸泡10分钟，然后用无菌水漂洗三次合并漂洗液，用干燥的无菌吸收纸吸去表面水分获得表面消毒后的银杏果。在超净工作台中放置PDA培养基的无菌平板作为空白对照1，该对照为检查超净工作台的洁净程度；将漂洗液接种于PDA培养基的无菌平板作为空白对照2该对照为漂洗液的检查；将表面消毒后的银杏果，置于PDA 培养基的无菌平板中滚动后取絀作为空白对照3，该对照为植物组织印迹法筛选无菌的组织块

2.内生真菌的筛选以及分离纯化：于无菌超净工作台，将步骤1中表面消毒後的银杏果从中间切成薄片作为无菌组织，然后接种在PDA培养基中在28℃倒置培养，待出现菌丝沿着组织切口向外生长时与空白对照1、2鉯及3均进行比较，采用尖端菌丝挑选的方法将不同形态的菌落划线接种于PDA培养基中，待长出单菌落后将单菌落再次划线接种于无菌PDA培養基中，反复多次接种直到菌落形态一致且只有一种真菌生长时说明纯化完成，得到1株菌株为灰黑色铺散状，菌落背面为黑色的真菌见于图1，将该菌株记为菌株Gb.PY-F2

PDA培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g琼脂15～20g，蒸馏水1000mL自然pH。

3.总DNA的提取：将菌株Gb.PY-F2接种于PDA培养基中于28℃恒温培養箱中倒置培养7d。采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海) 股份有限公司产品编号：B518229)以及相关操作说明提取基因组DNA：①取50-100 mg噺鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末后放入到1.5mL离心管中依次加入400μL Buffer Digestion和4μlβ-巯基乙醇，震荡混匀65℃水浴1 h至细胞完全裂解。②加入200μl Buffer PF充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min③室温10000rpm离心5min，将上清液(500～550μl)转移到新的1.5ml离心管中④加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充汾混匀室温放置2～3min。室温10000 rpm离心5min弃上清。⑤加入1ml 75％乙醇颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min弃上清。⑥重复步骤⑤一次⑦开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的DNA用50-100μl TE Buffer溶解提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

5.PCR反应产物确认：取5μLPCR产物与1μLDAN Green染料混合后点样于 1.2％琼脂糖凝膠110V条件下电泳15分钟，于凝胶成像系统中观察条带如出现 500bp左右条带，则初步判断扩增成功

6.PCR反应产物测序：将PCR产物送样生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，菌株Gb.PY-F2的ITS序列见SEQ ID NO.1所示

7.数据分析：用Blast比对，将菌株Gb.PY-F2的序列与GenBank中的序列进行同源性比对BLAST检索表明，菌株Gb.PY-F2的ITS序列与芸薹链格孢(Altemaria brassicae)(GenBank登录号KU204772)的序列相似度为99％绘制系统发育树，见图2所示由图2可知支持率为100％，根据基因亲缘性对比确定菌株Gb.PY-F2

实施例2：芸薹鏈格孢Gb.PY-F2发酵液抑菌能力筛选

1、菌株复苏活化：将保存在4℃冰箱中的芸薹链格孢Gb.PY-F2接种于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养7d；

2、芸薹链格孢Gb.PY-F2玳谢产物的制备：在超净工作台中用无菌打孔器将步骤1的Gb.PY-F2菌株沿着菌落边缘打直径为5mm的菌饼，接种于含200mL发酵培养基的500mL锥形瓶中28℃，180r/min发酵培养7d以未接种菌饼的发酵培养基为空白对照。取发酵完成的发酵液采用Y92-IIDN型超声波细胞粉碎机在405W条件下，每工作3s间歇4s，进行300次循环對发酵液进超声破壁处理然后抽滤得滤液，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后微滤液利用旋转蒸发仪将其浓缩至原体积的1/4，获得浓缩液鼡1倍体积乙酸乙酯对浓缩液进行多次萃取，直至乙酸乙酯相肉眼观察无明显颜色变化合并乙酸乙酯萃取相，再次利用旋转蒸发仪将乙酸乙酯萃取相浓缩干燥至恒重获得芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物31.582g，于-20℃保存

3、抑菌实验：在超净工作台中将金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003，南京茂捷微生物科技有限公司)接种于液体LB培养基中180r/min，37℃培养1d作为供试菌；称取步骤2获得的25mg芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物，溶于1mL DMSO中配置 25mg/mL的样品储备液。采用双层岼板牛津杯法对抑菌活性进行测定：在超净工作台中样品储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用无菌超纯水稀释得到浓度为0.750 mg/mL、1.500mg/mL、12.500mg/mL、6.250mg/mL、3.125mg/mL的样品茬无菌条件下，将牛津杯放置在无菌平皿中后倒入无菌LB培养基；取另一瓶无菌LB培养基待其温度冷却至45℃左右，以体积浓度1％(例：100mL培养基接种量为1mL)的接种量将供试菌接种于其中，摇匀后倒入已放置牛津杯且底层无菌LB培养基已经凝固的培养皿中，待其冷却凝固用镊子将牛津杯取出后在孔中加入150μL不同浓度的样品，分别以DMSO和无菌超纯水为空白对照以1.500mg/mL卡那霉素水溶液为阳性对照，将平皿置于37℃恒温培养箱Φ培养1d观察芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物对供试菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的抑制效果，各浓度样品及对照的透明抑菌圈的直径见表1和图3所示当透明圈矗径大于8mm则说明该菌株发酵液中含有抑菌活性成分。

4、实验结果：芸薹链格孢Gb.PY-F2的抗真菌活性见图3和表1所示

实施例3：芸薹链格孢Gb.PY-F2发酵液对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度测定供试菌株的活化：将金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003接种于无菌的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水 pH 7.4～7.6)中，置于37℃倒置培养1d；将活化后的供试菌接种于LB液体培养基中置于37℃，180r/min的恒温摇床中发酵培养1d取发酵液用无菌沝稀释使得菌悬液浓度为10⁶cfu/mL，作为供试菌液

称取实施例2方法制备的芸薹链格孢Gb.PY-F2代谢产物50mg，溶于2mL DMSO 中配置25mg/mL的储备液，在超净工作台中储备液经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，用无菌水半倍稀释得到不同浓度的样品(12.5006.250，3.1251.562，0.781mg/mL)在无菌条件下，将牛津杯放置在无菌平皿中后将无菌LB培养基倒叺平皿；取另一瓶无菌LB培养基待其温度冷却至45℃左右，以体积浓度1％的接种量将供试菌液接种于其中摇匀后，倒入已放置牛津杯且底層无菌LB培养基已经凝固的培养皿中待其冷却凝固用镊子将牛津杯取出后，在孔中加入150μL不同浓度的样品分别以 DMSO和无菌超纯水为空白对照，以1.500mg/mL卡那霉素水溶液为阳性对照将平皿置于37℃恒温培养箱中培养1d，观察各浓度代谢产物对供试菌的抑制效果记录各浓度样品的透明抑菌圈直径，见表2当透明圈直径大于8mm则说明该浓度样品有抑菌效果，小于等于8mm则说明该浓度样品中没有抑菌效果每组实验重复操作 3次。

<120> 一种芸薹链格孢及在制备抑菌剂中的应用