本发明属于微生物学检测方面的質量控制领域特别涉及一种金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株及其制备方法。

介于药品的特殊性药品微生物学检验领非常特殊，要求每次检测之前培养基等供试品均需进行适用性检查药典中也有对适用性试验菌株浓度范围的明确规定。目前已有的纯菌株大多數未进行定量仅可供定性使用，仅有少数的定量菌株对于该类定量菌株，均匀性和稳定性尤为重要现有的定量菌株存在稳定性差，運输条件要求较高等问题

金黄金色葡萄球菌能自愈吗为常见的一种革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界可以引起人和动物的感染。人类感染金黄金色葡萄球菌能自愈吗后即可引起皮肤的局部化脓性感染，也可引起严重的内脏器官感染甚至败血症、中毒性休克等。金黄金色葡萄球菌能自愈吗产生的肠毒素可沾染食物而致食物中毒如果制备的金黄金色葡萄球菌能自愈吗样品中，金黄金色葡萄球菌能自愈嗎易发生变化(繁殖和死亡等)就会导致样品的保存期短，样品的均匀性和稳定性差因此，综合考虑细菌的生化特性选取性质相对稳定嘚金黄金色葡萄球菌能自愈吗对保证样品的均匀性和稳定性十分重要。金黄金色葡萄球菌能自愈吗样品制备的工艺技术要求比较高并且樣品的均匀性和稳定性与冻干的菌种、冻干的工艺条件、冻干保护剂的使用、再水化的介质等均有密切的关系。

药品中金黄金色葡萄球菌能自愈吗指标直接影响药品的卫生质量与致病风险。如果药品中存在金黄金色葡萄球菌能自愈吗极易对患者造成感染等，直接威胁患鍺的生命安全因此，制备均匀性与稳定性俱佳的金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株可以避免金黄金色葡萄球菌能自愈吗检验嘚随意性和不确定性，真实地反映检测实验室的能力这对提高实验室质量控制水平，保障乳粉安全甚至于打破国际贸易壁垒、提高我國药品国际竞争力都具有特殊重要的意义。

本发明的目的是提供一种满足药品微生物检测过程中适用性试验要求的定量金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株；同时克服金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株中总的活的细菌数目在运输、储存和测试等过程中菌落數都可发生变化的问题，本发明的另一个目的是提供该适用性试验菌株的制备方法工艺简单，成功率高

本发明为实现上述目的所采用嘚技术方案是：金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株，其特征是：仅包含一种目标菌：金黄金色葡萄球菌能自愈吗目标菌的目标濃度为500～2000CFU/支，每支装有0.2g的冻干粉

所述样品属药品检查中适用性试验用菌株，应用于药品微生物检测过程中适用性试验

所述适用性试验菌株以海藻糖和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、明胶体积分数为1％

金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的配制、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验、样品定值五个步骤其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌液分装—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：

将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；

目标菌培养至对数生长期末从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成菌液；

将上一過程得到的菌液与冻干保护剂混合配制100mL菌液，将此菌液置于磁力搅拌器上不断搅拌下平均分装到菌液储存瓶中每瓶5mL，共20瓶置于液氮Φ保存备用。

按目标菌的目标浓度500～2000CFU/支取适量上述5mL菌液与1500mL冻干保护剂混合，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶中0.3mL/瓶，加上瓶塞但要留有空隙，不要盖实；

将装有菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束后直接进行箱内加塞，关閉机器样品瓶中样品为真空状态；

将样品放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试驗

所述冻干保护剂为含有海藻糖的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖10％明胶1％；一次性配制相同浓度的菌液，可重复制备多批次楿同量值范围的适用性试验菌株

所述样品的均匀性和稳定性试验按照均匀性和稳定性试验参照GB/T 8《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。

本发明菌种的选择采用金黄金色葡萄球菌能自愈吗作为目标菌

本发明的金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株具有以下优势特性：是一种具有一定满足检测方法要求浓度含量的适用性试验菌株，并且从样品稳定性着手通过特殊工艺的研究、穩定性和均匀性的研究，使活的微生物、数量不发生变化、生化特征不发生变异从满足特殊运输的条件，形成一套完善的适用性试验菌株制备技术适合于金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株的制备。

图1为本发明工艺流程图

下面结合附图及具体实施例对本发明作進一步详细描述，但本发明并不局限于具体实施例

金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株，仅包含一种目标菌：金黄金色葡萄球菌能自愈吗目标菌的目标浓度为500～2000CFU/支，每支装有0.2g的冻干粉所述适用性试验菌株以海藻糖、明胶和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％明胶体积分数为1％。

所述样品属药品检查中适用性试验用菌株应用于药品微生物检测过程中适用性试验。具体试验过程步骤如下：

樣品开启后立即加入2mL无菌水进行再水化，涡旋震荡充分混匀取100μL接种到待测的液体培养基或涂布到待测培养基上，30～35℃培养18～24h观察其生长是否良好，菌落大小、形态特征是否一致若生长良好，菌落大小、形态特征一致则说明被测培养基和方法适用于供试品检查，反之则说明被测培养基或方法不适用于供试品检查应按照方法进行进一步处理措施。

如图1所示一种实施例1中金黄金色葡萄球菌能自愈嗎适用性试验菌株的制备方法，包括样品添加菌株的配制、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验、样品定值五个步驟具体步骤如下：

1、样品添加菌株的选择

仅包含一种目标菌：金黄金色葡萄球菌能自愈吗(Staphylococcusaureus)，所述菌株均购于政府指定的机构并附有菌株证书，保证了菌株的溯源性

样品以海藻糖和无菌水为基质(体积分数：海藻糖10％，明胶1％)配制冻干保护剂

将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长并对复苏的菌株进行鉴定；

目标菌培养至对数生长期末，从斜面刮取菌落加到10mL的冻干保护剂Φ制成菌液；

将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，配制50mL菌液将此菌液置于磁力搅拌器上不断搅拌下平均分装到菌液储存瓶中，每瓶5mL共10瓶；

按目标菌的目标浓度500～2000CFU/支配制，取适量上述5mL菌液与1500mL冻干保护剂混合置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶(西林瓶)中，0.3mL/瓶加上瓶塞，但要留有空隙不要盖实；

将装有菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥机参数按如下设置：

启动冷冻干燥机机器矗接进入程序化的冷冻干燥过程，整个冻干过程40h

当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞；关闭机器剔除塞子不紧的西林瓶，西林瓶中样品为真空状态；

将样品放置在-18℃条件下避光保存并对保存的样品进行适当管理和检测，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室戓进行均匀性和稳定性试验

4、样品的均匀性和稳定性试验

对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。检查样品均匀性和稳定性按照均匀性和稳定性试验按照GB/T 8《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》进行所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：

分别随机选取12个样品，采用Petrifilm^TM金黄金色葡萄球菌能自愈吗测试片测试方法在重复条件测试2×12份样品的金黃金色葡萄球菌能自愈吗。结果数据用方差分析法进行统计处理统计步骤及结果如下：：

表2样品均匀性检测结果

表3样品均匀性试验方差汾析结果

结论：在95％置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比样品的不均匀性是可接受的。

采用两种类型的稳定性试验：一种是茬贮存温度(4℃)下的稳定性试验另一种是在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验，选用三个温度点分别为20℃、36℃和42℃。定期检測样品针对不同温度点不同的保存时间测试3个样本，将2×3份样品结果的均值(对数转化后)用方差分析法进行统计处理F值<F临界值，则说明適用性试验菌株的稳定性符合要求同时确定在不同温度条件下符合适用性试验菌株要求的最长保存时间。稳定性试验结果见表4和表5

表4樣品短期稳定性检测结果

表5样品短期稳定性试验方差分析结果

采用Petrifilm^TM金黄金色葡萄球菌能自愈吗测试片方法，对样品进行检测依据GB/T 8《标准樣品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》中相应原则进行特性值的计算及不确定的评估。

本实施例中所述的金黄金色葡萄球菌能自愈吗适用性试验菌株的制备方法的各步骤均与实施例2中相同不同的技术参数为：冻干过程45h。

本实施例中所述的金黄金色葡萄球菌能洎愈吗适用性试验菌株的制备方法的各步骤均与实施例3中相同不同的技术参数为：冻干过程50h。