检测牛传染性胸膜肺炎血清抗体間接ELISA方法的建立及初步应用

Pleuropneumonia,CBPP)的病原,具有极高传染力感染牛主要表现为体温升高呈稽留热,呼吸困难等症状,曾给我国造成巨大经济损失。我國虽已消灭CBPP,但该病还在周边国家流行.根据OIE要求,我国每年进行全国范围的血清学监测竞争性酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA,ciELISA)是全球唯一的检测CBPP商品化试劑盒。因检测样本量大,商品试剂盒昂贵且完全依赖进口,这些因素阻碍了我国对CBPP的防控因此,研制国产CBPP血清抗体试剂盒具有重大意义。在本研究中根据Mmm的基因组序列利用生物信息学软件对进其行了对比分析,选定5种膜相关脂质蛋白即P35、P42、P46、P47、P50利用原核表达系统表达这五种蛋白並纯化,然后对其特异性与反应原性进行研究。特异性研究显示重组蛋白P35(rP35)蛋白能明显区分CBPP阳性血清与牛支原体、牛鼻支原体、牛无乳支原体嘚阳性血清,反应原性研究显示用CBPP阳性血清作为一抗进行Western blot和Dot-blot试验,Dot-blot试验结果为阳性,证明rP35可能是Mmm特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,且具有反应原性以rP35作为包被抗原,建立了rP35-iELISA方法,分别对包被条件、待检血清反应条件、封闭条件、二抗作用条件、显色条件、cut-off值等反应条件进行择优筛選,确定该方法最佳的反应条件为:包被浓度ki.gjlnu.