本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2014年2月21日提交的临时美国专利申请号61/942,752和2014年9月12日提交的临时美国专利申请号62/049,826的权益。每个优先权申请都以引用的方式整体并入本文。

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本发明涉及能够针对Trop-2表达细胞诸如Trop-2⁺癌细胞诱导免疫应答的靶向Trop-2和CD3的双特异性抗体的组合物及其使用方法。优选地，将双特异性抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，所述其他治疗剂诸如抗体-药物缀合物、干扰素诸如诸如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ或检查点抑制剂抗体。更优选地，双特异性抗体是与干扰素-α组合施用的抗-Trop-2x抗-CD3抗体。最优选地，抗-Trop-2抗体是hRS7抗体。组合物和方法是用于治疗Trop-2⁺肿瘤，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌、乳房癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌和前列腺癌，更优选地胰腺癌或胃癌。在优选实施方案中，双特异性抗体制备为DOCK-AND-LOCK^TM复合物，其中使用来自人蛋白激酶A(PKA)调控亚单位的二聚化和对接结构域(DDD)部分与来自AKAP(A-激酶锚定蛋白质)的锚定结构域(AD)部分之间的结合相互作用来将组分连接在一起。然而，制造双特异性抗体复合物的其他方法是已知的并且可使用。双特异性抗体将效应子T细胞、单核细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞重定向至患病靶细胞或组织并且诱导针对靶的免疫应答。

使用双特异性抗体(bsAb)重定向效应子T细胞以便靶向杀死肿瘤细胞已经显示出了可观的临床前和临床前景(参见，例如，Topp等人，2012,Blood 120:5185-87；Bargou等人，2008,Science 321:974-77)。迄今为止所开发的双特异性抗体含有对用于T-细胞募集和活化的CD3具有特异性的第一结合位点和所靶向的疾病相关联抗原如CD19的第二结合位点(Bassan,2012,Blood 120:5094-95)。双特异性抗体使CD3⁺T细胞与所靶向的疾病细胞直接接触并且诱导细胞介导的细胞毒性(Bassan,2012)。已经报告抗-CD3X抗-CD 19双特异性抗体可在患有MRD⁺ALL的大约70％成年患者中以极低浓度来产生完全并且持久的分子缓解(Topp等人，2012,Blood 120:5185-87)。识别T细胞上的神经胶质瘤和CD3表位的双特异性抗体已经成功用于治疗人患者的大脑肿瘤(Nitta等人Lancet 1990；355:368-371)。

产生双特异性抗体的许多方法是已知的(参见，例如美国专利号7,405,320)。双特异性抗体可通过四价体瘤方法产生，所述方法包括使两种不同杂交瘤融合，每种杂交瘤产生识别不同的抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello,Nature 1983；305:537-540)。融合的杂交瘤能够合成两个不同重链和两个不同轻链，其可随机缔合以得到具有10个不同抗体结构的异源群体，其中只有一种(占总抗体分子的1/8)具有双特异性，并且因此必须进一步从其他形式中纯化。融合杂交瘤的细胞基因稳定性通常弱于亲本杂交瘤，使得生产细胞系的产生更成问题。

产生双特异性抗体的另一种方法使用异双官能交联剂来化学系拴两个不同单克隆抗体，以使得所得混合缀合物结合至两个不同靶标(Staerz等人Nature 1985；314:628-631；Perez等人Nature 1985；316:354-356)。通过此方法产生的双特异性抗体基本上是两个IgG分子的异源偶联物，其缓慢扩散至组织中并且从循环中快速移除。双特异性抗体也可通过将两个亲本单克隆抗体中的每一个还原成相应的半分子，然后混合并允许再氧化以获得杂合结构来产生(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:)。替代方案包括使用适当连接子使两种或三种经过单独纯化的Fab'片段化学交联。所有这些化学方法由于较高制造成本、繁重的生产过程、大量的纯化步骤、产量低(<20％)和不均匀的产物而对于商业开发是不合需要的。

通过重组DNA技术产生的抗体的离散V_H和V_L域可彼此配对以形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利号4,642,334)。然而，这类非共价缔合分子在生理条件下稳定不足以具有任何实际用途。可将同源V_H和V_L结构域与具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽连接子连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。通过改变连接子长度来制造基于scFv的多价多特异性的药剂的方法公开于美国专利号5,844,094、美国专利号5,837,242和WO98/44001。常常与产生基于scFv的多价多特异性的药剂相关联的常见问题是较低表达水平、不均匀产物、在溶液中不稳定从而产生聚集体、在血清中的不稳定和削弱的亲和力。

靶向CD3和CD19的若干双特异性抗体正在临床开发中。被称为的基于scFv的双特异性抗体构建体(双特异性T-细胞衔接子)使用含有2个抗原结合特异性的单个多肽，每个抗原结合特异性由经由挠性连接子以串联方式连接的同源VH和VL贡献(参见，例如，Nagorsen等人，2009,Leukemia&Lymphoma 50:886-91；Amann等人，2009,J Immunother 62:1933-43)。和由于其尺寸较小(约55kDa)而展现快速血液清除率，从而需要频繁施用以保持双特异性抗体的治疗水平。

迄今为止已经通过批准IFN-α2用于治疗毛细胞白血病、慢性髓性白血病、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、AIDs相关卡波西肉瘤和慢性乙型和丙型肝炎；IFN-β用于治疗多发性硬化；和IFN-γ用于治疗慢性肉芽肿疾病和恶性骨硬化而验证了IFN的疗效。尽管存在关于这一组自分泌和旁分泌细胞因子的大量文献，但仍阐述其在健康和疾病中的功能，包括临床引入的更有效和更新颖的形式(Pestka,2007,J.Biol.Chem

抗体-药物缀合物(ADC)是一类有效的治疗构建体，其允许将细胞毒性剂靶向递送到靶细胞诸如癌细胞。由于靶向功能，相比于相同的全身递送的药剂，这些化合物显示出显著更高的治疗指数。已经开发出完整的抗体或抗体片段(诸如scFv)的ADC。抗体或片段经由连接子连接至药物的一个或多个拷贝上，该连接子在生理条件下是稳定的，但是一旦在靶细胞内可能裂解。批准用于治疗用途的ADC包括用于AML的吉姆单抗奥佐米星(后来从市场退出)、用于ALCL和霍奇金淋巴瘤的贝伦妥单抗维多汀以及用于HER2阳性转移性乳腺癌的曲妥单抗安坦辛(trastuzumab 12:329，临时美国专利申请61/761,845.)。由于ADC用作具有减小的全身性毒性的有效的抗癌剂的潜力，它们可单独或作为辅助疗法使用来减少肿瘤负荷。

免疫疗法的另一个有前景的方法涉及使用针对免疫检查点蛋白质的拮抗性抗体(例如，Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer12:252-64)。免疫检查点作为用于免疫系统功能的内源性抑制途径起作用，该内源性抑制途径用以保持自体耐受性并且调节对抗原刺激的免疫应答的持续时间和程度(Pardoll,2012)。然而，看起来肿瘤组织和可能某些病原体可指派(co-opt)检查点系统以降低宿主免疫应答的有效性，从而导致肿瘤生长和/或慢性感染(参见，例如，Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer Res 19:4917-24)。针对若干检查点蛋白质(CTLA4、PD1、PD-L1)的抗体正进行临床试验并且针对耐受标准治疗的肿瘤已显示意料不到的功效。

需要可产生具有更长T_1/2、较好药代动力学性质、增加的体内稳定性和/或改善的体内功效的改进的双特异性抗体复合物的方法和组合物。存在对组合疗法的进一步的需要以改善涉及针对各种疾病诸如Trop-2⁺癌诱导免疫应答的治疗的功效。

本发明涉及使用双特异性抗体治疗有关Trop-2+细胞诸如Trop-2⁺癌细胞的疾病。Trop-2在多种类型实体肿瘤中过表达，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠和直肠癌、膀胱癌、乳房癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、肾癌和前列腺癌。优选地，使用双特异性抗体治疗胃癌或胰腺癌。施用双特异性抗体诱导为Trop-2⁺的细胞的免疫应答。虽然Trop-2也在一些正常组织中过表达(例如，Stepan等人，2011,J 59:701-10)，但以下实例展示可在动物模型系统和人受试对象两者中，以仅可耐受的毒性体内施用抗-Trop-2抗体。在其他优选实施方案中，将双特异性抗体施用到受试对象诱导针对Trop-2⁺癌细胞的免疫应答，而将细胞因子产生增加至能够诱导细胞因子释放综合征(CRS)的水平。在另选的优选实施方案中，双特异性抗体诱导Trop-2⁺癌细胞与T细胞之间细胞表面抗原的胞啃(trogocytosis)。

在另选的实施方案中，可靶向除Trop-2之外的其他肿瘤相关的抗原。可被靶向的肿瘤相关的抗原包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体特异的抗原、ART-4、B7、Ba

可用于治疗各种疾病状态的替代的抗体包括但不限于，阿昔单抗(抗-糖蛋白IIb/IIIa)、阿伦单抗(抗-CD52)、贝伐单抗(抗-VEGF)、西妥昔单抗(抗-EGFR)、吉姆单抗(抗-CD33)、替伊莫单抗(抗-CD20)、帕尼单抗(抗-EGFR)、利妥昔单抗(抗-CD20)、托西莫单抗(抗-CD20)、曲妥单抗(抗-ErbB2)、兰利珠单抗(lambrolizumab)(抗-PD

优选地，双特异性抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，诸如抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、化疗剂、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活性剂、染料以及放射性同位素。更优选地，另外的治疗剂是抗体-药物缀合物，干扰素诸如诸如干扰素α、干扰素β或干扰素λ或拮抗性检查点抑制剂抗体。最优选地，治疗剂是干扰素-α。

在以下实施例中公开的用于白细胞重定向的bsAb的示例性设计将抗-CD3scFv与抗-CD19F(ab)₂组合以形成特异性靶向B细胞的称为(19)-3s的构建体。在下文更详细地论述的将抗-CD3与针对其他肿瘤相关联抗原的抗体片段组合的其他bsAb用于各种实体肿瘤的靶向白细胞免疫疗法中。此设计的优势包括二价结合至肿瘤细胞、杜绝快速肾清除率的较大尺寸(约130kDa)和有效白细胞介导的细胞毒性。bsAb介导白细胞与同源靶细胞之间的免疫突触的形成、诱导在靶细胞存在下的白细胞活化和增殖、重定向体外靶细胞的有效白细胞介导杀灭并且抑制体内人肿瘤的生长。

优选实施方案涉及产生为三价DNL^TM复合物的白细胞重定向的双特异性抗体，其具有更长T_1/2、更好药代动力学性质和增加的体内稳定性。产生并使用DNL^TM复合物的方法是熟知的，该复合物包括结合至来自AKAP的AD部分的来自人PKA调控亚单位RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的DDD部分的二聚体(参见，例如，美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787；7,666,400；7,906,118；7,901,680；8,003,111和8,034,352，其中每一个的实施例部分以引用方式并入本文。)通过将不同效应子部分如抗体或抗体片段连接至DDD和AD部分，可构建并使用实际上包括效应子的任何组合的DNL^TM复合物。

有用的抗体可为各种同种型，优选地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选地包括人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可为嵌合人-小鼠、人源化(人框架和鼠高变(CDR)区域)或完全人，以及其变化，如半IgG4抗体(被称为“单抗体”)，如由van der Neut Kolfschoten等人(Science 2007；317:)所述。更优选地，抗体或其片段可设计或选择以包括属于特定同种异型的人恒定区序列，从而可在施用至人受试者时导致减小的免疫原性。施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，诸如G1m3、G1m3,1、G1m3,2或G1m3,1,2。更优选地，同种异型选自nG1m1、G1m3、nG1m1,2和Km3同种异型。

其他优选实施方案涉及白细胞重定向复合物与一种或多种检查点抑制剂抗体组合的组合物和/或使用。这种抗体对于检查点抑制剂功能具有拮抗性。许多这种抗体在本领域中是已知的，诸如兰利珠单抗(MK-3475,Merck)、尼鲁单抗(BMS-936558,Bristol-Myers Pharma)可在NK细胞中执行类似的功能。任何已知的检查点抑制剂抗体均可与一种或多种其他药剂组合使用。已报道具有免疫刺激抗体的组合疗法增强例如针对肿瘤细胞的功效。Morales-Kastresana等人.(2013,Clin Cancer Res Pharma)等抗-KIR抗体的组合对造血肿瘤也更有效(Kohrt等，2012)。普通技术人员应认识到目标组合疗法可以包括与作为免疫刺激性抗肿瘤或抗感染剂的多种抗体的组合。

可以组合使用的另一种药剂是干扰素。可用的干扰素在本领域中是已知的并且可包括干扰素-α,干扰素-β、干扰素-λ1、干扰素-λ2或干扰素-λ3。优选地，干扰素是干扰素-α。目标干扰素可作为游离干扰素、PEG化干扰素、干扰素融合蛋白质或缀合至抗体的干扰素来施用。

在另选的实施方案中，以上所论述的一种或多种免疫调节剂可以与抗体-药物缀合物(ADC)组合使用。ADC对于在无显著系统毒性的情况下减少肿瘤负担特别有效，并且可以用于提高由白细胞重新靶向bsAb、干扰素和/或检查点抑制剂抗体所诱导的免疫应答的有效性。有用的示例性ADC可以包括批准用于治疗性用途的ADC，包括用于AML的吉妥珠单抗(后来从市场退出)、用于ALCL和霍奇金淋巴瘤的贝伦妥单抗维多汀以及用于HER2阳性转移性乳腺癌的曲妥单抗安坦辛(Verma等人，2012,N

目标药剂可与一种或多种其他免疫调节剂组合施用以增强免疫响应。免疫调节剂可包括但不限于细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子-α(TNF)、TNF-β、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、称为“S1因子”的干细胞生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳激素、胎盘催乳素、OB蛋白质、苗勒氏管氏管抑制物质、小鼠促性腺素相关联肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管稳定蛋白、血小板反应蛋白、内皮抑素，或淋巴细胞毒素。在某些实施方案中，白细胞重定向的双特异性抗体或抗体片段可连接至免疫调节剂，如细胞因子。细胞因子复合物公开于例如美国专利号7,906,118和8,034,3522中，其中每一个的实施例部分以引用方式并入本文。

以下附图形成本说明书的一部分并包括在内以进一步展现本发明的某些实施方案。实施方案可通过参考这些附图中的一个或多个以及在本文中呈现的具体实施方案的详细说明来更好理解。

图2A.由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触形成。新鲜分离的T细胞以2.5:1的E:T比率与Daudi细胞组合。细胞在室温下用0μg/mL、1μg/mL或5μg/mL的(19)-3s处理30分钟，然后通过流式细胞术分析。抗-CD20-FITC和抗-CD7-APC分别用于识别Daudi和T细胞。共结合指示为CD20⁺/CD7⁺事件的％。用(19)-3s处理之后，45.5％流动事件是CD20/CD7双重阳性的，指示Daudi与T细胞联会。

图2B.条件如图2(A)中，但不存在(19)-3s抗体。与图2(A)相比，在无抗体的情况下，仅2％的流动事件是无抗体的CD20/CD7双阳性的。

图3C.图3A和3B的合并图像揭示绿色染色Daudi与红色染色Jurkat细胞之间的突触形成。

图3D.在不存在(19)-3s的情况下，突触形成不明显。

图4.对(19)-3s介导的Daudi和Jurkat细胞的细胞与细胞缔合随(19)-3s浓度增加而变化的剂量反应分析。

图5B.由(19)-3s介导的细胞与细胞缔合的比较。

图7A.由(19)-3s活化的T-细胞。CD69表达的上调是T-细胞活化中的较早事件。与PBMC组合的Daudi细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。Daudi细胞与相等数目PBMC的组合产生1.6％CD69+T细胞。添加3ng/mL(19)-3s诱导27％CD69+T细胞。包含与非靶向F(ab)₂融合的Okt3-scFv-AD2模块的对照构建体[(M1)-3s]和hA19-Fab-DDD2模块都不诱导T-细胞活化。

图7B.由(19)-3s活化的T-细胞。与纯化T细胞组合的Daudi细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。与未经处理的细胞混合物相比，用(M1)-3s或hA19-Fab-DDD2处理Daudi和纯化的T细胞未增加CD69+T细胞的数目(<4％)。交替地，(19)-3s诱导稳健的T-细胞活化，产生80％CD69+细胞。

图7C.由(19)-3s活化的T-细胞。将仅纯化的T细胞，用所指示抗体处理过夜，并且用抗-CD3-PE和抗-CD69-APC染色，然后通过流式细胞术分析。在通过前向相比于侧向散射对T细胞进行门控以及抗-CD3染色之后，评估CD69表达。在不添加Daudi(靶)细胞的情况下，(19)-3s未诱导CD69表达和T-细胞活化。这些结果证明(19)-3s-介导的T细胞与靶细胞之间的突触形成对于T-细胞活化是需要和足够的。

图8B.通过(19)-3s诱导T-细胞增殖。在耗竭B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖，指示靶细胞(B细胞)为T-细胞活化和增殖所需要。

图9C.使用从两个不同供体和Nalm-6癌细胞获得的PBMC或T细胞观察到一致结果。

图11A.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(14)-3s bsAb的LS174T结肠腺癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11B.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(E1)-3s bsAb的Capan-1胰腺腺癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图11C.实体肿瘤细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性。与非靶向(19)-3s bsAb相比，确定(E1)-3s和(15)-3s bsAb的NCI-N87胃癌细胞系的细胞毒性的剂量响应曲线。

图12.癌细胞系中的T-细胞重定向bsAb的体外细胞毒性数据的概述。

图13A.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。以未经处理的细胞作为对照。

图13B.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用130μg单次剂量处理细胞。

图13C.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量43μg将细胞处理3次。

图13D.使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1x 10⁶个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5x 10⁶个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量26μg将细胞处理5次。

图14A.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。NOD/SCID小鼠异种移植物如图13的图例中指示来制备。如箭头所指示来施用(19)-3s。图14A显示未经处理的对照。

图14B.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量130μg(19)-3s静脉内施用将细胞处理2次。

图14C.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量130μg(19)-3s皮下施用将细胞处理2次。

图14D.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量65μg(19)-3s静脉内施用将细胞处理4次。

图14E.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量43μg的(19)-3s，静脉内施用将细胞处理6次。

图14F.重复给药对于使用(19)-3s bsAb的Raji淋巴瘤异种移植物的体内重新靶向的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。使用每剂量43μg的对照(M1)-3s，静脉内施用将细胞处理6次。

图15A.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。NOD/SCID小鼠异种移植物用LS174T结肠腺癌来制备。只向小鼠施用T细胞而没有bsAb。

图15B.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。NOD/SCID小鼠异种移植物用LS174T结肠腺癌来制备。如指示，小鼠用(E1)-3s bsAb治疗。

图15C.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。只向小鼠施用PBMC而没有bsAb。

图15D.实体肿瘤异种移植物中的T-细胞重新靶向bsAb的体内功效。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。如指示，小鼠用(14)-3s bsAb治疗。

图16A.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制。在添加或不添加干扰素-α的情况下，小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物NOD/SCID用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗。干扰素-α以TROP-2靶向DNL^TM复合物形式添加。

图16B.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3s DNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制。在添加或不添加干扰素-α的情况下，小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物NOD/SCID用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗。干扰素-α以可购得(聚乙二醇干扰素α-2a)形式来添加。

图17.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s治疗的NOD/SCID小鼠的存活曲线。对照未被治疗或用单独干扰素-α治疗。

图18.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3sDNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制，与TF12对照进行比较。在添加或不添加干扰素-α(以形式加入)的情况下，NOD/SCID小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗，与未经处理的对照、TF12对照或单独相比较。

图19.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s治疗的NOD/SCID小鼠的存活曲线对照未经处理或经单独或单独TF12处理。

图20.在存在或不存在干扰素-α的情况下，通过(E1)-3s DNL^TM复合物的肿瘤生长的体内抑制，与TF12对照进行比较。在添加或不添加干扰素-α(以形式加入)的情况下，NOD/SCID小鼠中的NCI-N87人胃癌异种移植物用抗-TROP-2x抗-CD3bsAb治疗，与未经处理的对照、TF12对照或单独相比较。

图21.在存在或不存在干扰素-α的情况下，用(E1)-3s处理的具有NCI-N87胃癌异种移植物的NOD/SCID小鼠的存活曲线对照未经处理或经单独或单独TF12处理。

图22.初期E1-3多肽的示意图。LP，在成熟蛋白质中被除去的前导肽；VH，重链可变区，VK,κ轻链可变区，L1，连接子肽1；L2，连接子肽2；L3，连接子肽3；6H，六组氨酸。

图23A.BxPC3人胰腺癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图23B.Capan-1人胰腺癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图23C.NCI-N87人胃癌实体瘤细胞系的体外T细胞重定向杀灭。

图25.(E1)-3s介导的免疫突触形成和双定向胞啃。使纯化的T细胞与BxPC3细胞以5:1比率混合并且与0.1nmol/L的指示bsAb温育60分钟，然后用抗-Trop-2MAb C518和GAM-Fc-FITC染色。使用由前向散射对侧向散射首先选通的未缀合的T细胞和BxPC3细胞，通过流式细胞术分析细胞。通过检测T细胞上的Trop-2，具体地与(E1)-3s的细胞混合物中，显示为Trop-2-阳性未缀合的T细胞的百分比，来自BxPC3细胞的Trop-2对T细胞的胞啃很明显。

图26.(E1)-3s介导的免疫突触形成和双定向胞啃。使纯化的T细胞与BxPC3细胞以5:1比率混合并且与0.1nmol/L的指示bsAb温育60分钟，然后用抗-Trop-2MAb C518和GAM-Fc-FITC染色。使用由前向散射对侧向散射首先选通的未缀合的T细胞和BxPC3细胞，通过流式细胞术分析细胞。胞啃导致了BxPC3细胞上Trop-2的减少，示为几何MFI。

19-3BiTE(网纹)、(19)-3s(黑色)处理20小时或在无bsAb的情况下温育(白色，未针对D-5测试)。使用商业ELISA试剂盒确定上清液流体中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6以及IL-10的浓度。D-1到D-8是独立的血液供体，其中仅D-5同时用于A和B两者中。

10⁵细胞/0.5mL/孔)培育过夜以允许细胞连接。将PBMC添加到含有连接的NCI-N87细胞的孔中(比率10:1)并且使用0.1nM的(E1)-3s(黑色)、聚乙二醇干扰素α-2a(白色)、(E1)-3s加聚乙二醇干扰素α-2a(网纹)处理20小时或不处理(灰色)。使用商业ELISA试剂盒确定上清液流体中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6以及IL-10的浓度。D-l到D-8是独立的血液供体，其中仅D-5同时用于A和B两者中。

图28A.体外细胞毒性。使用0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(▲，虚线)、0.1nM 20*-2b(·,灰色)或介质(■，黑色)将从第一供体分离的纯化的CD8⁺T细胞预处理24小时，然后与PKH-67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率混合。使用(E1)-3s的滴定将细胞混合物处理两天，然后通过流式细胞术计数存活NCI-N87细胞的数目。针对每个样品，使用下式，计算溶解百分比的非线性回归分析(S形剂量反应)：[l-(A₁/A₂)]x 100，其中A₁和A₂分别代表测试和未经处理的样品中活靶细胞的数目对(E1)-3s的摩尔浓度的对数。

图28B.体外细胞毒性。使用0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(▲，虚线)、0.1nM 20*-2b(·,灰色)或介质(■，黑色)将从第二供体分离的纯化的CD8⁺T细胞预处理24小时，然后与PKH-67绿色荧光标记的NCI-N87细胞以5:1比率混合。使用(E1)-3s的滴定将细胞混合物处理两天，然后通过流式细胞术计数存活NCI-N87细胞的数目。针对每个样品，使用下式，计算溶解百分比的非线性回归分析(S形剂量反应)：[l-(A₁/A₂)]x 100，其中A₁和A₂分别代表测试和未经处理的样品中活靶细胞的数目对(E1)-3s的摩尔浓度的对数。

图29A.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a存在(虚线)或不存在(实现)的情况下，CD69-阳性CD4⁺(·)或CD8⁺(■)T细胞百分比对(E1)-3s的摩尔浓度的对数的非线性回归分析(S形剂量反应)。

图29B.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。直方图示出了在NCI-N87细胞的存在下，抗-CD69-APC染色的之后使用0.1nM(E1)-3s(点线)、0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(灰色)或两种试剂的组合(黑色)处理的CD8⁺T细胞。

图29C.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在不存在或存在NCI-N87靶细胞(T)的情况下，在与0.1nM(E1)-3s(E)和/或0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(P)温育后CD69阳性CD8⁺T细胞百分比。各种处理测定进行三次。误差线，S.D.*,P<0.001。

图29D.T-细胞活化。将纯化的T细胞以5:1与NCI-N87细胞混合并且使用(E1)-3s处理18小时，然后通过流式细胞术测量CD69表达。在不存在或存在NCI-N87靶细胞(T)的情况下，与0.1nM(E1)-3s(E)和/或0.1nM聚乙二醇干扰素α-2a(P)温育后，CD69⁺细胞的几何平均荧光。各种处理测定进行三次。误差线，S.D.*,P<0.001。

图30A.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有人T细胞和Capan-1胰腺癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μg TF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs6:381-91)中的图6C。

图30B.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有人T细胞和Capan-1胰腺癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μg TF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs6:381-91)中的图6C。

图30C.与人胰腺和胃癌异种移植物的体内效能。使接种有NCI-N87胃癌细胞的8组小鼠每天使用50μg的(E1)-3s(▲，实心黑色)或60μg TF12(▼，灰色)处理，持续五天，每周使用0.6μg的聚乙二醇干扰素α-2a(*，实心黑色)、(E1)-3s和聚乙二醇干扰素α-2a方案组合(·,实心黑色)，持续四周或使用盐水(·,虚线黑色)处理。另外的组接种有Capan-1，但无T细胞并且使用聚乙二醇干扰素α-2a(□，虚线黑色)处理。上图，Kaplan-Meyer存活图。下图，平均肿瘤体积(+S.D.)对天。星号标记的数据改编自Rossi等人.(2014,MAbs

图32.胰腺和胃癌细胞系的体外重定向T细胞杀灭。将纯化的CD8⁺T细胞(1.2x 10⁵/孔)以6:1与靶细胞(2x 10⁴/孔)混合并且在96孔板中使用E1-3的滴定处理。在48小时后，洗涤以除去T细胞并且使用MTS测定测量存活靶细胞密度。针对若干T细胞供体中的一个的结果的示例。

图33A.人胃肿瘤异种移植物的体内疗法。PBMC以2:1与NCI-N87细胞混合并且使用基质胶皮下注射到NOD-SCID小鼠。在第0天和第3天静脉内向动物给予50μg的E1-3。针对肿瘤生长物的迹象，每日监测小鼠，之后在端值测量>1.0cm³的情况下一周两次测量肿瘤。在176后，E1-3治疗组中8个小鼠中7个未达到端值，其中6个动物保持没有肿瘤。

图33B.人胃肿瘤异种移植物的体内疗法。PBMC以2:1与NCI-N87细胞混合并且使用基质胶皮下注射到NOD-SCID小鼠。在第0天和第3天静脉内向动物给予50μg的E1-3。针对肿瘤生长物的迹象，每日监测小鼠，之后在端值测量>1.0cm³的情况下一周两次测量肿瘤。仅包含PBMC和NCI-87的对照组中的肿瘤达到端值，其中中值时间为39.5天。

除非另有说明，否则“一个(种)”表示“一个(种)或多个(种)”。

如本文所使用的，术语“和”与“或”可用来指连词或反意连词。也就是说，这两个术语应该被理解为相当于“和/或”，除非另有说明。

“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活性剂、染料，和放射性同位素。

如本文使用的“抗体”是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。“抗体”包括单克隆、多克隆、双特异性、多特异性、鼠、嵌合、人源化和人抗体。

“抗体片段”是完整抗体的一部分，如F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv、dAb等。无论结构怎样，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。举例来说，术语“抗体片段”包括由可变区组成的经分离片段，如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段，以及其中轻链和重链可变区由肽连接子连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。“单链抗体”通常缩写为“scFv”，由多肽链组成，其包含相互作用以形成抗原结合位点的V_H和V_L域。V_H和V_L域通常通过1至25个氨基酸残基的肽来连接。抗体片段还包括双功能抗体、三抗体和单结构域抗体(dAb)。

“嵌合抗体”是一种重组蛋白，其含有的可变结构域包括来源于一种物种的抗体(优选地啮齿动物抗体)的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的那些恒定结构域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其他物种，如猫或狗的恒定结构域。

“人源化抗体”是一种重组蛋白，其中来自一种物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的重链可变区和轻链可变区转移至人重链可变结构域和轻链可变结构域(包括人构架区(FR)序列)中。抗体分子的恒定结构域是来源于人抗体的恒定结构域。为了保持结合活性，来自亲本(例如，鼠)抗体的有限数目的FR氨基酸残基可被取代为相应人FR残基。

“人抗体”是从转基因小鼠中获得的抗体，该转基因小鼠已经被基因工程化以响应于抗原激发而产生特异性人抗体。在此技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元件引入至来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，该胚胎干细胞系含有内源重链基因座和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可以合成对人抗原有特异性的人抗体，并且小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等,Nature 368:856(1994)以及Taylor等,Int.Immun.6:579(1994)描述。人抗体还可以通过基因转染或染色体转染方法以及噬菌体呈现技术来构建，所有方法和技术是本领域中已知的。(参见，例如McCafferty等人，1990,Nature348:552-553，公开了从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系(repertoire)体外产生人抗体及其片段)。在此技术中，将抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上呈现为功能性抗体片段。因为丝状粒颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质进行选择也导致选择编码呈现所述性质的抗体的基因。以此方式，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。可以在各种形式下呈现噬菌体，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell,Current

如本文中所使用，术语“抗体融合蛋白”是重组产生的抗原结合分子，其中抗体或抗体片段被连接至另一种蛋白质或肽，如相同的或不同的抗体或抗体片段或DDD肽或AD肽。融合蛋白可以包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性的组合或同一抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可以另外地包含抗体或抗体片段和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选地为重组RNA酶。优选免疫调节剂可为干扰素，如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ。

“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如，两个不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“多价抗体”是可以同时结合至少两个具有相同或不同结构的靶标的抗体。价态表明抗体对单个抗原或表位具有多少个结合臂或位点；即，一价、二价、三价或多价。抗体的多价性意味着抗体可以使用多种相互作用结合抗原，从而增加结合抗原的亲合力。特异性表明抗体能够结合多少个抗原或表位；即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)是二价的，因为它具有两个结合臂，但该抗体是单特异性的，因为它结合一个表位。多特异性的、多价的抗体是含有多于一个具有不同特异性的结合位点的构建体。

“双特异性抗体”是可以同时结合两个具有不同结构的靶标的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可具有特异性结合至例如T细胞、NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞的至少一个臂，和特异性结合至由患病细胞、组织、器官或病原体产生或与其相关联的抗原(例如肿瘤相关联抗原)的至少一个其他臂。可以使用分子工程来产生各种双特异性抗体。

如果所施用的量具有生理学显著性，则本文描述的抗体制剂或组合物被认为以“治疗有效量”来施用。如果试剂的存在导致受体受试者的生理学方面产生可检测变化，那么其具有生理学显著性。在具体实施方案中，如果抗体制剂的存在引起抗癌反应或缓解传染病状态的体征和症状，则其具有生理学显著性。生理学上显著的效应也可为在受体受试者中引起体液和/或细胞免疫应答，从而导致靶细胞的生长抑制或死亡。

1998；76:671-6)外，已显示人Trop-2的表达是结肠癌细胞的肿瘤发生和侵袭力所必需的，该肿瘤发生和侵袭力可被抗Trop-2的细胞外域的多克隆抗体有效减少(Wang等人，Mol Cancer Ther 2008；7:280-5)。

流式细胞术和免疫组织化学染色研究已表明RS7MAb检测多种类型肿瘤上的抗原，而有限结合到正常人组织(Stein等人，1990)。Trop-2主要由癌诸如肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及前列腺癌表达。在动物模型中使用放射性标记鼠RS7MAb进行的定位和治疗研究已证明肿瘤靶向性和治疗效力(Stein等人，1990；Stein等人，1991)。

已表明在来自肺、乳、膀胱、卵巢、子宫、胃以及前列腺的肿瘤中存在RS7强染色。(Stein等人，Int.J.Cancer 55:938,1993)。肺癌病例包括鳞状细胞癌和腺癌两者。(Stein等人，Int.J.Cancer 55:938,1993)。两种细胞类型均强染色，指示RS7抗体不能从非小细胞肺癌的组织学分类上区分。

RS7MAb被快速内在化至靶细胞(Stein等人，1993)。RS7MAb的内在化速度常数介于其他两种快速内在化MAb的内在化速度常数之间，其他两种快速内在化已经被证明可用于免疫毒素制备。同上。已大量记载免疫毒素缀合物的内在化对抗-肿瘤活性是必须的。(Pastan等人，细胞47:641,1986)。药物免疫缀合物的内在化也已经被描述为抗-肿瘤效能中的主要因素。(Yang等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:)。因此，RS7抗体表现出治疗应用的若干重要特性。

虽然hRS7抗体是优选的，但其他抗-Trop-2抗体是已知的并且/或可公开获得，并且在另选的实施方案中，可在目标ADC中使用。

虽然对于减少免疫原性，人源化或人抗体是优选的，但在另选的实施方案中，可使用嵌合抗体。如上所论述，抗体人源化的方法是本领域已知的并且可用于将可获得的鼠或嵌合抗体转化为人源化形式。

BP-11254)，其保藏在日本筑波的国际专利生物保藏机构。美国专利号5,840,854公开了抗-Trop-2单克隆抗体BR110(ATCC号HB11698)。美国专利号7,420,040公开了以保藏编号保藏在IDAC(加拿大温尼伯加拿大国际保藏机构)的杂交瘤细胞系AR47A6.4.2产生的抗-Trop-2抗体。美国专利号7,420,041公开了以保藏编号保藏在IDAC的杂交瘤细胞系AR52A301.5产生的抗-Trop-2抗体。美国公布号公开了抗-Trop-2抗体3E9、6G11、7E6、15E2、18B1。编码代表性抗体的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，保藏编号PTA-12871和PTA-12872。美国专利号8,715,662公开了以保藏号PD 08020和PD08021保藏在AID-ICLC(意大利热那亚)的杂交瘤产生的抗-Trop-2抗体。美国专利申请公布号公开了抗-Trop-2抗体77220、KM4097和KM4590。美国专利号8,309,094(Wyeth)公开了通过序列表识别的抗体A1和A3。在这个段落里以上引用的每个专利或专利申请的实施例部分以引用方式并入本文。非专利公布Lipinski等人(1981,Proc

多个抗-Trop-2抗体在本领域是已知的和/或可公开获得的。如以下所论述，用于制备针对已知抗原的抗体的方法在本领域中是常规的。人Trop-2蛋白质的序列在本领域中也是已知的(参见，例如，GenBank保藏编号CAA54801.1)。用于产生人源化、人或嵌合抗体的方法也是已知的。根据本领域中的常识，阅读本公开内容的普通技术人员将能够制作和使用目标ADC中的抗-Trop-2抗体种类。

在一个优选实施方案中，用作DNL^TM复合物一部分的抗-CD3部分的氨基酸序列如以下在SEQ ID NO:96至SEQ ID NO:101中公开。然而，本领域普通技术人员将认识到任何已知抗-CD3抗体可用于要求保护的方法和组合物中。优选地，有用的抗体部分是人源化或人抗体。

白细胞重定向双特异性抗体复合物

在优选实施方案中，目标双特异性抗体包含抗-CD3x抗-Trop-2抗体。如以上所论述，针对CD3或Trop-2的多种抗体是本领域已知的并且可使用这种已知抗体。然而，在另选的实施方案中，可使用针对除CD3之外的其他白细胞抗原或针对除Trop-2之外的其他疾病相关的抗原的抗体。

16、CD64以及CD89；以及用于嗜中性粒细胞，可选自CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b以及SLC44A2嗜中性粒细胞。优选地，抗-T-细胞抗体结合至CD3或抗-NK抗体结合至CD16。如以下所论述，疾病相关的抗原的许多实例，诸如肿瘤相关的抗原(TAA)是已知的。示例性优选的TAA是Trop-2。

62:1933-43)。布利莫单抗(Blinatumomab)是包含用5-氨基酸连接子连接的V_H和V_L域抗-CD3和抗-CD19抗体片段的抗体，并且表达为粘接至本身以形成抗原结合位点的单一多肽链。认为布利莫单抗起作用的方式是使T-细胞-特异性CD3和B-细胞特异性CD19抗原紧密接近，以引发针对并置B细胞的T-细胞毒性响应，其不需要癌细胞的T-细胞特异性(例如，Portell等人，2013,Clin Pharmacol 5(增刊1):5-11)。由于它的较短半衰期，布利莫单抗需要连续静脉内输注以便有效，(Portell等人，2013)。患有持续或复发最小残留疾病的B-细胞ALL患者的II期试验报告大约80％的全面缓解率(Portell等人，2013)。

低至0.005mg/m²/天的布利莫单抗剂量报告可有效消除非霍奇金淋巴瘤患者的癌细胞(Bargou等人，2008,Science

针对CD19的各种抗体是公开已知的且/或可购得，如从Santa Cruz

Rheum62:1933-43)。Moore等人(2011)报告与具有pg/mL范围内的EC₅₀值的带有相同抗-CD19和抗-CD3可变区序列的单链、双特异性抗体相比，双特异性抗体更有效诱导B细胞溶解(Moore等人，2011)。已经报告除和之外的其他抗-CD3x抗-CD19双特异性抗体(参见，例如，Wei等人，2012,Cell

卡妥索单抗是抗-CD3x抗-EpCAM双特异性抗体，其在欧洲已经批准其用于治疗与转移的癌症相关的恶性腹水(Chames&Baty，2009，MAbs 1:539-47)。在小鼠模型系统中，卡妥索单抗在10pM的浓度范围下能够杀死肿瘤细胞，并且据报告产生了黑素瘤肿瘤的总体根除(Chames&Baty，2009)。伴随恶性腹水的卵巢癌患者的人类临床试验也显示了统计上显著的效力(Chames&Baty，2009)。然而，大鼠/小鼠杂合bsAb的高免疫原性可能限制经静脉内施用抗体(Chames&Baty，2009)。抗肿瘤bsAb的使用不限于抗-CD3x抗-CD

本领域普通技术人员将认识到目标白细胞重定向双特异性抗体不限于抗-CD3x抗-Trop-2构建体，而是可包括连接至抗-CD3抗体部分的针对任何已知疾病相关联抗原的抗体。另选地，还可以使用针对除CD3以外的其他T细胞抗原或NK细胞、单核细胞或嗜嗜中性粒细胞细胞上所表达的其他抗原的抗体。示例性T-细胞抗原包括但不限于，CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。对于NK细胞，其他示例性抗原可选自CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM Biological公司目录号12211-RP02、1；Millipore目录号04-1102、04-1102、MAB1406)。这些和许多其他抗白细胞抗体是公开可获得的，并且可以用于目标白细胞重定向bsAb。如以下所论述，许多针对多种疾病相关抗原的抗体是公开是已知的和/或市售的，并且可用于目标白细胞重定向双特异性抗体。可能使用的其他示例性白细胞重定向的bsAb包括FBTA05(抗-CD20x抗-CD3)和TRBS07(抗-GD2x抗-CD3)。

在各种实施方案中，目标双特异性抗体可与一种或多种干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λ，优选干扰素-α组合使用。人干扰素在本领域中是熟知的并且人干扰素的氨基酸序列可容易地从公开的数据库获得(例如，GenBank登录号AAA52716.1；AAA52724；AAC41702.1；EAW56871.1；EAW56870.1；EAW56869.1)。人干扰素还可商业上从各种供应商获得(例如，Cell

已经报告干扰素-β可有效治疗各种实体肿瘤。每周两次用6百万单位的IFN-β治疗36个月的患者显示在患有HCV-相关肝癌的患者中完全切除或摘除原发肿瘤之后肝细胞癌的复发降低(Ikeda等人，2000,Hepatology 32:228-32)。用干扰素-β的基因疗法诱导神经胶质瘤、黑素瘤和肾细胞癌的细胞凋亡(Yoshida等人，2004,Cancer

III型与I型IFN系统之间的主要差异是其相应受体复合物的分布。IFN-α/β经由两种广泛表达的I型干扰素受体来信号转导，并且与IFN-α/β施用相关联的所得系统毒性限制其作为治疗剂的使用(Pestka等人，2007,J Biol Chem 10:702-14)，IFN-λR1具有非常有限的表达模式，其中在上皮细胞、黑素细胞和肝细胞中水平最高，并且在原代中枢神经系统(CNS)细胞中水平最低。血液免疫系统细胞表达较高水平的能抑制IFN-λ作用得短IFN-λ受体剪接变异体(sIFN-λR1)。神经元细胞和免疫细胞的有限反应性意味着在IFN-λ情况下可能不存在或显著减少往往与IFN-α疗法相关联的严重毒性(Witte等人，2009,Genes Biol.93，于12/20/12线上公布)。据建议，对于治疗慢性HCV感染，IFN-λ可优于IFN-α，因为它不太可能诱导通常与IFN-α疗法相关联的白细胞减少(Dickensheets等人，2013)。

在临床环境中，PEG化IFN-λ1(PEG-IFN-λ1)已经临时用于患有慢性丙型肝炎病毒感染的患者。在阶段Ib研究(n＝56)中，当将PEG-IFN-λ1施用至在IFN-α疗法之后复发的基因型1HCV患者时，在所有剂量水平(0.5-3.0μg/kg)下观察到抗病毒活性，并且病毒负载减少2.3至4.0个对数(Muir等人，2010,Hepatology 52:822-32)。IIb期研究(n＝526)示出与PEG-IFN-α相比，具有HCV基因型1和4的患者对于使用PEG-IFN-λ1的治疗具有显著更高反应率。同时，与PEG-IFN-α相比，通常与I型干扰素治疗相关联的不良事件比率对于PEG-IFN-λ1是较低的。很少观察到嗜中性白细胞减少和血小板减少并且流感样症状、贫血和肌肉骨骼症状的比率降低至在PEG-IFN-α治疗时所发现的比率的约1/3。然而，严重不良事件、抑郁症和其他常见不良事件(≥10％)的比率在PEG-IFN-λ1与PEG-IFN-α之间是相似的。与PEG-IFN-α相比，在最高剂量PEG-IFN-λ1中发现较高比率的肝毒性(“Investigational

在各种实施方案中，目标白细胞重定向双特异性抗体、ADC和/或检查点抑制剂mAb可以与一种或多种干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-λl、干扰素-λ2,或干扰素λ3组合使用。当与其他药剂一起使用时，干扰素可在其他药剂之前、同时或之后施用。当同时施用时，干扰素可与其他药剂偶联或分开。

12:252-64；Mavilio&Lugli,)。利用针对诸如CTLA4、PD1和PD-L1的免疫系统检查点的拮抗性检查点阻断抗体的疗法是用于癌症和其他疾病的免疫疗法的最有前景的新手段之一。与大多数抗癌剂相反，检查点抑制剂不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配体，以提高免疫系统的内源性抗癌活性。(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)因为此类抗体主要通过调节对患病细胞、组织或病原体的免疫应答起作用，所以它们可以与其他治疗形态组合使用，诸如目标白细胞重定向双特异性抗体、ADC和/或干扰素，以提高此类药剂的抗肿瘤效果。

现在已经清楚，肿瘤可以通过强占某些免疫检查点途径而逃避免疫监测，特别是在肿瘤抗原特异性T细胞中(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer 12:252-264)。因为许多此类免疫检查点由配体-受体相互作用引发，所以它们可以通过针对所述配体和/或其受体的抗体被容易地阻断(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer

程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274及B7-H1)是在活化的T细胞、B细胞、骨髓细胞和巨噬细胞上发现的PD1的配体。虽然PD1存在两种内源性配体，PD-L1和PD-L2，但抗肿瘤疗法已经集中于抗-PD-Ll抗体。PD1和PD-L1的复合物抑制CD8+T细胞增殖且减少免疫应反应(Topalian等人，2012,N Engl J Med

细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4，也被称为CD 152)也是专门表现在T细胞上的免疫球蛋白超家族的成员。CTLA4起抑制T细胞活化的作用，并且据报告能抑制辅助T细胞活性和提高调节T细胞免疫抑制活性(Pardoll,2012,Nature Reviews Cancer

本领域技术人员应认识到，确定检查点抑制剂抗体单独或与一种或多种其他药剂组合施用于需要其的患者的最佳剂量的方法可以通过本领域中熟知的标准剂量-反应和毒性研究来确定。在一个示例性实施例中，检查点抑制剂抗体可优选地以约0.3mg/kg-10mg/kg或最大耐受剂量施用，约每三周或约每六周施用一次。替代地，检查点抑制剂抗体可以通过升高的剂量方案施用，包括施用约3mg/kg的第一剂量、约5mg/kg的第二剂量和约9mg/kg的第三剂量。另选地，逐步升高的剂量方案包括施用检查点抑制剂抗体约5mg/kg的第一剂量和约9mg/kg的第二剂量。另一个逐步升高的剂量方案施用可以包括施用检查点抑制剂抗体约3mg/kg的第一剂量、约3mg/kg的第二剂量、约5mg/kg的第三剂量、约5mg/kg的第四剂量以及约9mg/kg的第五剂量。在另一个方面，逐步升高的剂量方案可以包括施用5mg/kg的第一剂量、5mg/kg的第二剂量和9mg/kg的第三剂量。检查点抑制剂mAb的示例性报告剂量包括3mg/kg伊匹单抗，每三周施用一次，持续四个剂量；10mg/kg伊匹单抗，每三周一次，持续八个循环；l0mg/kg，每三周一次，持续四个循环，随后每12周一次，总计三年；10mg/kg

刺激针对肿瘤及/或病原体的免疫应答的这些和其他已知药剂可以与单独或进一步与干扰素诸如干扰素α和/或用于改良癌症疗法的抗体-药物缀合物组合的白细胞重定向双特异性抗体组合使用。可以组合使用的其他已知共刺激途径调节剂包括但不限于阿托莫德、贝拉西普、布利莫单抗、CD40配体、抗-B7-l抗体、抗-B7-2抗体、抗-B7-H4抗体、AG4263、依立托仑、抗-OX40抗体、ISF-154以及SGN-70；B7-1、B7-2、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD48、LFA-3、CD30配体、CD40配体、耐热抗原、B7h、OX40配体、LIGHT、CD70以及CD24。

在某些实施例中，抗KIR抗体也可以与白细胞重定向bsAb、干扰素、ADC和/或检查点抑制剂抗体组合使用。当被抗体活化时NK细胞通过自发性细胞毒性和通过ADCC介导抗肿瘤和抗感染剂活性(Kohrt等人，2013,Blood,[印刷前电子版12/10/13])。细胞毒性反应程度由NK细胞接到的抑制信号与活化信号的平衡来决定(Kohrt等人，2013)。杀灭细胞免疫球蛋白样受体(KIR)介导降低NK细胞反应的抑制信号。抗KIR抗体，诸如利利单抗(Innate 120:4324-33)。在体外，抗KIR抗体防止NK细胞与靶细胞的致耐受性相互作用，并且增加NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性反应(Kohrt等人，2013)。在体内，在与利妥昔单抗(抗CD20)组合时，抗KIR抗体在0.5mg/kg的剂量下诱导的针对淋巴瘤的NK细胞介导的利妥昔单抗依赖性细胞毒性有所增强(Kohrt等，2013)。抗KIR mAb可以与ADC、白细胞重定向bsAb、干扰素和/或检查点抑制剂抗体组合以加强对肿瘤细胞或病原生物体的细胞毒性。

1991)。简单地说，单克隆抗体可通过以下方式获得：将包含抗原的组合物注入小鼠，移除脾以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆，培养产生针对该抗原的抗体的克隆，并且从杂交瘤培养物中分离抗体。

初始产生了针对免疫原的抗体之后，可对抗体进行测序并随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。使用从人源化、嵌合或人抗体衍生的抗体组分能回避与鼠恒定区免疫原性相关联的潜在问题。

嵌合抗体是一种重组抗体，其中人抗体的可变区已置换为例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)。嵌合抗体在施用至受试者时显示降低的免疫原性和增强的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开例如于Orlandi等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:)。用于构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员熟知的。举例来说，Leung等人，Hybridoma 13:469(1994)通过将编码鼠类抗CD22抗体LL2的V_K和VH结构域的DNA序列与相应人κ和IgG₁恒定区结构域组合产生了LL2嵌合体。

89:),Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)，和Singer等人，J.Immun.150:))。嵌合或鼠单克隆抗体可通过将来自于小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠CDR转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也可置换为人FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移到人FR中通常导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要进行额外修饰以恢复鼠抗体的初始亲和力。此举可通过将FR区中的一个或多个人残基置换为其鼠对应物以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等人，Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等人，Science 239:)。总体上，不同于其鼠对应物并且接近或接触一个或多个CDR氨基酸残基而定位的那些人FR氨基酸残基是取代候选物。

348:552-553(1990)。预期此类完全人抗体表现比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。在某些实施方案中，所要求保护的方法和工序可以使用由此类技术产生的人抗体。

在一个替代方案中，可使用噬菌体呈现技术来产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等人，2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)。人抗体可由正常人或由表现特定疾病病况(如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等人，2005)。由患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体谱系可能偏向针对疾病相关抗原的抗体。

在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体呈现文库。一般来说，从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同上)。从μ、γ以及κ链抗体谱系克隆重组Fab并且将其插入至噬菌体呈现文库中(同上)。将RNA转变成cDNA并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备Fab

3:3)。还可以由体外活化的B细胞来产生人抗体。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其全文以引用方式并入本文中。熟练技术人员将认识到，这些技术是作为示例并且可利用制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。

在另一替代方案中，可使用已进行基因工程改造以产生人抗体的转基因动物来使用标准免疫方案产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等人，Nature Genet.7:13(1994)、Lonberg等人，Nature

将用含有部分人IgH和Igκ基因座，包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列的生殖系构型YAC(酵母人工染色体)转化。人可变区谱系可以用来获得产抗体的B细胞，所述B细胞可以通过已知的技术加工成杂交瘤。用靶抗原免疫的将通过正常免疫应答产生人抗体，其可收集和/或通过上文所论述的标准技术进行制造。可获得的多种品系，其各自能够产生不同类别的抗体。已证明转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药代动力学性质(Green等人，1999)。熟练技术人员将认识到，所要求保护的组合物和方法不限于使用系统，而是可利用已进行基因工程改造以产生人抗体的任何转基因动物。

各种技术，如制造嵌合或人源化抗体，可能涉及抗体克隆和构建的程序。感兴趣的抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和V_H(可变重链)序列可通过各种分子克隆工序获得，如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增来克隆并且测序。为了证实其真实性，可以将克隆的V_L和V_H基因在细胞培养物中表达为嵌合抗体，如由Orlandi等(Proc.Natl

可以通过一般分子克隆技术从产生鼠类抗体的任何已知杂交瘤细胞系或经过转染的细胞系制备cDNA(Sambrook等人，Molecular Cloning,A laboratory

可以将Vκ的PCR产物亚克隆进入阶段载体，如基于pBR327的阶段载体(VKpBR)，其含有Ig启动子、信号肽序列以及适宜的限制位点。V_H的PCR产物可亚克隆到类似阶段载体中，如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和V_H序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS切除并且分别连接到适当的表达载体中，如pKh和pG1g(Leung等人,Hybridoma,13:469(1994))。可以将表达载体共转染进入适当的细胞并且监测上清液中嵌合、人源化或人抗体的产生。或者，可切除Vκ和V_H表达盒并亚克隆至单一表达载体如pdHL2中，如由Gillies等人描述。(J.Immunol.Methods

在一替代实施方案中，可将表达载体转染至已预先适应在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见，例如，美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425；其各自的实施例部分以引用方式并入本文)。这些示例性细胞系是基于以突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增所转染的基因序列并且预先适应无血清细胞系以供蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。

可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分，如F(ab')₂、Fab'、F(ab)₂、Fab、Fv、scFv等。F(ab')₂片段可通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生，而Fab'片段可通过还原F(ab')₂片段的二硫键桥而产生。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等,1989,Science,246:)以允许快速且容易地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab'片段。可通过抗体的木瓜蛋白酶消化来产生F(ab)₂片段。

324:13-25,2007)。该VHH可以具有强大的抗原结合能力，并可以与常规VH-VL对所不可及的新表位相互作用。(Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG含有约50％仅有重链的骆驼IgG抗体(HCAb)(Maass等人，2007)。羊驼可用已知抗原(如TNF-α)免疫并且可分离结合并中和靶抗原的VHH(Maass等,2007)。已鉴定出扩增几乎所有羊驼VHH编码序列的PCR引物，并可以将其用来构建羊驼VHH噬菌体呈现文库，可利用所述文库通过本领域熟知的标准生物淘选技术(Maass等人，2007)分离抗体片段。在某些实施方案中，抗胰腺癌VHH抗体片段可用于要求保护的组合物和方法中。

抗体片段可通过全长抗体的蛋白水解或者在大肠杆菌或另一种宿主中表达编码片段的DNA来制备。可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得抗体片段。这些方法由例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647和其中包含的参考文献来描述。还参见Nisonoff等人，Arch

治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加和治疗性反应的持续时间减少相关(Baert等人，2003,N Engl J Med 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可以部分地通过抗体的同种异型来确定(Stickler等人，2011,Genes and Immunity 12:213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置上的氨基酸序列变化相关。含有重链γ-型恒定区的IgG抗体的同种异型命名为Gm同种异型(1976,J Immunol 117:1056-59)。

12:213-21)。然而，G1m3同种异型也常常发生于白种人中(Stickler等人，2011)。已经报道了当向非G1m1(nG1m1)受体(如G1m3患者)施用时，G1m1抗体含有倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(Stickler等人，2011)。非G1m1同种异型抗体在施用至G1m1患者时并不同样具有免疫原性(Stickler等人，2011)。

人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中的Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型两者均包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，并且该同种异型有时称为DEL和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO：85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO：86)，显示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。

214上的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nG1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。G1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的甘氨酸。除了重链恒定区序列变异体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报道了κ轻链恒定区中的同种异型变异体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1，2同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。

对于治疗性抗体而言，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是用于治疗多种血液恶性肿瘤和/或自身免疫性疾病的针对抗CD20的人源化和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1中所示，利妥昔单抗(G1m17,1)是DEL同种异型IgG1，在利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在Kabat位置214(重链CH1)上具有额外序列变化。已经报道了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如Morchhauser等人，2009,J

表1.利妥昔单抗对维妥珠单抗的同种异型

为了减小治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，需要选择的抗体同种异型对应于G1m3同种异型，其特征在于Kabat 214上的精氨酸；和nG1m1,2无效同种异型，其特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。出人意料地，发现重复皮下施用G1m3抗体经过很长一段时间并不会导致明显的免疫应答。在替代实施方案中，与G1m3同种异型一样的人IgG4重链具有Kabat 214上的精氨酸、Kabat 356上的谷氨酸、Kabat 359上的甲硫氨酸以及Kabat 431上的丙氨酸。因为免疫原性看起来似乎至少部分地与那些位置上的残基相关，所以对于治疗性抗体的人IgG4重链恒定区序列的使用也是一个优选的实施方案。G1m3IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可以是对治疗性施用有用的。

PTA-4405和PTA-4406)和D2/B(WO )，关于附图和实施例部分，每一个列举的专利或申请的文本以引用的方式并入本文。

如通过流式细胞术所示并且可作为选择免疫疗法的合适抗体的指导的造血恶性细胞上的合适抗原(群集指定，或CD)靶标的综合分析是于2008年1月15日在线预公布的Craig和Foon,Blood；DOL10.1182/Blood-535。

CD66抗原由分别由癌胚抗原(CEA)基因家族成员BCG、CGM6、NCA、CGM1和CEA编码的具有类似结构的五种不同糖蛋白CD66a-e组成。这些CD66抗原(例如，CEACAM6)主要表达于粒细胞、消化道的正常上皮细胞和各种组织的肿瘤细胞中。合适的癌症靶标还包括癌症睾丸抗原，如NY-ESO-1(Theurillat等人，Int.J.Cancer

39:277-82)观察到经过埃-巴二氏病毒转化的人B淋巴细胞产生针对组蛋白的天然抗体。在某些实施方案中，针对组蛋白的抗体可用于目标组合中。已知的抗组蛋白抗体包括但不限于BWA-3(抗-组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗-组蛋白H3)、MRA12(抗-组蛋白H1)、PR1-1(抗-组蛋白H2B)、LG11-2(抗-组蛋白H2B)以及LG2-2(抗-组蛋白H2B)(参见，例如，Monestier等人,1991,Eur

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫性和细胞凋亡的重要调节因子。已经报告CD74是MIF的内源性受体(Leng等人，2003,J Exp Med 197:1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗效果可用于治疗多种疾病状态，诸如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌以及慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等人,2004,BMC

最优选抗体/抗原对的实例是LL1，抗-CD74MAb(不变链，II类-特异性伴侣蛋白，Ii)(参见，例如，美国专利号6,653,104；7,312,318；其各自的实施例部分以引用方式并入本文)。CD74抗原高度表达于B-细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T-细胞淋巴瘤、黑色素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、胶质母细胞瘤和某些其他癌症中(Ong等人，Immunology 98:296-302(1999))。在癌症中使用CD74抗体的综述包含于Stein等人，Clin Cancer Res.2007年9月15日；13(18Pt2):s中，其以引用方式并入本文。优选地用抗-CD74抗体治疗的疾病包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏疾病、黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白血病和多发性骨髓瘤。

在其他实施方案中，抗体复合物结合至MHC I类、MHC II类或辅助分子，如CD40、CD54、CD80或CD86。抗体复合物也可结合至白细胞活化细胞因子，或细胞因子介体，如NF-κB。

在某些实施方案中，抗体或其片段可以与一种或多种治疗剂和/或诊断剂缀合。治疗剂不需要相同，而是可不同，例如药物和放射性同位素。举例来说，¹³¹I可并入抗体或融合蛋白质的酪氨酸中并且药物连接至赖氨酸残余物的ε氨基。治疗剂和诊断剂还可连接至例如经过还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制造治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白质的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中为已知的并且可利用任何这类已知方法。

治疗剂或诊断剂可以通过二硫键的形成而连接在还原抗体组分的铰链区。替代地，此类试剂可使用异双官能交联剂(如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP))连接。Yu等人，Int.J.Cancer 56:244(1994)。用于此类缀合的一般技术是本领域中众所周知的。参见例如，Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND APPLICATION,Ritter等人(编著),第60-84页(Cambridge University Press 1995)。替代地，可通过抗体Fc区中的碳水化合物部分缀合治疗剂或诊断剂。碳水化合物基团可用于增加结合至硫醇基的相同试剂的负载，或碳水化合物部分可用于结合不同治疗剂或诊断剂。

经由抗体碳水化合物部分将肽缀合至抗体组分的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Shih等人，Int.J.Cancer 41:832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46:)；和Shih等人美国专利号5,057,313，其通过引用方式整体并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能的载体聚合物反应。此反应产生初始希夫碱(亚胺)键联，其可通过还原成仲胺而稳定以形成最终缀合物。

在免疫缀合物的抗体组分是抗体片段的情况下可能不存在Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154:)；Hansen等人，美国专利号5,443,953(1995),Leung等人，美国专利号6,254,868，这些文献均以引用方式整体并入本文。使用经过工程改造的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。

在一些实施方案中，螯合剂可连接至抗体、抗体片段或融合蛋白质和用于螯合治疗剂或诊断剂，如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合并使用螯合剂或其他配体来将金属连接至蛋白质的方法在本领域中是熟知的(参见，例如，美国专利号7,563,433，其实施例部分以引用方式并入本文)。

在某些实施方案中，放射性金属或顺磁性离子可通过与具有长尾部的试剂反应来连接至蛋白质或肽，该尾部可连接有多个螯合基团用于结合离子。这样的尾部可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，诸如聚赖氨酸、多糖或其他衍生化链或可衍生链，该螯合基团为，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟，和已知可用于此目的的相似基团。

螯合物可直接连接至抗体或肽，例如如美国专利4,824,659中公开，其以引用方式整体并入本文。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，它们与总能量范围为60keV至4,000keV的诊断同位素一起用于放射成像，该同位素为诸如¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹⁸F、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc、^94mTc、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁶Br。相同的螯合物在与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时可用于MRI。如NOTA、DOTA以及TETA的巨环螯合剂可与各种金属和放射性金属一起使用，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。可通过根据目标金属调整环的大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。本发明包括其他环类型的螯合物如大环聚醚，它们对于稳定地结合核素如用于RAIT的²²³Ra有价值。

最近，已经公开了用于PET扫描技术中的¹⁸F-标记方法，例如通过F-18与金属或其他原子如铝反应。¹⁸F-Al缀合物可与直接连接至抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向构建体的螯合基团，如DOTA、NOTA或NETA复合。这类F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433中，其实施例部分以引用方式并入本文。

在特定优选实施方案中，免疫缀合物可以是抗体-药物缀合物(ADC)。用于ADC生产中的两种示例性药物是SN-38和前药形式的2-吡咯啉并阿霉素(P2PDox)。产生SN-38-缀合的ADC的组合物和方法在例如美国专利号7,999,083；8,080,250；8,741,300；8,759,496中有所公开，这些专利中每个的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。产生P2PDox ADC的组合物和方法在例如美国专利号8,877,101中有所公开，这些专利的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。

产生双特异性抗体的方法

在各种实施方案中，目标组合疗法可以利用一种或多种双特异性抗体(bsAb)，诸如白细胞重定向bsAb。如本文中所使用的双特异性抗体是含有针对两个不同的抗原或同一抗原上的两个不同表位的结合位点的抗体。尽仅可结合至单一抗原上的单一表位的抗体是单特异性的，不考虑抗体分子上的抗原结合位点数目。

160:)。虽然这些技术用于制造bsAb，但各种产生问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标bsAb、低产率、生产费用等。

最近的方法利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一bsAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNL^TM的基元的异源二聚(Chames&Baty,2009,Curr Opin Drug Discov Devel

三功能单抗(Triomab)是四价体瘤方法的变化形式，与大鼠/大鼠或小鼠/小鼠四价体瘤中常见的随机配对相比，其使用小鼠IgG2a与大鼠IgG2b抗体的组合以优先产生重组抗体(Chames&Baty,mAb1:539-47)。由此技术产生的抗-CD3x抗-EpCAM bsAb(卡妥索单抗)能够有效地征募巨噬细胞和NK细胞且活化T细胞(Chames&Baty,mAbs 1:539-47)，大概至少部分是由于腹膜腔内施用于腹水的途径。厄妥索单抗是靶向HER2的另一种三功能单抗，其可用于转移性乳腺癌。Bi20是靶向CD20的另一种三功能单抗。在体外，Bi20展现来自CLL患者的B细胞的有效溶解(Chames&Baty,mAbs 1:539-47)。

涉及组装来源于两种不同的之前存在的抗体的两个重链和两个轻链的另一种bsAb形成方法是基于钮入穴法(knobs-into-holes)，其有助于异源二聚体形成且防止同源二聚体形成(Schaefer等人,2011,ProcNatl.Acad SciUSA 108:11187-92)。“CrossMab”技术进一步涉及交换双特异性抗体中一半的Fab内的重链和轻链结构域，从而产生两个不同所以不会发生轻-重链错配的臂(Schaefer等人,2011)。钮入穴法将具有庞大侧链的氨基酸引入一个重链的CH3结构域中，从而配合另一个重链的CH3结构域中适当设计的穴。方法组合预防重链与重链和重链与轻链相互作用错配，从而主要产生单一产物。所产生的针对血管生成素-2(Ang-2)和VEGF-A的最初CrossMab展现与亲本mAb相当的结合特征，具有强效的抗血管生成和抗肿瘤活性(Schaefer等人,2011,Proc

在一些实施方案中，单独或另外复合至一种或多种效应因子如细胞因子的双特异性抗体形成为DOCK-AND-LOCK^TM(DNL^TM)复合物(参见，例如，美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,901,680；7,906,118；7,981,398；8,003,111，其实施例部分各自以引用方式并入本文。)通常，该技术利用了在cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA)调节(R)亚单位的二聚化和对接结构域(DDD)序列与来源于多种AKAP蛋白中任一种的锚定结构域(AD)序列之间发生的特异性和高亲和性结合相互作用(Baillie等人,FEBS

虽然标准DNL^TM复合物包括的两个DDD连接至一个AD连接的分子的三聚体，但是复合结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他多聚体。在一些实施方案中，DNL^TM复合物可包括结合至同一抗原决定子或两个或更多个不同抗原的两个或更多个抗体、抗体片段或融合蛋白质。DNL^TM复合物还可包括一种或多种其他效应因子，如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白质、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶如豹蛙酶(onconase)、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂或任何其他分子或聚合体。

1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在受到最彻底研究的由第二信使cAMP结合R亚单位而触发的信号转导途径之一中起关键作用(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243:3763)。全酶的结构由两个通过R亚单位保持为非活性形式的催化亚单位组成(Taylor,J.Biol.Chem.1989；264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚单位(RI和RII)，并且每种类型具有α和β同种型(Scott,Pharmacol.Ther.1991；50:123)。因此，PKA调控亚单位的四个同种型是RIα、RIβ、RIIα和RIIβ，其各自包括DDD部分氨基酸序列。R亚单位仅分离为稳定二聚体并且显示二聚化结构域由RIIα的前44个氨基端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6:222)。如下论述，其他调控亚单位的氨基酸序列的类似部分涉及二聚化和对接，其分别位于调控亚单位的N-末端附近。cAMP结合R亚单位造成用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚单位释放，该活性催化亚单位通过PKA的区室化经由其与AKAP对接而面向所选择的底物(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。

自从1984年表征了第一种AKAP(微管相关的蛋白质-2)(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81:6723)，已在酵母至人范围内的物种中鉴定出具有多样性结构的多于50种AKAP，其定位至各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体以及内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell

我们已发展出一种平台技术，其利用人PKA调控亚单位的DDD和AKAP的AD作为一对优良的连接子模块用于对接任何两个实体(在下文称为A与B)于非共价复合物，该复合物可通过在DDD与AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定为DNL^TM复合物。该途径的一般方法如下。通过将DDD序列连接至A的前体来构建实体A，产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a₂构成。通过将AD序列连接至B的前体来构建实体B，产生下文称为b的第二组分。a₂中所含的DDD的二聚基元将产生用于结合b中所含的AD序列的对接位点，由此促进a₂与b容易地缔合形成由a₂b构成的二元三聚复合物。此结合事件通过随后经由二硫桥共价固定两个实体的反应而加以稳定，这基于有效局部浓度的原则而非常有效地发生，因为初始的结合相互作用会使置于DDD和AD两者上的反应性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA

通过远离两个前体的官能团连接DDD和AD，还预期所述位点特异性连接将保留两个前体的原始活性。此方法在本质上是模块化的并且可能应用于位点特异性共价连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其他效应子部分。利用构建以下实施例中所述的AD和DDD缀合效应子的融合蛋白法，实际上可将任何蛋白质或肽并入DNL^TM构建体中。然而，该技术并不具限制性并且可利用其他缀合方法。

已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将该双链核酸插入用于制造融合蛋白的表达载体中(参见例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL，第2版,1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员将认识到，AD或DDD部分与效应子部分的连接位点可根据效应子部分的化学性质和效应子部分中参与其生理活性的部分而改变。多种效应子部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术执行，如使用二价交联试剂和/或其他化学缀合技术。

113,6161-71)。虽然Fc-bsHexAb离体高度稳定，但是在体内可能发生一定程度的解离，例如通过细胞内加工。此外，Fc-bsHexAb缺乏CDC活性。

118:1877-84)。Fc-IgG-IFNα维持接近于重组IFNα的高特异性活性、并且在体外和在体内对抗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)异种移植物显著有效。Fc-IgG-IFNα在小鼠中的T_1/2长于PEG化的IFNα，但为亲本mAb的一半长。与Fc-bsHexAb相似，Fc-IgG-IFNα在体内随着时间的推移而解离并且展示降低的CDC，但是ADCC增强。

AD和DDD部分中的结构功能关系

对于不同类型的DNL^TM构建体，可利用不同AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。

熟练的技术人员将认识到，DDD1和DDD2是基于蛋白激酶A的人RIIα同种型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如以下DDD3、DDD3C和AD3所例示。

在其它替代实施方案中，在DNL^TM复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的其它序列变异体。例如，人PKADDD序列仅存在四种变异体，对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKA

例如，Kinderman等人(2006，Mol Cell 24：397-408)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论：人DDD序列含有许多在二聚体形成或AKAP结合重要的保守氨基酸残基，在下面SEQ ID NO：1中加下划线标出。(参见Kinderman等，2006的图1，以引用的方式并入本文)。熟练技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变异体时，将需要避免改变任何加下划线的残基，而对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。

如以下更详细论述，已对于二十个常见L-氨基酸中的每一种表征保守氨基酸取代。因此，基于Kinderman(2006)的数据和保守氨基酸取代，基于SEQ ID NO：1的潜在替代性DDD序列示于表2。在制定表2中，仅考虑高度保守氨基酸取代。举例来说，带电残基仅取代相同电荷的残基，具有较小侧链的残基经类似大小的残基取代，羟基侧链仅经其他羟基取代等。因为脯氨酸对于氨基酸次级结构具有独特的效应，因此没有其他残基取代脯氨酸。有限数目的此类潜在替代DDD部分序列示于以下SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:31中。本领域技术人员将认识到DDD部分种类内的替代物质可通过标准技术来构建，例如使用市售肽合成器或熟知的定点诱变技术。氨基酸取代对于AD部分结合的效应还可通过标准结合测}