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乙肝前S1抗原与乙肝病毒感染中的临床意义
作者：岳化葵&&&&作者单位：518020
广东省深圳市人民医院检验科
探讨乙肝病毒前S1抗原与乙肝两对半结果的关系。方法
ELISA法检测10828例患者的前S1抗原与乙肝两对半。结果
在10642例标本中，前S1抗原阳性1728例，占16.2%。3099例表面抗原阳性标本，前S1抗原阳性1728例 ，阳性率为55.7%。结论
血清前S1抗原的检测是乙肝病毒在体内复制和肝损害的一个指标，与乙肝两对半联合检测，在乙肝的早期诊断，疗效观察及预后判断有重要的参考价值。
【关键词】& 前S1抗原；乙肝两对半；检测
　　乙肝病毒前S1抗原PreSl是HBV表面蛋白的组成成份，是由HBV基因组S区编码的病毒衣壳蛋白，主要存在于传染性的Dane颗粒中。PreS 1多肽的21到47位氨基酸残基之间是HBV的肝细胞结合位点，通过肝细胞膜上的前S1抗原受体介导HBV对肝细胞的吸附感染。PreS 1抗原作为HBV 血清学又一标志，逐渐显现出较高的临床意义。前S1抗原在病毒侵入肝细胞的机制中以及病毒复制等方面起着十分重要的作用。为进一步探讨前S1抗原在乙肝病毒感染中的临床意义，我们采用ELISA法分别检测10828例标本的前S1抗原和乙肝两对半。［1］
　　1& 材料和方法
　　1．1& 材料
　　1．1．1& 标本来源& 自2001月至2007年11月门诊及住院病人血清。
　　1．1．2& 仪器& 德国DADE BEHRING BEPⅢ型自动酶免分析仪
　　1．1．3& 试剂& 前S1抗原酶免试剂（上海阿尔法生物技术有限公司生产）乙肝两对半试剂（上海科华）均在有效期内。
　　1．2& 方法& 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法严格按说明书操作进行检测。
　　2& 结果
　　表1& 几组例数对比（略）
　　见表1，在10642例标本中，前S1抗原阳性1728例，占16.2%。3099例表面抗原阳性标本，前S1抗原阳性1728例 ，阳性率为55.7%。
　　3& 讨论&&
　　HBsAg是乙肝病毒的外壳部分，不含病毒核酸，其本身HBV感染的标志，不反映病毒是否复制，复制程度，传染性及预后，必须结合其他检测来判断。本组检测的3099例表面抗原阳性标本中，前S1抗原阳性1728例 ，阳性率为55.7%。7543例表面抗原阴性标本，前S1阳性3例，0.4&。两者比较有显著差异。表明前S1只存在乙肝病毒性肝炎，与HBV携带和感染有高度一致性。现行的HBV研究治疗中一直沿用e抗原体系判断复制及治疗效果，但这些指标常存在对HBV复制及治疗反映不够灵敏。本组实验中，e抗原阳性685例标本，前S1抗原阳性率为83.6%，研究表明，前S1抗原与HbeAg和HBV-DNA几乎同时出现，对感染期不详的患者可做出早期感染的判断。而在慢性乙肝感染中前S1抗原持续阳性，可提示患者病情呈进行性发展［2］。本组实验中，e抗原阴性2409例标本中仍有47.8%前S1抗原阳性。研究资料表明，HbeAg阴转HBV-DNA仍有复制，由于前C区基因突变，使HbeAg不能表达。文献报道，前C区突变株在慢乙肝中检出率高达80%［3］。常规检测前S1，可避免HbeAg阴转产生的误导，对两对半检测起重要补充作用。HBV-DNA是HBV感染和观察疗效最直接特异的指标，多采用PCR检测。HBV-DNA阳性血清中前S1阳性率73%，甚至更高达80.39%［4］， HBV 以HBV-DNA检测为金标准（HBV-DNA，〈10e4/ml阴性〉来评价前S1和e抗原，前S1的灵敏度为51.4%。HBeAg的灵敏度为43.5%。说明前S1与HBV-DNA高度相关。常规检查前S1，操作简单，无须特殊环境及设备，价格仅为HBV-DNA检测的五分之一。
　　综上所述，前S1抗原和HBV感染复制密切相关。在没有条开展HBV-DNA检测，或病人经济条件限制情况下，前S1常规检测可辅助诊断HBV急慢性感染，判断预后和疗效观察。
【参考文献】
& 　　［1］
Theil mann L,Klinkert MQ,Gmelin K,et al.Detection of pre S1 Mproteins in serum and liver of HbsAg-positive patients:A new marker for hepatitis B virus infection［J］.Hepatology,):186
姚光弼.乙型肝炎病毒前s1蛋自及其临床意义［J］.国外医学流行病学、传染病学分册，）：15
田琦琦,贾克明.我国乙型肝炎病毒前C区变异的动态观察，中华肝脏病杂志,):1661
何浩明，姜秀云，孙贵.等.乙型肝炎患者血清前S1 S2蛋自检测的临床意义［J］. 中华流行病学杂志，):371
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论文写作技巧荆门市中医医院不孕不育症专科简介_荆门新闻网
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荆门市中医医院不孕不育症专科简介
　　生殖健康与不孕症专科是集男女不孕不育、性功能障碍、习惯性流产、性传播疾病等生殖系统疾病诊疗和优生优育咨询、遗传病诊断等多项医疗服务内容为一体的生殖临床诊疗专业科室。2016年，该科室从原妇产科独立分出，并设有自己的临床和独立实验室。
　　科室秉承&承载希望，孕育梦想&服务理念，以&关爱健康、热情周到&为服务宗旨，在中西医结合理论指导和临床实践的基础上，采用现代医学的成果和诊疗技术，形成了一套独俱特色的诊疗体系。科室先后派出业务骨干到北京医院三院生殖中心、首都医科大学附属复兴医院进修生殖相关手术技术；到武汉同济、武汉协和医院进修内分泌检查与咨询专业；到湖北十堰市人民医院生殖中心进修生殖遗传检查与咨询专业，科室人员均受到了良好的规范化和专业化培训，并多次参与国内外生殖遗传专业学术会议，随时跟进国内外生殖遗传方面前沿动态及新技术。
　　服务范围
　　女科：以阴式及宫腹腔微创手术为主体，包括妇科炎性疾病、妇科良性肿瘤、子宫内膜异位症、盆底障碍性疾病（包括盆腔脏器脱垂及尿失禁）、内分泌失调，以及早期妊娠无痛、可视、超导流产和中期妊娠引产。
　　生殖整形：处女膜修补、阴道紧缩术及盆底脏器脱垂修复。
　　男科：生殖感染、尿路感染、性功能障碍、前列腺疾病。
　　不孕不育诊疗：优生优育、男女性不孕不育；各种流产诊治，尤其是习惯性及免疫性流产；子宫内膜异位症不孕、内分泌失调性不孕、生殖感染型不孕、免疫性不孕。
　　生殖健康知识宣传指导：男女性心理健康、青春期保健、更年期保健、男女性生殖健康及避孕知识宣教。
　　地 址：门诊三楼不孕不育症科
　　科主任：杨丽丽
生殖健康专家坐诊通知
　　3月16日，我院特邀十堰市人民医院生殖中心享受国务院特殊津贴专家--王华教授来我院不孕不育症专科坐诊，欢迎广大患者前来咨询或预约。
　　坐诊地址：荆门市中医医院门诊三楼不孕不育症专科
　　咨询电话： 杨主任
　　王华教授，主任医师，享受国务院特殊津贴专家，湖北中医药大学硕士生导师。从事妇产科临床工作20多年，从事不孕不育及现代助孕治疗十余年，在垂体降调节、促排卵、取卵、胚胎移植等方面有很高造诣，主持湖北省首例试管婴儿胚胎移植技术，主持完成了体外受精与胚胎移植体系临床部分。开展了&生殖微循环研究&、&B超定位胚胎移植研究&等系列研究，所主持的&改进体外受精与胚胎移植技术的系列研究&项目获湖北省科技进步二等奖。
责任编辑：谭秋雨
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更昔洛韦治疗儿童传染性单核细胞增多症400例
作者：杨代珍&&&&作者单位：158100 黑龙江鸡西,鸡西市滴道区医院
观察更昔洛韦（丽科伟）对儿童传染性单核细胞增多症治疗观察。方法
随机对照方法将400例符合儿童传染性单核细胞增多症患儿，分为治疗组（350例）和对照组（50例）进行治疗，其他治疗方法相同。结果
更昔洛韦治疗组疗效明显，患儿热退时间明显短于对照组（P＜0.05），且无明显不良反应。结论
更昔洛韦是治疗传染性单核细胞增多症患儿最有效的药物。
【关键词】& 更昔洛韦 儿童传染性单核细胞增多症
&&& 丽科伟（通用名：注射用更昔洛韦）是继阿昔洛韦之后开发的广谱抗病毒药，目前已广泛应用于临床。笔者近6年来采用随机对照方法将400例符合儿童传染性单核细胞增多症(IM，简称传单）患儿，分为两组进行治疗，结果更昔洛韦组疗效明显，证明更昔洛韦是治疗传单患儿最有效的药物，现报告如下。
&&& 1& 临床资料
&&& 1.1& 一般资料& 随机将符合上述标准的病例分为治疗组（350例）和对照组（50例）。治疗组男188例，女162例，其中发热339例，咽峡炎342例，咳嗽94例，淋巴结肿大315例，肝肿大117例，脾肿大69例，皮疹37例；对照组男29例，女21例，其中发热42例，咽峡炎45例，咳嗽11例，淋巴肿大34例，肝肿大16例，脾肿大11例，皮疹9例。两组症状和体征轻重比例大致相同。
&&& 1.2& 诊断标准& （1）发热（可持续数天）；（2）咽峡炎；（3）颈淋巴结肿大；（4）部分患儿有咳嗽、鼻塞、眼睑肿；（5）肝脾肿大；（6）皮疹；（7）血常规：白细胞增高；分类：淋巴和单核细胞增高；(8)EB病毒抗体阳性或EBV-DNA阳性；（9）除外其他病毒、细菌、药物引起的传单综合征。具备前6条中任何3项及7~8条两项（或异淋5%~10%+EBV抗体阳性）加第9条可确诊。
&&& 1.3& 实验室检查& （1）治疗组入院时白细胞数>15.0&109/L 96例，异形淋巴细胞>0.20 34例，血红蛋白<100 g/L 16例，血小板15.0&109/L 16例，异形淋巴细胞>0.20 6例，血红蛋白<100 g/L 4例，血小板<100&109/L 4例。两组患儿EB病毒IgM抗体及EBV-DNA阳性率分别约为88%、62%。两组患儿白细胞数、异形淋巴细胞数、EB病毒抗体比例大致相同。
&&& 2& 临床观察
&&& 2.1& 治疗& 治疗组应用更昔洛韦（5~10）mg/（kg&d）,加5％葡萄糖每日1次或每日2次静脉滴注，对照组应用干扰素100万u/次，每天一次肌肉注射，或炎琥宁5~10 mg/（kg&d）加5％葡萄糖100 ml每日1次静脉滴注。两组均可使用对症治疗药物及酌情使用抗生素，7天为1个疗程。近年来由于在临床治疗中，应用更昔洛韦疗效高，无明显不良反应，所以临床治疗例数明显增多。
&&& 2.2& 观察内容& 每天专人记录体温及临床症状和体征，并在患儿出院后在血液门诊随访复查：（1）治疗前热程；（2）治疗后热退时间；（3）咽峡炎明显改善时间；（4）淋巴结脾肿大明显缩小时间；（5）异形淋巴细胞<0.10时间。见表1。表1& 两组患儿转归情况可以看出治疗组在热退、咽峡炎改善、淋巴结和肝脾肿大缩小、异淋减少、住院日数等的时间，较对照组明显缩短（t=2.018,P＜0.05）。
&&& 2.3& 疗效判定标准& 参考1990年张之南主编《血液病诊断及疗效标准》：（1）治愈：症状和体征恢复正常；（2）显效：症状和体征明显减轻；（3）有效：症状和体征稍减轻；（4）无效：症状和体征无改善或加重。
&&& 3& 结果
&&& 治疗组350例中总有效率94%；其中治愈238例（占68%）、好转91例（占26％），未愈21例（占6%）。对照组50例中总有效率72%；其中治愈28例（占56%），好转8例（占16%），未愈14例（占28%）。治疗组总有效率明显优于对照组。
&&& 4& 讨论
&&& IM是由EB病毒感染引起的一种单核-巨噬细胞系统急性增生性疾病,小儿期常见，近三年来发病率明显增多。该病虽有自限性，但有少数患儿早期出现并发症,或有反复发作,亦有患者呈缓慢恢复。该病病死率达1%~2%［1］。若有免疫缺陷的小儿可发生严重的、进行性的、有时为致死性的原发EB病毒感染。原发性EB病毒感染可引起广泛的淋巴细胞增生、发热、贫血、肝炎或暴发性肝坏死,而暴发性肝坏死是常见死因［2］。目前IM尚无特殊治疗方法。更昔洛韦是治疗疱疹类病毒感染的有效药物,其作用机制是抑制病毒的DNA复制,靶标是病毒DNA聚合酶。其抗病毒作用的特异性是一种特异性的病毒编码的胸腺嘧啶激酶(TK)决定的,TK确保局限于病毒感染的细胞,使这些核苷类似物特异性磷酸化［3］。
&&& EB病毒为DNA病毒，具有明显的嗜淋巴组织性，急性感染后免疫系统被活化，导致白细胞总数增高。以往应用干扰素、病毒唑、鱼腥草、阿昔洛韦等治疗，它们虽然对某些疱疹病毒表现出较高的选择性和活性，但其抗菌谱窄，作用机制单一，易产生抗药性。更昔洛韦（丽科伟）是新开发的广谱抗DNA病毒药，由湖北科益药业股份有限公司独家生产，它较好地解决了这一问题。更昔洛韦主要特点是疗效显著、作用迅速、不易耐药，且对多种耐药菌株仍很敏感，临床应用的安全性也较好。目前研究证明,抗DNA病毒药物更昔洛韦对病毒感染的淋巴细胞有高度亲和性,故能明显缩短白细胞总数及异形淋巴细胞恢复时间,能明显缩短平均住院日、体温恢复时间及肝、脾、淋巴结缩小时间,而且,对疱疹病毒科的HBV、ADV、VZV、CMV和HSV均有较强的作用［4］。
&&& 有报道更昔洛韦可使一过性粒细胞减少和影响肝脏功能。但临床应用中对粒细胞减少和谷草转氨酶轻度升高的患儿，同时服水解蛋白口服液，坚持用更昔洛韦治疗7~14天，复查白细胞和肝功能，证明随着病情的恢复，白细胞和肝功能也随之恢复正常。说明白细胞减少时不影响丽科伟的应用，肝功能不良不影响丽科伟的清除。本组病例中有48例出现皮疹，其中5例用丽科伟后加重，但停药2天皮疹未见减少，继续应用5~7天皮疹逐渐消失，无新皮疹出现，故认为出现皮疹与丽科伟无关，而是因病毒感染所致。
&&& 综上所述，更昔洛韦用于治疗传单疗效显著，且无明显不良反应，临床应用证明更昔洛韦是治疗儿童传染性单核细胞增多症疗效确切和显著的药物。
【参考文献】
吴瑞萍,胡亚美,江载芳.诸福棠实用儿科学.北京:人民卫生出版社，.
Bennett Plum.西塞尔内科学.西安:世界图书出版社西安公司,,962-966.
张兵，钟礼立，刘珊珊,等.更昔洛韦治疗小儿传染性单核细胞增多症疗效观察.中国医师杂志,）：.
张国元,黄榕,杨于嘉.更昔洛韦治疗小儿传染性单核细胞增多症临床疗效分析.中国当代儿科杂志,):691-692.
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论文写作技巧Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation | Protocol (Translated to Chinese)
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新世代的功能测定法如γ干扰素（IFN-γ）的酶联免疫斑点法，其检测细胞因子的产生在单细胞水平，并提供T细胞应答的定量和定性特征，可用于评估细胞介导的针对水痘 - 带状疱疹免疫应答病毒（VZV）。
Cite this Article
Salem Fourati, I., Grenier, A. J., Jolette, ?., Merindol, N., Ovetchkine, P., Soudeyns, H. Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation. J. Vis. Exp. (89), e51643, doi:10. (2014).
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水痘 - 带状疱疹病毒（VZV）是发病率和死亡率以下脐血移植（UCBT）的显著原因。出于这个原因，抗疱疹预防系统地施用给小儿脐血移植接受者，以防止水痘病毒感染相关的并发症，但没有强大的，基于证据的共识，它定义了最佳治疗时间。因为T细胞介导的免疫是负责水痘感染的控制，评估的VZV特异性T细胞反应的重建下列UCBT可以表示出对预防是否应保持或可停药。为此，一个特定的VZVγ干扰素（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISPOT）测定法的开发是由T淋巴细胞响应于体外刺激与照射减毒活水痘疫苗来表征的IFN-γ的产生。此法提供了水痘特定的C的快速，重复性好，灵敏的测量埃尔介导的免疫适于监测VZV特异性免疫的重构在临床环境和评估免疫反应对VZV抗原。
Introduction
在1989年第一次演出，脐血移植是越来越多地用作各种肿瘤和非肿瘤性血液疾病的儿童1治疗的一部分。水痘是一种细胞病变人力alphaherpesvirus这会导致两种不同的疾病，水痘（原发感染后），带状疱疹（激活后）。继原发感染，水痘持续整个背根神经节的感觉神经内避风的主机的使用寿命。其中最有威胁的感染性并发症以下UCBT是与水痘2-4关联。在我们的临床中心，在没有水痘预防，水痘水痘病的发病在3年累积发病率postUCBT为46％2。在这些患者中， 从头感染或VZV的激活通常与内脏传播到中枢神经系统，肺和肝5-7相关联。因此，阿昔洛韦，伐昔洛韦或泛昔洛韦预防通常给药至UBCT收件人8,9。然而，这种治疗策略不考虑VZV特异性T淋巴细胞或VZV特异性T细胞反应重建动力学的保护电位。随着国家扩大利用长期抗疱疹预防相关的潜在问题包括：a）病人过度治疗;二）抗病毒抗药性10,11的发展;和c）的VZV特异性免疫重建12,13减值。因为检测的功能VZV特异性T淋巴细胞相关性。和VZV感染长期保护的存在，改善临床结果4,14,15，监测细胞介导的针对水痘的免疫反应在移植后的时期，可能会导致更合理地使用抗病毒药物通过治疗使医生来区分谁的病人将受益于水痘预防从那些免疫系统能够控制VZV复制4,13的。 的IFN-γ酶联免疫斑点测定法被广泛地用于在多种试验系统及临床情况的监测细胞介导的免疫反应。斑产生下列显色底物的裂解，产生一个可见的和稳定的沉淀物在反应的位点。每个单独的点，从而代表一个单独的细胞因子产生细胞的足迹。 IFN-γ酶联免疫斑点法不仅测量单个细胞在体外的产生IFN-γ响应于体外刺激同源抗原的能力，但它也提供了在一个给定的细胞群体16,17响应单元的频率的估计。除了其高灵敏度，IFN-γ酶联免疫斑点法是直接执行，使得它的使用可能在旨在指导开始抗病毒治疗或终止个性化临床治疗方案的上下文。该过程详述如下describES是专门设计由外周血单核细胞下列体外刺激用VZV的抗原检测和测量产生IFN-γ的ELISPOT测定。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
本研究方案经朱圣 - 和Justine，蒙特利尔，魁北克，加拿大，那里的研究进行的制度伦理审查委员会。知情同意书，并寻求从所有研究参与者，他们的父母或法定监护人获得。在第一天进行的所有程序和2必须是无菌的条件下（ 即在层流罩）下进行。标准的安全程序来处理人体血液必须严格遵守。
1，涂料的板通过加入到每个孔中20微升35％乙醇中1分钟，透化聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在96孔MultiScreen IP白色的ELISpot板的底部。膜应该成为稍透亮。 使用MUL;立即用200μl1X磷酸盐缓冲盐水（137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10毫米的Na 2 HPO 4，2mM的KH 2 PO 4，pH 7.4的PBS）洗涤各孔3次声道音吸管或类似的装置。由于乙醇的残基可以影响细胞的活力和捕获抗体结合这一步是至关重要的。酶联免疫斑点法板是脆弱的，必须小心处理：使用自动洗板机，不推荐。 涂层的孔与10微升纯化的小鼠抗人IFN-γ捕获抗体稀释在1×PBS中的10微克/毫升的最终浓度。覆盖板与普通保鲜膜孵育过夜，4°C。
2，挡板空井，窃听他们干，并用200微升的1×PBS洗板5次。 填充孔用200μl的完全RPMI 1640培养基中孵育板2小时，在37℃（分块步骤）。 洗涤板5倍用200μl的1×PBS中并保持在孔中充满的1×PBS中，直到细胞准备进行电镀。
3，电池和电镀刺激准备peripheral血单核细胞（PBMC）从人的静脉血样离心上使用标准方法的Ficoll-Paque上的梯度。备选地，使用标准方法，解冻PBMC的等分试样在液氮下冷冻。在水套培养箱在5％CO 2气氛下后，最后离心后，重新悬浮细胞以2×10 6个细胞/ ml的终浓度，孵育过夜，在37℃。 从培养箱中取出PBMC重悬他们于5ml RPMI 1640完全培养基中的终体积。 在10微升从粘质沙雷氏菌 5分钟，在室温下遗传工程内切核酸酶的存在下培养PBMC。 除去PBMC的一个50μl的等分试样，并用50μl的台盼蓝染料混合。计数细胞，并用血球和显微镜检查（染色排除法）估算％的生存能力。各种自动化方法进行细胞计数和细胞活力罐人评价所以可以使用。 PBMC应& 95％存活。丢弃当样品生存能力低于95％。 离心机的PBMC，在700×g离心5分钟，弃去上清，重悬细胞以2×10 6个细胞/ ml的终浓度添加2％（V / V）灭活的人血清（HIS）的AIM-V培养基。保持在37°C，直到刺激混合物加入到平板。 加至孔中，1滴一次，加入100μl适当的刺激混合物。三刺激的混合物，应使用如下所述： 用AIM-V培养基补充有2％（V / V）灭活的人血清（IHS）作为阴性对照。 使用抗CD3单克隆抗体（克隆OKT3）稀释在AIM-V培养基补充有2％（V / V）的IHS至0.5微克/毫升作为阳性对照）的终浓度。 使用VZV抗原，无论是γ-辐射的形式（10,000戈瑞; 30分钟的曝光时间）减毒活疫苗VZV（1,350斑块形成单位[PFU] /毫升）的稀释泰德1:200在AIM-V培养基补充有2％（V / V）IHS）或1微克67肽（15个氨基酸残基）的基础上，VZV的顺序立即早期（IE63）磷蛋白合成的等摩尔混合物的。通过监测缺乏的细胞病变效应明显迹象后PBMC培养4天控制照射疗效。 准备一式两份的所有井。 加至各孔，一减少的时间，将100μl制备步骤5.4至适当的孔中的细胞。两个井应保持无细胞（阴性对照）。在水套培养箱在5％CO 2气氛下孵育20小时，在37℃。不要摇晃，移动或堆叠在另一个孵化过程中顶部的板块。
4，景点开发与检测弃去细胞用1×PBS洗涤板10倍的补充有0.05％（V / V）吐温20（PBST）。吐温20有助于分离已经坚持了我的PVDF细胞mbrane以下孵育过夜。 使用多通道移液管加入100微升的0.5毫克/毫升生物素标记的抗IFN-γ单克隆抗体（克隆4S.B3）稀释在1×PBS中含有0.5％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA）。孵育板2小时在室温下。 洗涤各孔6倍用PBST和添加每孔加入100μl链霉亲和有机共轭的碱性磷酸酶稀释1:1,000在1x PBS中含有0.5％（重量/体积）BSA中。覆盖板并孵育1小时，在室温下进行。 洗涤板3倍用PBST和3X用1×PBS。添加100μl的5
- 吲哚磷酸（BCIP）/硝基蓝四唑氯化物（NBT）底物溶液孵育5分钟，在室温下进行。 下运行蒸馏水冲洗板。取出的ELISpot板的底部部分，并用蒸馏水洗膜的两侧。空气干燥该板。 检查各孔，并用立体?列举的斑点issection显微镜或使用自动点计数器扫描板。保持板避光，如果他们不能检查在同一天。 平均斑点在相应的复孔计数的数量和从斑点中的测试孔计数的数目减去斑点在阴性对照孔计数的数目（无细胞）。 表达IFN-γ的生产为斑点形成单位的数量（SFU）每10 6个PBMC。 认为试验样品是阳性如果SFU的数量为& 50每10 6个PBMC和2个标准差（SD）以上的负对照（细胞+ AIM-V培养基中补充了2％（V / V）IHS）。 使用每孔400 SFU的值时，斑点更是不胜枚举进行计数。 测试是否酶联免疫斑点法数据是正态分布的，或不使用Kolmogorov-Smirnov检验。当数据是正态分布，采用学生t TES进行统计比较T（2组）或单因素方差分析和Bonferroni法检测后（多重比较）。如果数据不是正态分布，用曼-惠特尼U检验（2组）或Kruskal-Wallis检验和邓恩的后测（多重比较）。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
上面详述的IFN-γ酶联免疫斑点协议被开发，并在我们的实验室优化测量的幅度和针对VZV 4细胞介导的免疫应答的质量。可用于刺激步骤的VZV抗原的不同来源。这些措施包括：a）由水痘市售清洁剂灭活提取物感染的Vero细胞18;从具体的VZV编码的蛋白质，包括IE63 15和19的ORF4重叠合成肽二）池;三）减毒活水痘带状疱疹疫苗20;及d）VZV紫外线灭活抗原准备从破碎的VZV的上清液感染的MRC细胞14。在我们的例子中，减毒活水痘疫苗稀释液优于细胞培养，以保证均匀性抗原来源和准备，并限制文化的活的野生型VZV毒株和操作在临床环境中，其中院内transmissio得出VZVn是一个严重的问题10。此外，γ辐射被优选的，因为在比较精度与该剂量γ辐射的可交付过UV灭活21和因为不像紫外线，γ射线有效地穿透密封含有VZV的小瓶中。病毒性股票的照射导致从健康捐赠者的VZV抗原测试（ 图1）的所有稀释获得的VZV特异性IFN-γ产生细胞的PBMC样品中的频率始终高于估计。这可能是在细胞培养用减毒活水痘引起的细胞病变减轻影响的结果。 以确定哪个稀释的VZV抗原产生最大读数SFU中的每10 6个PBMC数量而言，IFN-γ酶联免疫斑点法，用γ的2倍稀释液进行照射减毒活水痘疫苗和从一组免疫岁的儿童获得PBMC样品9个月零12你们之间ARS谁了水痘和/或血清学检查阳性为水痘（N = 50）的历史记载。 。研究受试者参加的传染病门诊和朱圣 - 和Justine的特殊临床免疫学09年9月之间的IFN-γ产生细胞的使用1:200，1得到的平均频率之间观察到统计学显著差异： 400和1:800稀释的VZV抗原（P &0.0001，Kruskal-Wallis检验）（ 图2）。这些差距是由1:200稀释的差额入账（中位数=每10 6 PBMC 115.0 SFU;四分位数范围[IQR] = 75.0 -每10 6 PBMC 232.5 SFU）及1:800稀释（中位数= 50.0 SFU每10 6个PBMC，IQR = 20.0 -每10 6个PBMC 105.0 SFU）之间，以及1:400稀释（中位数=每10 6个PBMC 92.5 SFU，IQR = 52.5 - 177.5每10 6个PBMC中的SFU）和1:800稀释（P &0.001 和 p </EM& &0.01，邓恩的多重比较检验）（ 图2）。出于这个原因，在1:200稀释的γ照射减毒活水痘疫苗是选择使用的VZV特异性细胞介导的免疫反应的常规测量。 来确定IFN-γ的产生是否驻留在CD4 +和/或CD8 + T淋巴细胞亚群，从健康供体获得的外周血单个核细胞的样品用抗-CD4或抗-CD8抗体偶联磁珠进行的CD4 +或CD8 +细胞的耗竭根据制造商的指示。在一致性与先前公布的报道22,23，CD4 +细胞耗竭导致了显着的减少的IFN-γ产生细胞的使用1:100，1:200和1:400稀释的VZV抗原的获得的频率，而CD8 +细胞的耗竭并没有导致这种减少与阳性对照秒（刺激抗CD3单克隆抗体）没有类似的影响（ 图3）。这些结果表明，大部分产生的IFN-γ响应于刺激的VZV抗原的细胞是CD4 + T细胞。另外，这些结果可能是源于从PBMC池耗尽CD4 +抗原呈递细胞（ 即单核细胞，树突状细胞），导致演示VZV的水平降低抗原到响应的CD8 + T淋巴细胞。利用辐照水痘是不太可能朝着CD4支配响应的倾斜贡献，因为类似的结果通过使用不同的技术和抗原来源14,21,22其他群体获得。代表酶联免疫斑点井的低倍显微照片示于图4。 问题/ 可能的原因解决方法/解决方案&/ TD& 高背景/没有准确定义的或融合的斑点高数量的死细胞。 前培养的设置和刺激评估细胞活力。 不足膜预润湿步骤。 请务必尊重预湿时间和膜转1分钟后为灰色。 35％的乙醇，应立即用前配制。 发病期间板块移动。 不要移动板，以避免不良的定义蜗牛线索点。 清洗步骤。 手动清洗比洗板机更加高效。 形成蛋白质聚集体。 同时筛选捕获和检测抗体，以减少背景和假阳性斑点。 中学和检测抗体的浓度。 生物素化调节本身condary /检测抗体浓度，以减少背景。 冷发展中国家试剂。 带基底至室温，以避免不发达。 无斑点/空白孔定义不清的斑点。 在孵化期间切勿堆放板有一个均匀的温度在不同的井。 刺激基板没有充分的准备。 使所述肽混合物等分至室温15分钟，以避免形成晶体。 细胞聚集。 重悬细胞分化成单细胞悬液，以避免斑形成单位低估。 细胞没有适当刺激。 使用多克隆活化剂作为阳性对照。 抑制吐温20的酶反应。 为?板用PBS加入BCIP / NBT底物溶液之前。 错的抗体对。 确保捕获和检测抗体与不同的抗原表位反应。
表1。其他疑难排解。
对IFN-γ产生细胞的频率灭活活VZV疫苗的γ-照射的图1。影响使用测定IFN-γ酶联免疫斑点。VZV特异性IFN-γ酶联免疫斑点是根据使用的PBMC从控制志愿者协议文本所描述的进行和γ照射（10,000戈瑞）连续稀释减毒活疫苗的VZV抗原。数据代表重复measureme的平均值NTS和误差棒代表平均值的标准误差。外周血单个核细胞：外周血单个核细胞; SFU：斑点形成单位;水痘：水痘带状疱疹病毒。
水痘的图2。定量特定细胞中的孩子与以前感染的文件证明介导的免疫反应VZV。VZV特异性IFN-γ酶联免疫斑点是由于使用外周血单个核细胞分离科目水痘病史（N = 50）根据协议文本进行描述和γ照射（10,000戈瑞）连续稀释减毒活疫苗的VZV抗原。横线代表中位数，方框表示四分位数间距（IQR）和晶须代表值的范围。外周血单个核细胞：外周血单个核细胞; SFU：斑点形成单位; VZV：水痘带状疱疹病毒 。
图3。CD4 +或CD8 +细胞上作为使用的IFN-γ酶联免疫斑点。枯竭的CD4 +或CD8 +细胞和VZV特异性IFN-γ酶联免疫斑点法测定IFN-γ产生细胞的频率损耗的影响进行了下所述进行采用外周血单个核细胞从控制志愿者和γ的连续稀释照射（10,000戈瑞）协议文本减毒活疫苗的VZV抗原。数据代表重复测量和误差线的平均值代表平均值的标准误差。外周血单个核细胞：外周血单个核细胞; SFU：斑点形成单位;水痘：水痘带状疱疹病毒。 load/fig4highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/fig4.jpg“/&
图4。代表酶联免疫斑点法井。VZV特异性IFN-γ酶联免疫斑点是由于使用的PBMC从五个控制志愿者和γ的连续稀释照射（10,000戈瑞）减毒活疫苗的VZV抗原根据协议文本描述进行。第一行：阴性对照（AIM-V培养基补充有2％（V / V）IHS）;第二行：阳性对照（抗CD3单克隆抗体）;第三排：VZV抗原。在弯道上的数字代表每个SFU以及使用自动点计数器测量。外周血单个核细胞：外周血单个核细胞; SFU：斑点形成单位;水痘：水痘带状疱疹病毒; IHS：灭活的人血清。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
修改和故障排除：IFN-γ酶联免疫斑点测定法已被用于检测细胞介导的针对多种微生物病原体，包括人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的24,25，丙型肝炎病毒（HCV）26免疫反应， 27，和结核杆菌 28,29，只是仅举几例。在这里，我们描述的IFN-γ酶联免疫斑点法的发展来衡量细胞对免疫，用在定义儿科复苏脐血移植受者的VZV特异性免疫重建相互关系的希望。 该测定法的主要特征是4倍。第一，它不需要事先在体外扩增的T细胞，这是耗时的。第二，可以使用冷冻保存的PBMC样品，这是最好的，以尽量减少批间变异性来进行。此外，冷冻保存和并行处理能很好地适应longitudiNAL研究，这要求样品分批进行处理。第三，为防止PBMC，用超纯从粘质沙雷氏菌的基因工程核酸内切酶被用于治疗的解冻过程中遇到的细胞聚集。使用被放置过夜，在室温下处理前的血样时解冻后的PBMC细胞聚集更频繁地发生。基因工程化核酸内切酶从粘质沙雷氏菌的掺入是已知不影响在自核酸水平低SFU的术语细胞活力，细胞表面标志物的表达和响应于刺激同源抗原的使用和暴露的持续时间短22。第四，γ照射减毒活水痘疫苗是用来刺激外周血单个核细胞。它更喜欢在细胞培养中获得的VZV为了保证均匀性抗原剂量和准备，克服需要在临床上，其中病人的安全和操作现场VZV实验室工作人员是一个大问题。两者合计，这是在VZV-酶联免疫斑点法引入的修改的目的是要使其更好地适应在临床环境中使用。 相对于现有方法的技术意义局限：简单，灵敏的和可重现的方法是必需的，以便测量在临床随访的上下文中针对微生物抗原的宿主细胞介导的免疫反应。 IFN-γ酶联免疫斑点是可以在静脉血标本采用相对较低的高科技设备（离心机，培养箱，解剖显微镜）来执行一个强大的，可重复的和翔实的分析。然而，它不容易允许同时检测多种细胞因子和细胞表面标记物的。传统的体外 T细胞增殖测定法，其中有经典被用于CD4 +和CD8 +的枚举抗原SPECIFIC T细胞的反应，是劳动密集型的，缺乏敏感性并往往从批间变异30,31的高度受损。另一方面，细胞毒性T淋巴细胞测定（CTL）的基础上，装入51 Cr和有限稀释法自体靶的裂解往往取决于耗时体外扩增步骤来量化抗原特异性CD8 + T细胞，存在于一低前体频率32,33。流式细胞仪为基础的分析可以测量细胞因子的分泌下列抗原刺激（细胞内细胞因子染色（ICS））34,35也可以用于表征抗原特异性免疫应答。 ICS允许同时检测细胞因子的产生和在单细胞表型标志物的细胞表面表达。 ICS的灵敏度进行比较，以该酶联免疫斑点的，但它需要较大的单元36,37的号码。方法是利用荧光I类或II类肽-MA约旦组织相容性复合物（pMHC）寡聚物（pMHC四聚体）38-40是精确的并且使淋巴细胞亚群的基础上的细胞表面标记物的表达多参数表征。然而，的pMHC四聚体染色，需要患者的人类白细胞抗原（HLA）类型，它可以是繁琐并限制患者登记到一个给定的研究的现有知识。这种技术的另一个限制是的pMHC四聚体染色，主要使T细胞表达培养基中，以高亲和力T细胞受体（TCR）41的检测。另一方面，CD8 + T细胞表达不由的pMHC四聚体染色的低亲和性TCR可以容易地使用的IFN-γ酶联免疫斑点41检测到。此外，的pMHC四聚体可结合到所谓的耗尽CD8 + T淋巴细胞是普遍存在于慢性病毒感染42,43，从而倾斜的抗原特异性细胞介导的免疫应答的功能性评估。国际泳联LLY，住房抵押贷款公司四聚体染色和ICS通常需要训练有素的人员，相对昂贵的试剂，精密仪器和专用设备，使这些技术非常难以在临床随访的设置来实现。 未来的应用：双色能够同时检测到生产都IFN-γ和IL-2的44和45已产生显著的兴趣，因为它们允许抗原的多功能性的评估特异性T双核和三色FLUOROSPOT方法酶联免疫斑点检测淋巴细胞，它是有效的细胞介导的免疫应答46的重要特征。 本协议中的关键步骤：必须附加的技术问题给予慎重考虑。由于许多变数会影响现场质量（ 即大小和密度）和麻木呃，坚持协议是必须实现的敏感和可重复性的结果。一贯使用特定品牌的单克隆抗体（捕获和检测），酶联免疫斑点板的PVDF膜，和35％的乙醇膜处理之前，涂层具有很高的重要性。例如，过度治疗与乙醇可以影响测定和斑点质量的性能。为了防止获得无意义的井（ 即 & 300点），我们建议使用不超过2×10 5 PBMC每口井。当遇到抗原特异性T细胞的低频率，检测灵敏度可以通过prestimulating细胞在体外与同源抗原可增强或扩展它们与多克隆活化剂，如植物血凝素（PHA）历时经界定的时间周期（通常为3-7天）38 。然而，对于本文中所呈现的VZV ELISPOT测定最终的优化过程不包括体外预刺激和/或扩展的步骤。数量与品质的影响斑y的相似超过16-21小时的潜伏期范围。超过21小时的潜伏期，斑点往往更加分散，有时重叠，使他们的枚举更加困难。此外，移动板而细胞培养可导致定义不清蜗牛线索斑点，也同样更难以计数。其他疑难排解提示列于表1中 。 当使用自动点计数器，灵敏度和光斑尺寸浇口使用阳性对照（抗CD3单克隆抗体）和阴性对照（AIM-V培养基补充有2％（V / V）的IHS）来设置。现货枚举过程中要考虑的重要特点是尺寸和形状（ 图4）。前者允许从后台斑点，应该被忽略区分T细胞源性细胞因子的斑点。斑数目提供的VZV特异性T细胞的频率存在于一个给定的PB的估计MC采样，而现货大小反映了多少的IFN-γ由每个单独的细胞产生。 就我们所知，这是唯一的IFN-γ酶联免疫斑点法，使得使用γ照射减毒活水痘疫苗的抗原4。重叠的合成肽（15聚体）的电池组件也被用作抗原，其中包括基于所述VZV IE63磷蛋白的氨基酸序列的肽的混合物。 IE63是高度免疫原性和47似乎是病毒感染，并建立延迟48至关重要。 IE63特异性T细胞在健康的VZV血清阳性供体15，这表明，IE63是细胞介导的免疫是针对VZV的一个重要的目标被检测到。然而，反应性细胞被认为是主要的CD4 + T细胞15。 将VZV IFN-γ酶联免疫斑点法曾供?乌尔组，以评估28名儿童谁接受脐血移植治疗肿瘤或遗传性血液疾病4 VZV特异性T细胞反应。本研究的过程中得到的结果表明，CD4 +和CD8 + T细胞亚群被牵连的IFN-γ的产生和幼稚CD8 + T细胞区室中的该重组导致更健壮的VZV特异性细胞介导的免疫应答术语的IFN-γ的生产。重要的是，这些结果还表明，每10 6 PBMC超过150 SFU的检测是与T细胞介导的保护，防止水痘感染或再活化4保持一致。然而，对于VZV特异性细胞在脐血移植的情况下介导的免疫和随后的免疫重建或缺乏该阈值将其拥有更大的前瞻性多中心研究进行验证。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgements
作者要感谢研究参与者和他们的父母。我们还要感谢Réjean拉波因特博士（覃巴黎圣母院，蒙特利尔，加拿大）访问他的酶联免疫斑点读者，鲁波亚历山德罗夫进行统计分析博士和丹尼斯布莱，桑德拉·卡隆，Silvie瓦卢瓦和马丁卡蒂的专家技术援助。支持由乐全宗D&#39;操作倒莱PROJETS去RECHERCHE倩碧等科特迪瓦评价; DES技术（朱圣 - 和Justine）到HS和PO，由La基金会中心去cancérologie查尔斯 - 布鲁诺，并通过对白血病和淋巴瘤协会补助加拿大。 ISF是由来自LA基金会朱圣 - 和Justine和乐全宗德拉RECHERCHE魁北克 - 桑特（FRQS）奖学金支持。 AJG奖学金是从微生物学，传染病学与免疫学，蒙特利尔大学（加布里埃尔 - 侯爵奖学金），FRQS部的收件人，以及加拿大卫生研究院?ESEARCH（CIHR）。 NM是由拉朱基金会圣 - 和Justine，科尔基金会和FRQS支持。
Catalog Number
Leucocep tube
12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&
Ficoll-Paque
GE Healthcare
17-1440-02
Protect from light.
Benzonase nuclease
Keep at -20 &#176;C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate
Sterile with pore size of 0.45 &m.&
Mouse anti-human IFN-& capture antibody
BD Biosciences
NIB42 clone.&
Pepmix VZV IE63&
JPT Peptide Technologies
PM-VZV-IE63
Dissolve contents of one vial in 40 &#956;l of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-& monoclonal antibody
BD Biosciences
4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&
Bio-Rad Life Science
Dilute for use on the same day.
Bio-Rad Life Science
Protect from light.
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