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SUMO基因的内在原核启动子活性及其在大肠杆菌蛋白表达系统中的应用.pdf
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文档介绍：生物工程学报,;:??...,...基因的内在原核启动子活性及其在大肠杆菌蛋白表达系统中的应用亓燕红,邹竹荣邹华英范云六张春义山东农业大学农学院,泰安云南师范大学生命科学学院,昆明云南省农业科学院院办档案科,昆明中国农业科学院生物技术研究所,北京摘要:融合系统已成为目前大肠杆菌重组蛋白生产的重要手段,但在载体构建效率和蛋白可溶性等方面仍有待改进。本研究在克隆酿酒酵母基因时意外发现具有组成型原核启动子活性;而且经软莓程序预测发现大多数物种基因编码区都具有依赖的原核启动子。进一步通过整合启动子和末端位点特性以及引入标签和超酸增溶标签,构建了基于’融合基因的一系列通用克隆表达载体,并通过蓝白斑筛选和?分析进行了多个靶蛋白基因的克隆和表达,结果表明实现了基因表达载体的快速构建、蛋白高可溶性表达和关联蛋白的共表达等目标。因此,集成诸多特性而改良的融合技术可以成为大肠杆菌蛋白表达系统的有力工具,建立的共表达载体系统还可以用作研究细胞内蛋白间的相互作用。关键词:基因,原核启动子,融合系统,共表达,大肠杆菌●●■●■●■■●■●
,,,,,,’,,,,,,,,,,:,;:,:.,:.:..:?;?:...国家自然科学基金.,国家重点基础研究发展计划计划.资助。亓燕红等:基因的内在原核启动子活性及其在大肠杆菌蛋白表达系统中的应用:,,,.,.,一,.’,?,’.,?.,?.,.,?¨.:,,?,术已成为目前大肠杆菌重组蛋白表达和纯化的重要在真核生物泛素家族成员中,.,小泛素相关修饰物具有手段。多种重要的生物学功能。化修饰介导靶蛋白尽管如此,融合系统在载体构建效率和分子定位和功能调节,在转录调控、核质转运、信蛋白可溶性等方面仍有待改进。在本实验中,我们号转导、修复和细胞周期调控等方面均发挥着发现酿酒酵母基因具有组成型原重要作用之。核启动子活性。利用此特性,结合引入末端近年来,作为端融合标签在大您现在的位置： >>
人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达
发布时间： 来源：安徽省医学协会信息中心
作者：董伟，董晓慧，楚雍烈，杨娥，胡刚，郑建武
【关键词】 基因表达 摘要：目的 构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI) N端193个氨基酸的重组表达质粒，诱导表达BPI193重组蛋白。方法 应用RTPCR的方法从HL60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列，克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193，转化大肠杆菌BL21菌株，用IPTG诱导表达蛋白。应用SDSPAGE检测蛋白表达情况，计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比；Westernblot技术检测表达蛋白的特异性。结果 从HL60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段，构建了TBPI193亚克隆和PETBPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导，经SDSPAGE检测表明，成功表达了6HisBPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Westernblot检测显示表达产物具有特异性。结论 成功构建了PETBPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内，诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。
关键词：杀菌/渗透增强性蛋白；基因表达；大肠杆菌
Expression of human bactericidal/permeability increasing proteinNterminal fragment in E.coli
ABSTRACT: Objective To construct a prokaryotic expression plasmid of cDNA sequence encoding first 193 amino acids of BPI Nterminal and to express it in E.coli BL21. Methods Total RNA was extracted from HL60 cell and then was amplified by using RTPCR. The PCR product was cloned into pMD18T vector. BPI193 gene was directly cloned into PET28a plasmid on the role of T4 DNA ligase. PETBPI193 recombinant expression vector was transformed into competent E.coli BL21 and protein expression was induced by IPTG. Fusion protein was detected by SDSPAGE and Westernblot. Results A 579bp DNA amplicon was amplified by RTPCR. TBPI193 subclone and PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. 6HisBPI193 fusion protein containing 193 amino acids of BPI Nterminal was expressed by IPTG induced method. Fusion protein was detected by SDSPAGE and confirmed by Westernblot. The expressed fusion protein constituted 12% of total bacterial protein. Conclusion PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. To transform PETBPI193 recombinant plasmid into E.coli BL21 and 6HisBPI193 fusion protein was expressed by IPTG induced manner.
KEY WORDS: bactericidal/permeabilit E.coli
迄今为止，对脂多糖引起的并发症，如内毒素血症与败血症休克仍没有有效的治疗手段，临床治疗急需新的抗革兰阴性(G-)菌感染的药物。人杀菌渗透增强性蛋白(bactericidal/permeability increasing protein ，BPI)是对细菌高度稳定的非催化蛋白，主要存在于人及哺乳动物多形核白细胞(PMN)的嗜天青颗粒中,也可微量表达于PMN和单核细胞表面[13]。最新研究表明，BPI还可表达于嗜酸性粒细胞和上皮细胞[45]，它不仅具有特异性杀伤G-菌的作用，还可以中和内毒素，是一种具有广阔应用前景的“新型抗生素”[6]。在本实验中，我们建立了稳定表达BPI氨基端(BPI193)的原核表达系统，获得了高产量的纯化蛋白，为进一步研究BPI在体内外的生物活性，研发新的BPI产品创造条件。
　　1 材料与方法
1.1 细胞株、菌种和质粒 HL60细胞株由第四军医大学微生物教研室雷迎峰博士惠赠；E.coli DH5α和E.coli BL21为本室保存菌株；pMD18T 载体为Takara公司产品；PET28a原核表达质粒为Novagen公司产品。
1.2 主要试剂 Trizol为Invitrogen公司产品；cDNA第一链合成逆转录试剂盒购自Fermentas公司；XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4DNA连接酶均为Takara公司产品；DEPC为Sigma公司产品；DNTPs购自北京鼎国生物公司；小剂量质粒提取试剂盒和DL2000 DNA marker购自北京天为时代公司，小分子量蛋白marker购自华美公司；溃疡性结肠炎患者血清由西安交通大学医学院第二附属医院检验科李步荣医师惠赠；山羊抗人HRPIgG购自博士德生物公司；1640培养基购自Gibco公司；DNA凝胶回收试剂盒为北京赛百盛公司产品。
1.3 引物的设计与合成 根据GenBank数据库已收录的BPI cDNA的基因序列，借助于软件Primer Premier 5.0和DNA club设计了扩增BPI 1193个氨基酸的上下游扩增引物。
P1 5′ CTGGATCCATGGTCAACCCTGGCGTCGT 3′(BamHⅠ)
P2 5′ CCGCTCGAGTTACAGAGTCTGGAAATAAGG 3′(XhoⅠ) 在引物的5′端分别添加了BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，以确保酶切后可以插入PET28a原核表达载体中，并且读码框正确，还添加了起始密码ATG和终止子TAA。扩增的BPI位于124-702bp，DNA长度为579bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
1.4.1 RTPCR扩增目的基因 用Trizol试剂从HL60细胞中提取总RNA，按试剂盒说明反转录出cDNA第一链，然后进行PCR扩增目的基因。经15g/L的琼脂糖凝胶电泳分析结果后，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。通过10g/L的琼脂糖凝胶电泳观察回收情况并目测定量。
1.4.2 PCR产物与T载体的连接及鉴定 按照pMD18T载体说明书， 进行PCR回收产物和pMD18T载体的连接反应。将连接产物转化感受态E.coli DH5α，经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落，然后用PCR、限制性内切酶分析和DNA测序证实BPI193是否插入T载体以及基因序列有无突变。
1.4.3 PETBPI193重组质粒的构建 分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切TBPI193和原核表达载体PET28a，酶切产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，用北京赛百盛公司凝胶回收试剂盒回收，DNA定量后在T4DNA连接酶的作用下将BPI193定向克隆入原核表达载体PET28a中，构建重组的原核表达质粒PETBPI193。转化大肠杆菌BL21菌株，筛选出阳性菌落，并采用PCR和限制性酶切技术鉴定，得到表达菌。
1.4.4 目的蛋白的诱导表达和鉴定 用IPTG诱导表达菌，采用不同的IPTG诱导浓度(1、2、3、4mmol/L)和诱导时间(1、2、3、4、5、6h)，应用SDSPAGE技术检测细菌蛋白表达情况，获得最佳表达条件，计算机薄层扫描分析表达目的蛋白占菌体总蛋白百分比。应用WesternBlot技术检测表达蛋白的特异性。
　　2 结果
2.1 RTPCR扩增结果 RTPCR反应后取5μL经15g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出约602bp的基因片段，与预期大小相符。
2.2 BPI193基因片段与T载体的连接 将获得的BPI193基因片段RTPCR的产物凝胶回收后，按照pMD18T载体说明书操作，双酶切结果切出约585bp和2690bp左右的基因片段，与预期相符(图1)。送上海华诺公司测序，证明BPI193基因序列完全正确，命名为TBPI193。
图1 重组质粒TBPI193的PCR、双酶切鉴定（略）
Fig.1 Identification of plasmid TBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion
1: DL2000 DNA 2: BPI193 from PCR; 3: restriction enzyme digestion with BamHⅠ and XhoⅠ
2.3 PETBPI193重组质粒的构建 用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切TBPI193和PET28a质粒，凝胶回收试剂盒回收得到纯化产物。用T4连接酶连接，转化E.coli DH5α，卡那霉素筛选细菌，并进行PCR和BamHⅠ＋XhoⅠ双酶切鉴定，PCR扩增出约602bp的基因片段，双酶切获得约585bp和5329bp的基因片段，与预期相符(图2)。
图2 PETBPI193重组质粒的PCR、酶切鉴定（略）
Fig.2 Identification of recombinant plasmid PETBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion
1: DL2000DNA 2: PCR product of TBPI193; 3:PCR product of PETBPI193; 4: double restriction enzyme digestion with BamHⅠ and XhoⅠ
2.4 BPI193重组蛋白的表达和鉴定 用IPTG诱导表达菌BL21，发现随时间延长蛋白量有所增加，在4h时表达量较大。在不同IPTG浓度的条件下诱导蛋白表达， 2-3mmol/L时蛋白表达量比较丰富。诱导后在21ku左右处有蛋白表达，该蛋白大小与预期相符。经薄层扫描分析，表达蛋白量占菌体总量的12%左右。可溶性分析表明表达的BPI193重组蛋白以包涵体的形式释放(图3)。Westernblot鉴定，结果表明用IPTG诱导后的PETBPI193表达菌在相应约21ku位置出现特异性染色带，而未诱导的表达菌没有该条带(图4)，说明表达的目的蛋白具有特异性。
图3 重组蛋白BPI193在IPTG诱导浓度不同时的表达情况（略）
Fig.3 Expression of recombinant protein BPI193 at different inducer concentrations
1: lower MW 2: noninduced PETBPI193; 3-6: IPTG induced PETBPI193 at 1, 2, 3, 4mmol/L
图4 重组蛋白BPI193的Westernblot鉴定（略）
Fig.4 Identification of recombinant protein BPI193 by Westernblot
1: noninduced PETBPI193; 2: induced PETBPI193
　　3 讨论
根据BPI氨基端的基因序列设计了1对特异性引物，采用RTPCR的方法从HL60细胞中成功扩增了602bp的基因片段，与预期的目的基因片段大小相符。将BPI193基因片段克隆入pMD18T载体，构建TBPI193重组质粒。转化E.coli DH5α，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，经PCR和限制性内切酶鉴定分析(BamHⅠ和XhoⅠ双酶切)，均获得了与预期相符的实验结果。经DNA测序分析，本实验获得的BPI193基因序列与文献报道完全一致，没有突变。
PET28a为原核表达载体。将BPI193基因片段定向克隆入PET28a原核表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，初步筛选出阳性克隆后，通过菌落PCR以及BamHⅠ和XhoⅠ双酶切分析进一步鉴定，与预期结果相一致。最后再进行DNA测序分析，确证BPI193基因片段准确无误的正向插入到表达载体中，并且BPI193的N末端与6个组氨酸相连接。PETBPI193重组表达质粒构建成功。
PETBPI193重组表达质粒转化表达菌E.coli BL21，经过IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的预期重组蛋白，其分子质量为21ku左右，并且可以与BPI抗体特异性结合，充分证明BPI193表达成功。
传统制备BPI多采用柱层析的方法，国外获得BPI N端功能性片段多采用真核系统表达[611]，但这些方法生产条件要求比较高，消耗巨大，影响了临床应用。研究表明BPI糖基化部位与蛋白的活性没有显著关系，BPI是否糖基化对于抗体与抗原的识别来说没有明显影响[12]。本研究采用原核表达系统表达BPI193重组蛋白，大大降低了生产成本，为后续的实验研究奠定了基础。
本研究选用PET28a作为原核表达载体，它含有T7启动子，是一种T7噬菌体表达系统，具有能转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录基因的优点。其多克隆位点上游有6个组氨酸和凝血酶位点，可利用固化Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白，还可以用凝血酶切割纯化的融合蛋白，从而获得重组的目的蛋白。是一种较好的表达载体。
为了获得最优化的蛋白表达条件，在IPTG终浓度为1mmol/L时延长表达时间，发现随时间延长蛋白量有所增加，但增长幅度不大，在4h时表达量较大。在不同IPTG浓度的条件下诱导蛋白表达，发现2-3mmol/L时蛋白表达量比较丰富。生长温度可能是影响大肠杆菌高水平表达的主要因素之一，通过试验确定最佳温度是表达外源蛋白的关键。本实验分别在加入IPTG后于37、35、33℃进行BPI193重组蛋白的诱导表达，虽然几种温度条件下融合蛋白都可以表达，但温度较低时蛋白表达量更加丰富，表达也比较稳定。
BPI193基因片段被定向克隆于PET28a原核表达载体后，其N端与6个组氨酸形成融合蛋白，并在IPTG的诱导下得以表达。经蛋白的可溶性分析显示，BPI193与组氨酸融合蛋白在细菌中主要以包涵体的形式进行表达，而在细菌裂解液上清中没有检测到BPI193融合蛋白。虽然反复优化诱导表达条件，但BPI193重组蛋白总是以包涵体的形式存在。文献中也提示，几种利用原核表达系统表达人BPI时，目的蛋白也总是以包涵体的形式释放。我们推测可能与以下因素有关：①大肠杆菌BL21进入对数生长期时间短，生长速度快，由于细菌生长过度或者生长过速加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体；②BPI193是BPI N末端前193个氨基酸，包含了3个与生物活性密切相关的区域，具有完整BPI特异性杀伤GNB、结合及中和LPS的能力。大肠杆菌本身就是革兰阴性菌，因此对于E.coli BL21来说，BPI193重组蛋白具有细胞毒性，可能会对细菌产生杀伤作用。所以细菌在合成过程中将蛋白纳入包涵体中，消除或减弱蛋白的生物活性，减轻对宿主菌的毒性作用。BPI193重组蛋白以包涵体的形式存在有助于表达产物的分离和提取，也可以减少胞内蛋白酶对蛋白的破坏和降解。因此，在本实验中具有有利的方面。但是，要获得具有功能性的重组蛋白还需要进行复性处理，回复蛋白的空间结构和生物活性，这会给生产使用带来一些麻烦，有待进一步完善。
虽然经过多种方法优化蛋白表达条件(包括延长诱导时间，增加诱导剂浓度，降低诱导时细菌培养温度)，但是BPI193融合蛋白的表达量仍然很低，经分析只占菌体总蛋白的12%左右。这可能是因为：①诱导条件没有达到最优，诱导前后细菌培养的条件不合适；②Bluow等[13]研究发现，完整的BPI以及含有BPI C端和LBP N端的嵌合体都可以稳定的储存在细胞中，而缺失了C端的BPI在储存过程中会被降解。所以，推测部分BPI193与组氨酸的融合蛋白在表达过程中可能被细菌降解。这尚需在今后的实验中进一步研究。
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