特殊α-珠蛋白基因结构合并东南亚缺失的α-地中海贫血1例--《临床检验杂志》2013年08期
特殊α-珠蛋白基因结构合并东南亚缺失的α-地中海贫血1例
【摘要】：目的探讨1例特殊α-珠蛋白基因结构合并东南亚缺失的α-地贫患者的分子遗传学机制。方法用血红蛋白(Hb)电泳分析该患者Hb含量,裂口PCR(gap-PCR)法检测缺失型α-地贫基因,反向斑点杂交技术(RDB)检测非缺失型α-地贫基因和β-地贫基因突变。结果 Hb电泳结果显示,该患者HbA含量为93.43%,HbA2为6.57%;缺失性α-地贫的电泳结果出现1 900、1 700、1 200 3条罕见条带;非缺失型α-地贫基因检测未发现HbCS、HbWS、HbQS突变;β-地贫基因突变为β41-42M/βN基因型。结论该患者为α-珠蛋白基因结构(α2-α2α1)合并东南亚缺失导致的非Hb H病,且存在β-地贫,临床症状不明显。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R556【正文快照】：
血红蛋白H病(Hb H)于1955年在美国和希腊同时发现,我国于上世纪60年代初在浙江地区首次发现。余新圆等[1]报道广西地区儿童Hb H病以缺失型为主,占52.0%,其中又以(--SEA/-α3.7)多见,占33.5%。本院发现1例含特殊组成的α-珠蛋白基因结构合并东南亚缺失的地中海贫血(地贫)患者,
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京公网安备75号东南亚缺失型α地中海贫血的 聚合酶链反应快速诊断技术及产前诊断-医学教育网-青年人
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东南亚缺失型α地中海贫血的&聚合酶链反应快速诊断技术及产前诊断
来源：青年人()&更新时间： 19:31:54 &【字体： 】
　【摘要】　目的　针对东南亚缺失型α地中海贫血（-　-SEA）建立一种快速、简便的聚合酶链反应（PCR）基因诊断技术，并初步应用于高危胎儿的产前诊断。方法　采用跨越断裂点的PCR设计方案，其中一对引物用于扩增-　-SEA缺失基因，另一对引物设计在-　-SEA、-α3.7、-α4.2的公共缺失区域，用于扩增正常的α珠蛋白基因，两对引物在单管中反应。用该方法对8例高风险Bart’s水肿胎进行产前诊断。结果　-　-SEA缺失基因的扩增产物为740bp，正常等位基因的扩增产物为1052bp。进行产前诊断的8例高风险Bart’s水肿胎，检出正常胎儿3例，-　-SEA杂合子3例，Hb Bart’s水肿胎儿2例。结论　该法快速、准确，可作为常规方法用于临床样品的分子筛查及Bart’s水肿胎和缺失型HbH病的产前诊断。　　【关键词】　α地中海贫血；　聚合酶链反应；　产前诊断；　基因
Rapid detection of α-thalassemia of Southeast Asian deletion by polymerase chain reaction and its application to prenatal diagnosis
XIAO Weiwei, XU Xiangmin，LIU Zhongying. Institute of Molecular Biology, First Military Medical University,Guangzhou　510515,China
　　【Abstract】　Objective　To establish a rapid and simple polymerase chain reaction(PCR) method for detecting α-thalassemia of Southeast Asia deletion，and apply it to the prenatal diagnosis for high risk fetuses. Methods　 Two pairs of primers were designed：one pair bridging the breakpoints to identify the specific deletion, the other located in the common deletion region of -　-SEA, -α3.7 and -α4.2 gene to detect the normal chromosomes. In this system, the two amplifications ran in the same PCR tube under identical condition. Results　A 740bp fragment was amplified in chromosomes with -　-SEA determinant and a 1052bp fragment in normal chromosomes. For prenatal diagnosis, 3 of 8 at-risk cases were diagnosed as normal, 3 as heterozygotes, and 2 as homozygotes of -　-SEA deletion. Conclusion　This detection method is rapid and accurate and can be used as a routine method for carrier detection and prenatal diagnosis.　　【Key words】　alpha-T　Polymerase chain reaction；　Prenatal diagnosis；　Gene
　　α地中海贫血（α地贫）是具有高度异质性的单基因遗传病，其主要特征是α珠蛋白链合成减少h（α+地贫）或缺如（α0地贫）。α地贫分子缺陷有基因的大片段缺失和非缺失突变两大类［1］。α珠蛋白基因缺失是导致α地贫的主要原因，迄今世界上至少报道了35种此类突变，其中包括6种α地贫2和29种α地贫1［2］。中国人中常见的缺失型α地贫基因为-　-SEA、-α3.7和-α4.2，-　-SEA自身或与-α3.7(或-α4.2)相互组合是构成中国人Hb Bart's水肿胎和缺失型HbH病的主要分子病理基础［2］。Hb Bart's水肿胎多在出生前或出生后数小时内死亡，缺失型HbH病患者常有中重度贫血，严重影响患者生存质量。对α地贫目前尚无根本有效的治疗方法，通过遗传筛查和产前诊断选择性淘汰重症α地贫胎儿是控制该病发生的唯一途径。经典的Southern杂交技术能诊断Hb Bart's水肿胎和缺失型HbH病，但该法存在操作繁琐、实验周期长及使用放射性核素标记等诸多限制，不利于临床推广应用。Chang等［3］创立的跨越断裂点聚合酶链反应（gap-PCR）技术，简便、准确，能有效地对-　-SEA基因进行分子筛查和对Hb Bart's水肿胎进行产前诊断，但不能对缺失型HbH病进行诊断。我们在gap-PCR技术的基础上，通过对内对照引物的设计，形成一种新型、快速、简便的PCR诊断技术。该技术既能用于-　-SEA基因的分子筛查，又能用于Hb Bart's水肿胎和缺失型HbH病的产前诊断，而且能鉴别临床常见的缺失型HbH病和非缺失型HbH病。
材料和方法
1　DNA样品1.1　6份已知基因型标准样品：αα/αα，αα/-　-SEA，-　-SEA/-α3.7，-　-SEA/-α4.2，-　-SEA/-　-SEA各1份,其基因型经Southern杂交法确定；-　-SEA/ααCS样品经Southern杂交法和我室用PCR限制性内切酶谱分析法［4］确定。上述Southern杂交样品由曾瑞萍教授（中山医科大学医学遗传学教研室）和美国加利福尼亚大学Kan教授惠赠。1.2　产前诊断样品：8例高风险Bart's水肿胎儿及其父母的DNA样品。胎儿样品由第一军医大学第一附属医院妇产科提供，其父母均有Bart's水肿胎生育史。胎儿取样采用羊膜穿刺术，父母样品取自静脉血。胎儿及其父母的DNA按氯仿/酚抽提法，从羊水细胞或白细胞中提取。正常分娩后或引产后进一步用分子诊断法验证。2　引物设计　　检测-　-SEA缺失基因的引物采用gap-PCR设计方案，即在缺失基因-　-SEA5′端断裂点上游和3′端断裂点下游设计一对特异性引物P1/P2，在正常等位基因上该对引物相距太远，无法形成PCR反应，而在-　-SEA等位基因上因基因大片段缺失而靠近，从而能特异地扩增出代表该缺失突变存在的一740bp的DNA片段。内对照引物对P3/P4位于常见缺失基因-　-SEA、-α3.7和-α4.2的公共缺失区域，用以扩增正常α珠蛋白等位基因，其扩增产物为1052bp。此外,为利于双重PCR,在每条引物的特异性基因序列的5′端连上一段由20个核苷酸组成的与人类基因不同源的高GC含量尾序列。两对寡核苷酸引物的序列及其在α珠蛋白基因簇中的位置如表1和图1中所示。3　PCR扩增　　Taq聚合酶及反应缓冲液购自加拿大真达科技有限公司，dNTP为德国Boehringer Mannheim产品。4引物在单管中扩增，25μl反应总体积中含基因组DNA　0.1μg，dNTPs 0.2mmol/L，4引物各6.25pmol，Taq DNA聚合酶1U。PCR在PE-480（美国Perkin-Elmer公司）扩增仪上进行，循环参数为99℃变性3min，85℃加酶，55℃退火1min，72℃延伸3min；然后95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，进行30个循环；最后一个循环72℃ 5min。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下观察摄片。
表1　引物的序列及位置
位置(GenBank编号)
序列(5′→3′)
HUMHBA4/J00153
CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG
HSCOS12/Z69706
ATATATGGGTCTGGAAGTGTATC
HUMHBA4/J00153
CACTTCCTGTGTCACGGT
HUMHBA4/J00153
CTCCGACCAGCTTAGCAAT
　　为检验引物的特异性，先用6份已知基因型的DNA样本作对照进行PCR，结果显示这两对引物能分别特异性地扩增相应的DNA片段（图2）。从图2可以看出，正常人的DNA样本只产生一条1052bp的片段；标准型α地贫患者（-　-SEA/αα）除有1052bp的片段外，还有一条740bp的片段；缺失型HbH病患者（-　-SEA/-α3.7，-　-SEA/-α4.2）一条染色体上有-　-SEA大片段缺失，另一条染色体上α珠蛋白基因也部分缺失，引物对P3/P4不能与模板退火，因此只能扩增出一条740bp的片段；而非缺失型HbH病患者（-　-SEA/ααCS），由于尚有一条染色体上的α珠蛋白基因未缺失，故有1052bp和740bp两个片段；Hb Bart's水肿胎儿只能扩增出740bp的片段。　　进行产前诊断的8例高风险Bart's水肿胎儿，其父母均有Bart's水肿胎生育史。产前诊断结果为Bart's水肿胎2例，-　-SEA杂合子3例，正常胎儿3例，8例胎儿的父母均为-　-SEA杂合子。图3为其中2例高风险Bart's水肿胎儿及其父母的产前基因诊断结果：胎儿1为正常胎儿，胎儿2为Bart's水肿胎儿。到目前为止，8例胎儿均已完成了流产后或正常分娩后的基因分析验证，结果与产前诊断完全一致。
图1　引物P1、P2、P3、P4在α珠蛋白基因簇中的位置
1：PCR markers（华美公司）；2：阴性对照；3：αα/αα；4：αα/-　-SEA；5：-　-SEA/ααCS；6：-　-SEA/-α3.7；7：-　-SEA/-α4.2；8：-　-SEA/-　-SEA图2　6份标准样品的PCR分析结果
　　1：PCR markers（华美公司）；2：父亲1；3：母亲1；4：胎儿1；　　5：父亲2；6：母亲2；7：胎儿2图3　2例高风险Bart's水肿胎儿的产前诊断结果
　　-　-SEA是中国人中最常见的α地贫基因。目前本室和国内外一些实验室建立了检测-　-SEA突变的gap-PCR技术［3，5-8］。在本法中，我们作了两大方面的改进：①通过引物和反应体系的调整，两对特异性引物不是分管，而是在单管中一起进行反应，即进行双重PCR。双重PCR技术能简化操作步骤，减少加样机会，降低污染的可能性，并可节约样品和试剂，降低费用。此外，由于正常基因和缺失基因在同一体系中扩增，有利于PCR的质量控制，提高反应体系结果的可靠性。②在中国人常见的-　-SEA、-α3.7、-α4.2突变的公共缺失区域设计引物，而不是在-　-SEA某一个缺失断裂点上、下游分别设计引物扩增α珠蛋白基因作为内对照，其扩增产物可用作缺失型α地贫基因与非缺失型α地贫基因的判别标志。　　内对照引物的设计策略是本法的一个重要创新点。除能检测-　-SEA突变外，该设计优势还表现在能用于鉴别临床上常见的缺失型HbH病与非缺失型HbH病。缺失型HbH病标本经PCR扩增后，电泳结果只有一条代表-　-SEA缺失基因的扩增片段，非缺失型HbH病标本经PCR扩增后，既有代表-　-SEA缺失基因的扩增产物，也有作为内对照的α珠蛋白基因的扩增产物（见图2中泳道5～7），故本法除能对Hb Bart's水肿胎进行诊断外，还可结合家系分析对缺失型HbH病进行诊断。此前对α地贫进行产前诊断的gap-PCR技术，主要局限于对Hb Bart's水肿胎的诊断［3，5-8］。Hb Bart's水肿胎和缺失型HbH病胎儿，两者PCR扩增后电泳的结果相同，均只有740bp的扩增片段（参见图2中泳道6～8），但在家系分析中Hb Bart's水肿胎儿的父母双方均有740bp的扩增产物；而缺失型HbH病胎儿的父母，仅一方有740bp的扩增产物。在所进行产前诊断的8例胎儿样品中，未检测到缺失型HbH病基因，这是由于样品数量少、病例来源的不随机性所造成的。　　在常见缺失基因的公共缺失区域设计内对照引物，拓宽了PCR技术的应用范围。该方法快速、简便、准确、经济，利于推广到基层医院，作为常规方法用于临床样品-　-SEA基因的分子筛查、Hb Bart's水肿胎和缺失型HbH病的产前诊断及缺失型HbH病和非缺失型HbH病的鉴别。该方法的建立，为α地贫的防治提供了一种新方法，对优生优育和提高人口素质具有积极的意义。
基金项目:广东省卫生厅医药卫生重点项目基金资助项目()作者单位：肖维威（510515　广州，第一军医大学分子生物学研究所）徐湘民（510515　广州，第一军医大学分子生物学研究所）刘忠英（510515　广州，第一军医大学分子生物学研究所）
参 考 文 献
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指导意见：你好；地中海贫血是一种遗传性疾病，这种疾病是由于红细胞内的血红蛋白数量和质量的异常造成红细胞寿命缩短的一种先天性贫血。此病目前尚无特殊根治方法。 种轻度贫血若时间短不会影响宝宝生长发育，若长期不予 以纠正，也会对宝宝造 成影响。 建议你最 好正规大型医院综合治疗为好。
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指导意见：你好。轻型地贫无需特殊治疗。中间型和重型地贫应采取下列一种或数种方法给予治疗。
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问题分析：贫血治疗首先找到原因针对原因进行治疗,另外建议多吃瘦肉和猪肝,蛋黄,牛奶,鱼虾,祝你健康了意见建议：贝类,大豆,豆腐和血补充铁和蛋白质和多吃蔬菜和水果补充维生素c促进铁的吸收.严重贫血需要输血治疗.
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指导意见：是属于地贫的，加强营养的调节，及补充铁剂就好的，是可以要的，注意定期的到上级的医院进行复查。
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地贫特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成。导致血红蛋白的组成成分改变，本组疾病的临床症状轻重不一，大多表现为慢性进行性溶血性。 一般可适当补充叶酸和维生素E，去铁剂可选用铁鳌合剂， 常用去铁胺。
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病情分析： 您好；这种基因类型是国内a地中海贫血常见的类型，一般该病可以是轻度的贫血，对健康的影响不大，地中海贫血是一种遗传性疾病，目前无特殊的治疗方法，该病一般是血红蛋白的异常导致的贫血。意见建议：建议；一般这种情况对成人的影响不大，属于轻度的a地贫，但该病有一定的遗传倾向，可以用叶酸治疗，该病可以遗传给胎儿的，若您丈夫是地贫的情况，是有可能生下重度地贫儿童，这种情况一般要产前做羊水检查，筛查重度地贫胎儿。
问问题描述:地中海贫血sea缺失基因检测pcR法一检出a一地贫基因...
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指导意见：地中海性贫血轻度没明显表现,中度、重度的血色数较低，体弱易病，感冒发烧痊愈较慢，平时易感疲劳，脾脏易肿大，严重时还可能影响身长 发育。轻度不需治疗，重症的可视情况做切脾、输血等提高血色数，但都是阶段性的暂时治疗，要彻底治愈目前只有换骨髓。
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