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分散液液微萃取?柱前衍生?高效液相色谱法测定水样中双酚
【摘要】& 建立了分散液液微萃取?柱前衍生?高效液相色谱法测定水样中双酚A的分析方法。通过交互正交试验和混合型优化实验设计对影响因素(萃取剂体积、分散剂类型及其体积、水样体积、pH值及离子强度)进行了优化。优化后的分散液液微萃取条件为：60 μL萃取剂，0.4 mL分散剂(甲醇)，pH 4.0;优化后的柱前衍生化条件：0.1 mL 2.0 g/L衍生剂(对硝基苯甲酰氯)、衍生化时间30方法的线性范围：0.002～0.2 mg/L(r=0.9997)，检出限0.007 μg/L(S/N=3);不同浓度双酚A的萃取率为59.0%～63.0%，相对标准偏差(RSD)2.5%～9.2%(n=5);水样中双酚A的加标率为86.5%～107.1%，RSD为4.0%～11.9%(n=5)，其它雌激素(雌酮、雌二醇、雌三醇和17α?乙炔基雌二醇)对双酚A的测定无干扰。本方法可以对水环境中的痕量BPA进行检测，具有操作简便、快速等优点。
【关键词】& 分散液液微萃取，柱前衍生，高效液相色谱，双酚A
&&&&&&&&&&&& 1 引 言
　　双酚A(Bisphenol A，BPA)是生产聚碳酸酯、环氧树脂的重要原料，可用于树脂和阻燃剂生产[1]。BPA属于“环境激素”，具有雌激素效应，ng/L～μg/L水平就会对人类和野生动物的健康带来威胁[2,3]。
　　BPA检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[4]、分子印迹法(MIPM)[5～7]、气相色谱?质谱法(GC?MS)[8]、酶联免疫吸附法(ELISA)[9]等。由于BPA在水环境中浓度较低[10]，常采用液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、液相微萃取(LPME)和固相微萃取(SPME)等预处理方法进行富集，其中SPME和LPME较为常用，具有消耗溶剂少或无需萃取剂、富集效果好、方便等优点，但也存在诸如SPME的萃取头价格昂贵、易碎，LPME平衡时间较长等不足[10,11]。Ahmadi等[12]发明的分散液液微萃取(DLLME)技术，因具有环境友好、操作简单等优点而被广泛应用于环境样品的萃取分离[13,14]。柱前荧光衍生可显著提高BPA荧光效率及检测灵敏度[15]，BPA衍生化测定方法已有报道[15，16]，但衍生化反应需在无水条件下进行，往往需要脱水和氮气缓慢吹扫、挥干等步骤。
　　本研究采用DLLME技术对水样中BPA进行萃取，对离心后得到的沉淀相(有机相)中的BPA进行衍生化反应，从而简化衍生化过程，最后利用HPLC分析衍生化样品中的BPA。本方法可于室温下进行，操作简便、快速。
　　2 实验部分
　　2.1 仪器与试剂
　　1200型HPLC(美国Agilent公司)，配备Rheodyne 7725i手动进样器、真空脱气装置、二元泵、柱温箱及荧光检测器;TC?C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);DELTA320梅特勒?托利多pH计;2?16PK冷冻离心机(德国Sigma公司)。
　　BPA、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)及17α?乙炔基雌二醇(EE2)均购自Sigma公司;[C6MIM][PF6](99%);丙酮、甲醇和乙腈为色谱纯;NaCl和NaOH为分析纯; 2.0 g/L对硝基苯甲酰氯(≥98.0%)乙腈溶液。200 mg/L BPA储备液，置于4 ℃冰箱中保存备用。实验用水由Direct?Q3UV(法国Millipore公司)制备。
　　2.2 分散液液微萃取样品的制备
　　准确移取适量BPA(0.02 mg/L)使用液于10 mL锥形玻璃离心管内，用1 mL注射器将萃取剂([C6MIM][PF6])和分散剂(丙酮或甲醇)混合液快速注入到离心管内的BPA溶液中，形成混浊液，轻轻摇晃，以5000 r/min离心8 min，用50 μL进样针抽取沉淀相5 μL，进样。
　　2.3 分散液液微萃取样品的衍生化
　　准确移取分散液液微萃取样品的沉淀相10 μL于棕色样品瓶中，加入0.10 mL对硝基苯甲酰氯乙腈溶液，摇匀，于暗处放置30 min后，抽取上清液5 μL，进样。
　　2.4 色谱条件
　　流动相为甲醇和水，梯度洗脱：0～5 min，70%甲醇;5～10 min，85%甲醇;10～18 min为后运行时间。流速：1.0 mL/柱温：30 ℃;荧光检测：λex=230 nm，λem=315 nm。
　　3 结果与讨论
　　3.1 分散液液微萃取条件优化
　　考察萃取剂体积(A)，水样体积(B)，分散剂类型(C)，pH值(D)，离子强度(E)，和分散剂体积(F)6个因素，选取的水平依次为A： 60， 90 μL; B： 3， 5 mL; C： 甲醇、丙酮; D: 4.0， 7.0，E: 0， 0.4 mol/ F: 0.4， 0.6 mL。
　　3.1.1 显著因素的筛选 选取L16(215)正交表进行分析，任意次序完成正交表中的16组实验，每组设两个平行及空白对照，以平行样BPA浓度的平均值与空白实验的差为指标值(Yi)，空白列用于估算实验误差，各影响因素的显著性见表1。从表1看出，对Yi影响显著的因素包括水样体积、萃取剂体积、分散剂类型以及水样体积与萃取剂体积的交互作用(A×B)。根据Yi变化趋势，分散剂类型确定为甲醇;A×B的作用小于因素A和B的单独作用，则进一步的实验着重优化因素A和B。不显著因素确定为pH 4.0、不调节离子强度及分散剂体积0.4 mL。表1 交互正交试验结果的方差分析
　　3.1.2 混合型优化实验 萃取剂体积(A)和水样体积(B)对Yi的效应相反，分别为正效应和负效应。实验表明，萃取剂体积50 μL和水样体积9 mL时，得到沉淀相小于2 μL，难以取样。为使Yi最大，同时又容易进行取样操作，A水平设50与60 μL，B设5， 6与7 mL。采用混合型21×31设计进行优化(图1)：确定水样体积(B)为7 mL;当萃取剂体积(A)为50 和 60 μL时，BPA萃取率(ER)约分别20%和50%，故确定萃取剂体积为60 μL。
　　3.1.3 实际水样中BPA的加标回收率 松花江某江段河水、实验室自来水及某排水沟水样中BPA经DLLME后的加标回收率(R)见表2。表2 水样中BPA分散液液微萃取后的加标回收率
　　3.2 方法的建立
　　3.2.1 方法的线性范围及检出限 利用优化后的DLLME条件萃取水样中的BPA，对离心后沉淀相中BPA进行衍生化反应，然后利用HPLC分析。方法的线性范围为0.002～0.2 mg/L，相关系数0.9997;检出限0.007 μg/L(S/N=3)。水样采集 - 水质分析 - 分析测试百科网
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& 14:19:45
　　供化验用的必须有足够的代表性。从水样取出后，到结束之前，应尽量避免水中原有成分发生明显变化。避免外来，这是水质调查工作中十分重要的一环。如果所取水样没有代表性，或者成分已经发生了变化，后面的工作做得再好，也得不到正确的结果，有问题也不易查出来，因此必须注意水样的与保存。一、采样计划　　采样前应根据水质检验目的和任务制定采样计划，内容包括：采样目的、检验指标、采样时间、采样地点、采样方法、采样频率、采样数量、采样容器与清洗、采样体积、样品保存方法、样品标签、现场项目、采样质量控制、运输工具和条件等。二、采样容器　　1、应根据待测组分的特性选择合适的采样容器。　　2、容器的材质应稳定性强，且不应与水样中组分发生反应，容器壁不应吸收或吸附待测组分。　　3、采样容器应可适应温度的变化，抗震性能强。　　4、采样容器的大小、形状和重量应适宜，能严密封口，并容易打开，且易清洗。　　5、应尽量选用细口容器，容器的盖和塞的材料应与容器材料统一。在特殊情况下需用软木塞或橡胶塞时应用稳定的金属箔或聚乙烯薄膜包裹，最好有蜡封。有机物和某些微用的样品容器不能用橡胶塞，碱性的液体样品不能用玻璃塞。　　6、对无机物、金属和放射性元素测定水样应使用有机材质的采样容器，如聚乙烯塑料容器等。　　7、对有机物和微生物学指标测定水样应使用玻璃材质的采样容器。　　8、特殊项目测定的水样可选用其他化学惰性材料材质的容器。如热敏物质应选用热吸收玻璃容器;温度高、压力大的样品或含痕量有机物的样品应选用不锈钢容器;生物(含藻类)样品应选用不透明的非活性玻璃容器，并存放阴暗处;光敏性物质应选用棕色或深色的容器。三、采样容器的洗涤　　1、测定一般理化指标采样容器的洗涤　　将容器用水和洗涤剂清洗，除去灰尘、油垢后用自来水冲洗干净，然后用质量分数10%的硝酸(或盐酸)浸泡8h，取出沥干后用自来水冲洗3次，并用蒸馏水充分淋洗干净。　　2、测定有机物指标采样容器的洗涤　　用重铬酸钾洗液浸泡24 h，然后用自来水冲洗干净，用蒸馏水淋洗后置烘箱内180℃烘4h，冷却后再用过的己烷、石油醚冲洗数次。　　3、测定微生物学指标采样容器的洗涤和灭菌　　(1)容器洗涤:将容器用自来水和洗涤剂洗涤，并用自来水彻底冲洗后用质量分数为10%的盐酸溶液浸泡过夜，然后依次用自来水，蒸馏水洗净。　　(2)容器灭菌:热力灭菌是最可靠且普遍应用的方法。热力灭菌分干热和高压蒸气灭菌两种。干热灭菌要求160℃下维持2h;高压蒸气灭菌要求121℃下维持15 min，高压蒸汽灭菌后的容器如不立即使用，应于60℃将瓶内冷凝水烘干。灭菌后的容器应在2周内使用。四、采样器　　1、采样前应选择适宜的采样器。　　2、塑料或玻璃材质的采样器及用于采样的橡胶管和乳胶管要洗净备用。　　3、金属材质的采样器，应先用洗涤剂清除油垢，再用自来水冲洗干净后晾干备用。　　4、特殊来样器的清洗方法可参照仪器说明书。五、水样采集　　1、一般要求　　(1)理化指标　　采样前应先用水样荡洗采样器、容器和塞子2～3次(油类除外)。　　(2)微生物学指标　　同一水源、同一时间采集几类检测指标的水样时，应先采集供微生物学指标检测的水样。采样时应直接采集，不得用水样测洗已灭菌的采样瓶，并避免手指和其他物品对瓶口的沾污。　　(3)注意事项　　a& 采样时不可搅动水底的沉积物。　　b& 采集测定油类的水样时，应在水面至水面下300 mm采集柱状水样，全部用于测定。不能用采集的水样冲洗采样器(瓶)。　　c& 采集测定溶解氧、生化需氧量和有机污染物的水样时应注满容器，上部不留空间，并采用水封。　　d& 含有可沉降性固体(如泥沙等)的水样，应分离除去沉积物。分离方法为:将所采水样摇匀后倒人筒形玻璃容器(如量筒)，静置30 min，将已不含沉降性固体但含有悬浮性固体的水样移人采样容器并加人保存剂。测定总悬浮物和油类的水样除外。需要分别测定悬浮物和水中所含组分时，应在现场将水样经0. 45um膜过滤后，分别加人固定剂保存。　　e& 测定油类、BOD5、硫化物、微生物学、放射性等项目要单独采样。　　f&& 完成现场测定的水样，不能带回供其他指标测定使用。　　2、水源水的采集　　(1)水源水是指集中式供水水源地的原水。　　(2)水源水采样点通常应选择汲水处。　　①表层水　　在河流、湖泊可以直接汲水的场合，可用适当的容器如水桶采样。从桥上等地方采样时，可将系着绳子的桶或带有坠子的采样瓶投人水中汲水。注意不能混人漂浮于水面上的物质。　　②一定深度的水　　在湖泊、水库等地采集具有一定深度的水时，可用直立式采水器。这类装置是在下沉过程中水从采样器中流过。当达到预定深度是容器能自动闭合而汲取水样。在河水流动缓慢的情况下使用上述方法时最好在采样器下系上适宜质量的坠子，当水深流急时要系上相应质量的鱼，并配备绞车。　　③泉水和井水　　对于自喷的泉水可在涌口处直接采样。采集不自喷泉水时，应将停滞在抽水管中的水汲出，新水更替后再进行采样。　　从井水采集水样，应在充分抽汲后进行，以保证水样的代表性。　　3、出厂水的采集　　(1)出厂水是指集中式供水单位水处理工艺过程完成的水。　　(2)出厂水的采样点应设在出厂进人输送管道以前处。　　4、末梢水的采集　　(1)末梢水是指出厂水经输水管网输送至终端(用户水龙头)处的水。　　(2)末梢水的采集:应注意采样时间。夜间可能析出可沉渍于管道的附着物，取样时应打开龙头放水数分钟，排出沉积物。采集用于微生物学指标检验的样品前应对水龙头进行消毒。　　5、二次供水的采集　　(1)二次供水是指集中式供水在人户之前经再度储存、加压和消毒或深度处理，通过管道或容器输送给用户的供水方式。　　(2)二次供水的采集:应包括水箱(或蓄水池)进水、出水以及末梢水。　　6、分散式供水的采集　　(1)分散式供水是指用户直接从水源取水，未经任何设施或仅有简易设施的供水方式。　　(2)分散式供水的采集应根据实际使用情况确定。六、采样体积　　1、根据测定指标、测试方法、平行样魁测所需样品量等情况计算并确定采样体积。　　2、测试指标不同，测试方法不同，保存方法也就不同，样品采集时应分类采集，表1提供的生活饮用水中常规检验指标的取样体积可供参考。　　3、非常规指标和有特殊要求指标的采样体积应根据检测方法的具体要求确定。表1 生活饮用水中常规检验指标的取样体积指标分类容器材质保存方法取样体积/L备注一般理化聚乙烯冷藏3～5&挥发性酚与氰化物玻璃氢氧化钠，pH≧12，如有游离余氯，加亚酸钠去除0.5～1&金属聚乙烯硝酸，pH≤20.5～1&聚乙烯硝酸（1+9，含重铬酸钾50g/L）至pH≤20.2用于冷法测定耗氧量玻璃每升水样加入0.8mL浓硫酸，冷藏0.2&有机物玻璃冷藏0.2水样应充满仪器至溢流并密封保存微生物玻璃（灭菌）每125mL水样加入0.1mg硫代硫酸钠除去残留余氯0.5&放射性聚乙烯&3～5&七、水样的过滤和离心分离　　在采样时或采样后不久，用滤纸、滤膜或砂芯漏斗、玻璃纤维等过滤样品或将样品离心分离都可以除去其中的悬浮物，沉淀、藻类及其他微生物。在分析时，过滤的目的主要是区分过滤态和不可过滤态，在滤器的选择上要注意可能的吸附损失，如测有机项目时一般选用砂芯漏斗和玻璃纤维过滤，而在测定无机项目时则常用0. 45 um的滤膜过滤。水质分析项目、代表符号、单位
水样的采集
水质全分析中样品的采集（包括运送和保管）是保证分析结果准确性极为重要的一个步骤。必须使用设计合适的取样器，选择有代表性的取样点，并严格遵守有关采样、运送和保管的规定，才能获得符合要求的样品。
1． 取样器的安装和取样点的布置，应根据机炉的类型、参数、监督的要求，进行设计、制造、安装和布置，以保证样品有充分代表性。
2． 除氧水、给水的取样管，均应采用不锈钢管制造。
3． 除氧水、给水、炉水和疏水的取样装置，必须安装冷却器。取样冷却器应有足够的冷却面积，并接在能连续供给足够冷却水量的水源上，以保证水样流量在500~700mL/min时，水样温度仍低于30~40℃。在现有条件的情况下可采用纯水做冷却水，以保证取样冷却器具有良好的换热效率。
4． 取样冷却器应定期检修和清除水垢。机炉大修时，应安排检修取样器和所属阀门。 5． 取样管道在取样前要冲洗5~10min。冲洗后水样流量调至500~700mL/min，待稳定后方可取样，以确保样品有充分代表性。
6． 测定溶解氧的除氧水和汽机凝结水，其取样门和盘根和管路应严密不漏空气。
水样的采集方式
1． 采集接有取样冷却器的水样时，应调节取样阀门开关，使水样流量在500~700mL/min，并保持流速稳定，同时调节冷却水量，使水样温度为30~40℃。
2． 给水、炉水的样品原则上应保持常流。采集其它水样时，应先把管道中的积水放尽并冲洗后方能取样。
3． 盛水样的容器（采样瓶）必须是硬质玻璃瓶或塑料制品（测定硅或微量成分分析的样品时，必须使用塑料容器）。采样前，应先将采样瓶彻底清洗干净，采样时再用水样冲洗三次（测定中另有规定者除外），才能收集样品。采样后应迅速盖上瓶塞。
4． 在生水管路上取样时，应在生水泵出口处或生水流动部位取样，采集井水样品时，应在水面下50M处取样；采集自来水样时，应先冲洗管道5~10min后再取样；采集江、河、湖和泉中的地表水样时，应将采样瓶浸入水面下50M处取样，并且在不同的地点分别采集，以保证水样有充分的代表性。江、河、湖和泉的水样，受气候、雨量等的变化影响很大，采样时应注明这些条件。
5． 所采集水样的数量应满足试验和复核的需要。供全分析用的水样不得少于5L，若水样浑浊时应分装两瓶，每瓶2.5L左右。供单项分析用的水样不得少于0.3L。
6． 采集供全分析用的水样应粘贴标签，注明：水样名称、采集人姓名、采集地点、时间、温度以及其它情况（如气候条件等）。
7． 测定水中某些不稳定成分（如溶解氧，游离二氧化碳等）时，应在现场取样测定，采样方法应按各测定方法中规定进行。采集测定铜、铁、铝等的水样时，采集方法应按照各测定方法中的要求进行。
水样的存放与运送
水样在放置过程中，由于种种原因，水样中某些成分的含量可能发生很大的变化。原则上说，水样采集后应及时化验，存放与运送时间尽量缩短。有些项目必须在现场取样测定，有些项目则可以取样后在实验室内测定。如需要送到外地分析的水样，应注意妥善保管与运送。
1．水样存放时间，水样采集后其成分受水样的性质、温度、保存条件的影响有很大的改变。此外，不同的测定项目，对水样可以存放时间的要求也有很大差异。所以可以存放的时间很难绝对规定，根据一般经验，表2―3―1所列时间可作为参考。
2．水样存放与运送时，应检查水样瓶是否封闭严密。水样瓶应放在不受日光直接照射的阴凉处。
3．水样的运送途中，冬季应防冻，夏季应防曝晒。
4．化验经过存放或运送的水样，应在报告中注明存放的时间和温度条件。
水质全分析的工作步骤
水质全分析时，应做好分析前的准备工作。根据试验的要求和测定项目，选择适当的分析方法，准备分析用的仪器和试剂。然后再进行分析测定。测定时应注意下列事项：
1． 开启水样瓶封口前，应先观察并记录水样的颜色，透明程度和沉淀物的数量及其他特征。
2． 透明的水样在开瓶后应先辨识气味，并且立即测定pH、氨、化学耗氧量、碱度、亚硝酸盐和亚硫酸盐等易变项目；然后测定全固体、溶解固体和悬浮固体；接着测定硅、铁铝氧化物、钙、镁、硬度、磷酸盐、氯化物等项目。
3． 浑浊的水样应取其中经澄清的一瓶，立即测定pH、氨、酚酞碱度、亚硝酸盐、亚硫酸盐等易变项目；过滤后测定全碱度、硬度、磷酸盐、氯化物等项目。将另一瓶水样混匀后，立即测定化学耗氧量，并测定全固体，溶解固体，悬浮固体，硅、铁铝氧化物以及钙、镁等项目。
4． 在水样全分析时，开启瓶封后对易变项目的测定会有影响，为尽可能减少影响，开启瓶封后要立即测定，并在四小时内完成这些项目的测定。
5．在水样pH大于8的情况下，给水、炉水、疏水等水样中含有的铁、铜等杂质有相当一部分以胶体、悬浮固体的形式存在，要获得有充分代表性的水样较为困难。取样方法规定，为了防止胶体物质，悬浮固体影响水样的代表性，系统查定时，要充分冲洗管道，冲洗后应根据具体条件间隔适当时间才能取样。
水质全分析项目测定方法及其结果的校核
火力发电厂运行中要求进行化学监督的生水、炉水、除氧水、给水、疏水及凝结水是不同性质的水，对它们监测项目有所不同，视电厂化学监督规程要求而定。对于所监测项目的测定方法在本章中将加以介绍，便于学生掌握操作，熟练运用，另外对于电厂所用生水的测定结果的校核在本章中作出详细介绍，便于学生掌握对水质全分析结果的审查，了解测定结果的准确程度和生水的性质。
电导率的测定
酸、碱、盐等电解质溶于水中，离解成带正、负电荷的离子，溶液具有导电的能力。其导电能力的大小，可用电导率来表示。
电解质溶液的电导率，通常是用两个金属片（即电极）插入溶液中测量两极间电阻率大小来确定，电导率是电阻率的倒数。，根据欧姆定律，溶液的电导（G）与电极面积（A）成正比，与极间距离（L）成反比。
上式中DD称为电导率，它是指电极面积1M2，极间距离1M时溶液的电导，其单位
为西/厘米，用符号S/M表示。除盐水电导率用微西/厘米，μS/M表示。对同一电极L/A不变，可用K表示（K称为电导池常数），因此，被测溶液的电导率和电导的关系为：
对于同一溶液，用不同电极测出的电导值不同，但电导率是不变的。溶液的电导率和电解质的性质，浓度及溶液的温度有关，一般应将测得的电导率换算成25℃时的电导率值来表示见式（4）。在一定条件下，可用电导率来比较水中溶解物质的含量。
除盐水水样的电导率测定即是用DDS―11电导率仪和电导电极测其电导率。 2． 仪器
测定电导率用的专用仪器 2．2
电导电极及其它附属装置 3． 试剂
1mol/L氯化钾标准溶液：准确称取74.55g预先在150℃烘箱中烘2h，并在干燥器内冷却至恒重的优级纯氯化钾，用新制的高纯水溶解后稀释至1.00L。此溶液在25℃时的电导率为111800μS/M。
0.1mol/L氯化钾标准溶液：将1mol/L氯化钾标准溶液用新制的高纯水稀释至10倍即可。此溶液的电导率在25℃时是12880μS/M。
0.01mol/L氯化钾标准溶液：将0.1mol/L氯化钾标准溶液，用新制的高纯水稀释至10倍即可。此溶液的电导率在25℃时是1413μS/M。 4．步骤
电导率仪的校正：按仪器说明书的要求进行。 4．2
电导池常数的标定：用未知电导池常数的电极来测定已知电导率的氯化钾标准溶液的电导，然后按所测结果算出该电极的电导池常数。为了减小标定的误差，应选用电导率与待测水样相似的氯化钾标准溶液来进行标定。君，已阅读到文档的结尾了呢~~
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