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历史上的今天
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blogTitle:'蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化',
blogAbstract:'蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化抽滤　　抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。',
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&& &&& WB实验，【转移】您真正节约了多少时间？
蛋白印迹也称作免疫印迹，是一种被广泛应用并得到公认的技术，用于检测细胞或组织提取物中的蛋白表达水平。?转移：通常我们分为：湿转移,半干转移,干转移三种,然而在电泳转移中还有个隐含变量,下来我也将会介绍到。“ 湿转移 最佳转移方法 ”把蛋白从凝胶转移至膜上的湿转移是指把滤纸-凝胶-膜-滤纸”三明治“完全浸入缓冲液中。使用此方法时,在浸没的情况下通过电泳转移至0.2μm孔径硝酸纤维素膜，在冷却的含20%甲醇的转移缓冲液中转膜,70v,1.5小时。“ 半干转移 可选的转移方法 ”把蛋白从凝胶转移至膜上的半干转移是指将侵满缓冲液的滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”系统，置于本应干燥的阳极和阴极板上。在这一系统中，转移在桌面上进行，在室温条件下约15-60分钟。转移低分子量和高分子量蛋白时这一系统均运转良好，相较于湿转移所需缓冲液更少，但是在某些情况下会产生更高的背景染色。下图所示为半干转移和湿转移的平行比较。△对于低分子量靶标，湿转移和半干转移方法获得的结果接近。电泳转移的隐含变量凝胶厚度用于电泳的凝胶厚度引入了另一个转移效率变量，CST【优宁维全国一级授权代理商】科学家发现采用湿转移方法时，检测所有凝胶上的蛋白都能良好转移，而采用半干转移系统时,凝胶厚度可影响转移效率。下图所示为1mm和1.5mm凝胶、以及湿转移和半干转移方法的各种组合。凝胶选择对低分子量蛋白的半干转移几乎没有影响，而较大分子量蛋白转移时，较薄的凝胶效果要优于较厚的凝胶。在1mm凝胶上电泳转移时，蛋白迁移的距离更短；而在1.5mm凝胶上转移时，所需迁移距离更长，并且大分子量蛋白的转移效率偏低。△对于高分子量靶标蛋白，选择转移方法时，凝胶厚度是一个重要的考虑项。总体而言，无论凝胶厚薄，湿转移均产生较强的信号。疑难排解提示信号低源于凝胶细胞裂解产物上样量不足。建议每个泳道总蛋白细胞裂解产物上样量为20-30μg；但是，如果蛋白水平低于检测值，在电泳之前可能需要进行免疫沉淀以富集待测蛋白。对于组织，通常建议上样量最多100μg总蛋白，具体取决于靶标表达水平。“ 干转移 有限灵敏度的转移方法 ”把蛋白从凝胶转移至膜的干转移是指不额外加入缓冲液的系统，因为阳极和阴极板系统中含有缓冲液基质。Life Technologies的iBlot印迹系统是干印迹系统的一个实例，完成一次干转移需7分钟。在我们手中，这一系统产生较低的信号水平，从较低到几乎看不到的信号强度，具体取决于单个一抗。对于较大分子量蛋白，观察到信号差异最大，表明转移效率低。请注意：在样本量有限或待检测蛋白低内源水平的情况下，干转移方法会限制您分析的灵敏度。疑难排解提示转移不完全或过度转移。采用预染分子量标记物，转移不完全可用肉眼确认，通过增加电泳转移时间和/或电压予以纠正。过度转移常见于极低分子量蛋白，特别是使用0.45μm孔径膜时。我们建议使用0.2μm孔径膜转移1.5小时。高分子量蛋白转移不完全时，可调整转移缓冲液中甲醇浓度予以纠正，因为甲醇有固定作用。我们发现，把转移缓冲液中甲醇浓度从20%降至5%，并将转移时间增加至3小时，对于转移200kDa以上的蛋白有帮助。本文整理来自CST&&蛋白印迹成功指南&&，点击“阅读原文”免费申请优宁维 | 最专业、最全面的抗体(流式产品)供应商专业 ? 全面 ? 安全点击“阅读原文”免费【索取WB实验手册】
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