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椎间盘退变的病因
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你可能喜欢退行性变椎间盘的细胞培养 - 《中国学术期刊（网络版）》
《中国学术期刊（网络版）》
退行性变椎间盘的细胞培养
【Author】
Ma Ke1, Hu You-gu2, Qi Zong-hua21Department of Emergency, Huashan Hospital of Fudan University, Shanghai 200040, C2Shandong Institute of Orthopaedics and Traumaology, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
【摘要】 背景:目前尚未见成熟的成年人退行性变椎间盘的细胞培养模型报道。目的:采用组织块细胞培养法及酶消化细胞培养法进行成人退行性变椎间盘细胞培养的可行性。设计、时间及地点:对比观察的细胞学实验,于9-04在青岛大学医学院山东省创伤骨科研究所完成。材料:5份标本来源于青岛大学附属医院骨科确诊为退行性椎间盘病变患者。方法:①组织块法培养椎间盘细胞:将组织块剪碎至小于1mm×1mm×1mm,牢固敷贴于培养瓶底壁上;第1份标本加入含青霉素100u/mL,链霉素100mg/L,体积分数为0.1的胎牛血清的HAMF12培养基,第18天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养。第2份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同。第50天用2.5g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代。②酶消化法培养椎间盘细胞:将组织块剪碎加入2.5g/L的胰蛋白酶溶液消化髓核30min,离心去除上清液;消化的组织加入2g/L的胶原酶,静止消化4h;离心直至胶原酶完全清洗干净;取离心沉淀物置于培养瓶中:第1份标本加入足量的含青霉素100U/mL,链霉素100mg/L,含体积分数为0.1胎牛血清的HAMF12培养基,第10天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养;第2,3份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同。第50天用2.5g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代。主要观察指标:细胞的传代情况,细胞的形态学、超微结构观察。结果:①在生长及增殖过程中,体积分数为0.2胎牛血清培养细胞增殖速度明显高于体积分数为0.1胎牛血清时的速度。②髓核软骨细胞多呈星形或多角形,细胞核偏于细胞的一侧而贴近细胞膜,来源于纤维环的成纤维细胞呈梭形,细胞核位于梭形细胞的正中央,细胞的纤丝较长。③来源于髓核组织的细胞透射电镜下可见两类形态、结构截然不同的细胞:脊索细胞和软骨样细胞。结论:两种方法均能获得大量的退行性变椎间盘细胞,并成功地进行细胞传代。
【关键词】 ；
【所属期刊栏目】
技术与方法_骨组织构建相关基础实验_基础医学
（2009年02期）
【分类号】R681.53
【被引频次】9
【下载频次】255
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椎间盘退行性变研究中待解决的几个问题
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椎间盘退变的分子治疗
&& 椎间盘退变的生物治疗包括很多种不同的治疗方法。广义上来说，治疗方法包括细胞、基质、分子的应用，这章主要讲一下分子疗法。治疗分子囊括了全部的有疗效分子而不只是经典的“生长因子”。这个命名法很重要，因为生长因子是由于它对细胞有丝分裂的作用来命名的，然而有效的治疗分子的治疗效果并不都是通过影响细胞复制来达到的。治疗分子可以分为抗代谢物质、促细胞分裂因子、软骨成形原、细胞内调节分子。本章考查了主要文献并定义了每一个分类。
治疗分子的分类
分类&&&&&&&&&&&& 治疗分子
抗代谢作用&&&&&&&&&& TIMP-1 TIMP-2
促细胞分裂因子&&& &IGF-1 PDGF EGF FGF
软骨细胞成形素
BMP-7 (OP-1) TGF-b BMP-2
BMP-13 (GDF-6 aka CDMP-2)
GDF-5 (CDMP-1) Link N
细胞内调节分子
Sox9 SMADs LMP-1
了解椎间盘退变的过程对理解分子治疗有很大帮助。椎间盘退变过程包括髓核基质中蛋白多糖、水、II型胶原的丢失。基质中一些所不确定的变化，如高分子蛋白多糖和其它的变化很难定量。& 纤维环的变化有环状板层的紊乱和胶原基质的缺陷。一般，这些基质变化需要很多年，主要是合成与分解失衡引起。分子治疗的目的就是通过平衡合成与分解来阻止椎间盘细胞外基质的变化。以下是具体的分类。
&一：抗代谢作用
基质丢失是合成与分解的平衡，所以可以通过增加合成或减少分解来增加椎间盘细胞外基质。一种方法是通过抑制分解酶活性阻止基质丢失，细胞外基质中有很多分解代谢酶，其中基质金属蛋白酶(MMPs)是最重要的一类，它在细胞外基质分子的循环和椎间盘退变中发挥重要作用。变性椎间盘的MMPs水平明显增高，这也证明了这个假说。在细胞外基质中，MMP的抑制剂主要是基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）。Wallach通过体外腺病毒基因转导途径，测试这些抗分解代谢分子（TIMP-1）能否增加基质中蛋白多糖的含量。他发现TIMP-1在椎间盘细胞中表达确实能增加蛋白多糖的含量，同时通过测量可知蛋白多糖的合成率也增加了。另一个有效的分子是CPA-926，它是七叶亭的前体，但却有更好的药代动力学特性。CPA-926具有抗炎抗和阻止骨性中软骨的退变功能。Okuma通过给椎间盘退变的兔子口服CPA-926，证明了它可以阻止或延迟椎间盘高度退变的开始，并且找到了椎间盘退变的组织学证据。
在合成与分解平衡的情况下，基质的代谢率也很重要。例如，年轻人椎间盘代谢率明显高于老年人，这也可以引起基质成分的变化，如退化的聚集蛋白多糖和新合成的聚集蛋白多糖（来自软骨）。总代谢率也可以影响椎间盘细胞的营养需要。细胞因子，如IL-1和TNF-a，在椎间盘代谢中都有重要的作用。但是，一些分子，如IL-1Ra和infliximab可以分别阻断IL-1和TNF-a的作用，在治疗上也是有用的。对抗代谢分子的进一步研究也许会有更多的发现。
二：促细胞分裂因子
促细胞分裂因子是能增加细胞有丝分裂率的一类分子，它们组成了真正的生长因子，因此，我们可以从软骨形成分子中区分出促分裂生长因子，促分裂生长因子包括胰岛素样生长因子（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）。Thompson通过对成年狗椎间盘细胞体外试验证明了促分裂生长因子可以增加细胞的有丝分裂率和蛋白多糖合成率，一般，EGF有更高的效用。老鼠椎间盘内IGF-1水平随年龄增长而降低了，因此研究者认为通过增加老年椎间盘内IGF-1就可以增加基质的合成。Walsh通过生长因子对老鼠尾椎间盘压迫的退变模型体内试验的结果与Thompson的体外试验结果相一致，都证明了IGF-1有轻微的效用，而FGF则基本没有作用。其它的生长因子可能通过相同或不同的机制也能阻止椎间盘细胞的凋亡。Gruber证明了椎间盘细胞在体外低血清环境中会凋亡，但是IGF-1或PDGF的加入可以降低凋亡率。IGF-1有促合成作用，但也有促分解的作用。在组织培养试验中，IGF-1降低了TIMP-2的水平，所以说它对椎间盘基质代谢有双重的作用
图11－2 促细胞分裂因子&&&&&&
&三：软骨细胞成形素
&软骨细胞成形素是一类具有促细胞分裂能力但又以增加软骨细胞特异表型为主要特征的细胞因子，这些特异软骨细胞特性是由II型胶原、Sox9基因、聚集蛋白多糖、硫酸化氨基葡聚糖决定的。对软骨细胞成形素的研究大部分都是关于转化生长因子（TGF-b）、成骨蛋白（BMPs）、生长分化因子（GDFs）。软骨细胞成形素引起人们的重视是由于它能使正常椎间盘细胞的纤维表型逆转化为软骨细胞表型。这些分子是通过自分泌、旁分泌、内分泌方式发挥作用，它们能够通过弥散和作用于不同的细胞发挥巨大作用。原型软骨细胞成形素的活性决定于相关细胞的细胞外表面受体和有活性的细胞内信息传递系统，而椎间盘细胞能够表达TGF、BMP分子和受体，并且表达水平随椎间盘的老化而有所改变。
TGF-b1是最早发现的椎间盘成形素分子。Thompson报道：TGF-b1不仅是一个丝裂原还是一个能够增加细胞蛋白多糖合成的促合成代谢分子，并且它增加蛋白多糖合成的能力优于EGF、IGF-1、PDGF、FGF等生长因子。后来，Nishida证明了携带TGF-b1基因的腺病毒载体可以直接注入具有免疫力的兔子的椎间盘并且可以表达TGF-b1而增加了蛋白多糖合成率。人退变椎间盘细胞的体外试验也证明了TGF-b1能够增加蛋白多糖和胶原的合成率，这也说明了变性的椎间盘细胞对TGF-b1仍有敏感性。大鼠尾椎间盘细胞的体外试验证明了TGF-b1对内层纤维环细胞有增殖作用，但它对椎间盘的高度没有明显的改变。虽然TGF-b1具有这种功效，但它在人活体椎间盘中的作用仍未被证实。
BMP-2是另一个原型软骨细胞成形素。Hutton报道了重组人BMP-2可以增加老鼠椎间盘细胞蛋白多糖合成并且明显增加了椎间盘细胞的软骨细胞表型，还有聚集蛋白聚糖和II型胶原的基因表达也增多了，但I型胶原却没有明显变化。Kim报道了BMP-2能够部分的逆转尼古丁对椎间盘细胞蛋白多糖合成的抑制作用，因为我们都知道BMP-2在骨形成过程中能够促进成骨细胞的终末分化，但BMP-2是否也能促进椎间盘细胞的分化，还有待证实，人体椎间盘细胞体外试验证明了BMP-2能够增加软骨细胞基因的表达但对成骨细胞基因却没有作用。在脊柱手术中选择性的应用了体外椎间盘细胞的基因疗法进一步证明了BMP-2的促合成代谢作用。至今，仍没有关于BMP-2对人活体退变椎间盘作用的研究，这正是人们研究的热点。
BMP-7（又称为成骨蛋白OP-1）也是一种椎间盘细胞成形素。Masuda报道了兔子纤维环和髓核来源的椎间盘细胞在体外的生长同BMP-7是一种剂量依赖的关系。在BMP-7的作用下，椎间盘细胞的蛋白多糖合成与软骨细胞基因聚集蛋白聚糖和II型胶原都增加了。Takegami证明了大鼠椎间盘细胞在加入炎性因子IL-1的藻酸盐环境中生长会使藻酸盐中的蛋白多糖和胶原丢失，而在加入了200mg/ml BMP-7后培养基中的蛋白多糖和胶原甚至比没有IL-1的对照组都增多了。Zhang报道了在BMP-7的作用下，体外培养的三部分牛椎间盘细胞（分别来自纤维环外带、内带和髓核）的增殖都增加了。但是，只有纤维环外带和髓核的细胞的蛋白多糖合成率增加了。在兔子椎间盘退变模型应用BMP-7的试验已经开始， 这些试验都表明了椎间盘内直接注射BMP-7能增加兔子椎间盘高度和蛋白多糖水平。试验数据也表明了椎间盘内注射BMP-7对大鼠的退变椎间盘也有效用。
BMP-13又称为生长分化因子（GDF-6）或软骨衍生形态发生蛋白-2（CDMP-2）。虽然BMP-13属于BMP家族，但它的氨基酸序列与BMP-2只有50%的同源性。软骨细胞系试验表明了BMP-13确实能增加蛋白多糖合成率和软骨细胞表型，但它的效用远远低于BMP-2。虽然BMP-13与BMP-2在蛋白多糖合成和软骨细胞基因表达时没有协同作用，但二者共同作用的效果却是累加的。BMP-13不像BMP-2、BMP-7那样是一个可以大量生产的重组蛋白，因而需要大量BMP-13的研究很难完成。
GDF-5又称为CDMP-1，在胚胎形成过程中，它主要集中在前软骨间质中，并且遍布于发育长骨的软骨核心中。Walsh对比了GDF-5、TGF-b1、IGF-1、FGF对老鼠尾椎间盘退变模型的作用，同生理盐水对照组相比，GDF-5是唯一增加椎间盘高度的分子。另外，在组织切片上还可以看到纤维环内中带和移行带区细胞的增殖。然而，反复的注射易产生炎症反应，作者认为是由于注射损伤而不是GDF-5。因为即使在生理盐水对照组中也产生了同样的炎症反应。Wang利用基因疗法证明了腺病毒转导GDF-5能够促进体外培养椎间盘细胞的生长。GDF-5正被商业发展用于脊柱融合，但是，仍需大量重组蛋白用于临床试验的研究。
Link N是连接蛋白的一个氨基末端片断，Mwale证明了连接蛋白对椎间盘细胞有刺激活性。Pellet culture试验表明了Link N能够增加蛋白多糖的合成但并不增加细胞的数量，II型胶原在髓核来源的细胞中增加了113%，在纤维环来源的细胞中增加了25%。Link N诱导软骨细胞重要标记物（II型胶原）的特异性上调节但并不增加细胞数量的机制仍不清楚。然而这些发现已经可以说明Link N也是一种促 软骨形成的成形素。
&&&&&&&&&&&& 四：细胞内调节分子
细胞内调节分子是一类特殊的分子，不通过跨膜受体发挥作用。它既不是细胞因子也不是生长因子，但它们与那些早期讨论的分泌型分子有相同的作用。这些分子一般控制细胞分化的一个或多个方向。例如，SMADs是调节BMP-R的一类细胞内分子。尽管仍没有关于SMADs对椎间盘细胞作用的任何文章，但是人们都推测它也能像BMP-2一样对椎间盘细胞产生增加蛋白多糖和II型胶原合成的作用。
Sox9基因是一种对II型胶原mRNA转录具有正调节作用的软骨细胞标记物。Paul证明了腺病毒转导Sox9基因可以增加体外椎间盘细胞的Sox9表达和II型胶原的合成。当注射入体内时，携带Sox9的腺病毒可以阻止兔子椎间盘纤维环模型的退行性变化。退变椎间盘模型是用27号穿刺针，它对椎间盘的损害很小因此产生很小的变性。这个体内试验最主要的发现是Sox-9治疗的椎间盘与对照组相比有更多的类软骨细胞表型，然而，这份报告并没有列出它对椎间盘基质作用的定量数据和体内试验的组成。
矿化蛋白（LMP-1）是由于它对骨形成和成骨细胞分化的促进作用而被发现的一类细胞内分子。Yoon发现在椎间盘细胞中，LMP-1不仅在单层培养中而且在长时间（3周）藻酸盐培养试验中都上调了BMP-2、BMP-7、蛋白多糖的产生。还发现蛋白多糖的上调可以被一种特异性BMP抑制剂所阻断。Yoon证明了LMP-1的作用机制是依赖BMP的。随后的兔子椎间盘的体内试验表明了小剂量转导LMP-1的腺病毒可以增加椎间盘组织BMP-2、BMP-7和蛋白多糖的mRNA水平。因为LMP-1能刺激BMP-2和BMP-7形成异二聚体，它的作用效果20倍于同二聚体。据此推测在诱导超强BMP作用下，可以通过减少腺病毒的剂量来达到降低腺病毒基因治疗的危险性
用于椎间盘退变的分子已经不只是经典的生长因子，至少有4类对椎间盘有修复作用的分子。有抗代谢物质、促细胞分裂因子、软骨细胞源性成形素、细胞内调节分子。尽管只有一些体外试验数据和很少的动物体内椎间盘退变模型试验结果，但是，当前的筛选试验就要结束，在不久的将来，，动物椎间盘退变模型的研究将先于人体的研究而开始。
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