我五年western blot体会（2） - 实验交流 - 生物秀
标题: 我五年western blot体会（2）
摘要: [我五年western blot体会（2）] 1
? Western Blot实验条件 WesternBlot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的，按以下的网址下载下来就可以了（http:
www abcam com ps pdf protocols WB-beginner pdf）。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货，配出来的胶可以提在手里玩，弹性非常好，价格比sigma的便…… [本文关键词:抗体 内参 条带 电泳缓冲液 SDS-PAGE]……
1. ? Western Blot实验条件 WesternBlot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的，按以下的网址下载下来就可以了（/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。具体的试剂配方我是按宝试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货，配出来的胶可以提在手里玩，弹性非常好，价格比sigma的便宜许多，1公斤好像是480多人民币，够实验室用好长时间，现在我们实验室做双向电泳(two-dimensional electrophoresis)都用biomol的胶，很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了，兰州的代理是上海生工。 要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。 转膜我通常是快转两百200毫安/2小时，慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。 封闭我通常用BD的脱脂奶粉，不归，260元500克，也是从北京华美买的。 ECL我用pierce的，500毫升1650元，比国产的还便宜好用。 胶片是柯达的，以前用过乐凯的，不如柯达。 我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶，总觉得是脱裤子***的事。2. ?Western Blot实验关键 WesternBlot操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，综合而言，抗体仍然是决定成败的关键，如果抗体很滥，就是神仙也没招。其中内参抗体很重要，因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin，Tubulin，GAPDH我都用过，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做内参。进口的，国内分装的，国产的，我都用过。进口的最强的1:10000都能做出条带（Upstate，现在被Minipore招安了），国内分装的也好用，但就是不好回收重复使用，国产的一般只能用一次。我要特别强调的是，实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体，因为只要WesternBlot开工，每次都得用内参抗体，而一般目的蛋白的抗体也就用几次，重复三次就了事。但内参抗体是不折不扣的耗材，严格意义上将，每跑一次胶，就得杂一次内参，使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体，但好像因为种属同源性太高，背景总是不干净。进口的好，太贵；国产的只能使用一次，年终算账，不比进口的便宜。我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事，为什么国内企业高的早不了，低的造不好呢？现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗，200微升420元钱，我在蛋白上样量12微升/孔的情况下，按1:2000稀释比，条带非常清晰，没有杂带，是我目前用过的最好的国产抗体，我估计按1:4000照样能做出来，因为按按1:2000稀释做，在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交，可回收重复使用5到6次。最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至（当时名叫杭州松华）发布的广告，我就怂恿实验室主管买了2支，很好用，现在实验室都没有用完 ；2009年我的一个朋友做western，我推荐他又买了1支，做出来的效果确实好，2009年底我到了新的实验室，western的全套我在新实验室重新建立，啥都采购齐了，可就是买不到杭州松华的内参抗体，我上网再也找不到这个公司的网页了，没办法，只好一直噌朋友的内参抗体用。我有个陋习，就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。还好，今年7月份我终于找到了当年的通讯记录，一联系才知道他们改名叫杭州贤至科技有限公司了，呵呵，改了个名，害我找了大半年。第三次买到的GAPDH内参抗体，还是好用，1:2000，条带清晰，回收重复用，照样work，截止目前，我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的，嘿嘿！草根出生，我也照样有我穷人的劳斯莱斯。
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电话：021-五年western blot实验经验诙谐总结 - 免疫实验 - 生物秀
标题: 五年western blot实验经验诙谐总结
摘要: 此兄弟用诙谐的口吻道尽了科研路上的快乐和辛酸，曾经经历过的人才会读懂，精彩文章……
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大 多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。
国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。
我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是&兔女郎&名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和 制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。
2.Western Blot设备
目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且 MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。
Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用， 不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好，但能用，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。
3. Western Blot实验条件
Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的，按以下的网址下载下来就可以了（/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。 具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货，配出来的胶可以提在手里玩，弹性非常好，价 格比sigma的便宜许多，1公斤好像是480多人民币，够实验室用好长时间，现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶，很好用。Marker我现 在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了，兰州的代理是上海生工。
要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。
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western blot 问题
最近在做一个基因，WB检测表达量，我们是用片子曝光，每次化学发光的时候有特异型带，没有杂带，但是整张膜的背景很高，最近做了几次都是这种情况，刚开始以为是封闭时间太短，由封闭一小时变成了两小时（5%牛奶封闭），但是结果还是一样背景很高，导致有些带看的不是很清楚，同一张膜孵其他抗体就不会出现这种情况，我觉得可能是抗体出现的问题（抗体是用PBST配的），大家有没有碰到过这样的问题，有没有什么解决办法？
有用脱脂奶粉，还有用bsa，我们实验室用pbst
你要不试试牛奶？？
我也是查到可能是抗体浓度太多高导致的，不知道是不是，最近在做一次看看，谢谢
我们实验室一直是用脱脂奶粉，效果不错
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摘要 : Western Blot常见问题之针对样品的常见问题
1. 做线粒体膜UCP2蛋白的 Blot (以下简写成Western Blot)，提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂)，用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120&g，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融;2，样品未加。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂
2.细胞水平要做Western ，多少细胞提的蛋白够用?
解答：一般的话5*106就足够了
3.同一样品能够同时提取RNA又提取吗?这样对Western Blot有没有影响?
能，没有问题，我们做过。
4.同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
5. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么?
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化的活性。
6. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决?
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5-10%甲醇。
7. 想分离的蛋白是分子量260kd的，的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?
解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6%， Stacking Gel 3.5%。
8. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb。
9. 蛋白变性后可以存放多久?
解答：-80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
10. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方，不知为何?
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
11. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗?
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点.
12. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗?
解答：Western Blot一般上样30-100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
13. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗?还有，您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail)，封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择。
14. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢?
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。
15. 有什么方法可以提高上样量?
解答：可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。
16. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大?
解答：如是需要提取膜蛋白，(而不是只需要提取膜蛋白)，可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
17. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求?
解答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过0.3&g/mm2。
18. 一抗，二抗的比例是否重要?
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
作者：xilu 点击：次
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