不同分子量壳聚糖膜的制备、降解、缓释及壳聚糖抗菌性能的研究--《昆明医学院》2009年硕士论文
不同分子量壳聚糖膜的制备、降解、缓释及壳聚糖抗菌性能的研究
【摘要】：
【目的】种植义齿是目前口腔修复学研究的热点,许多研究集中在如何通过种植体表面改性提高种植体与骨的结合。利用各种生长因子等蛋白质药物可以促种植体与骨的结合,但生长因子易破坏,难于固定在种植体表面,所以需要寻找合适的载体来携带。本实验拟通过不同分子量壳聚糖的制备来研究不同分子量壳聚糖膜的成膜、缓释、降解;探索不同分子量的壳聚糖抗菌性能,进而为壳聚糖膜作为生长因子载体提供实验依据。
【材料和方法】1.以10万分子量的壳聚糖为原料,利用过氧化氢法对原料进行降解,从而得到低分子量水溶性壳聚糖;用粘度测定法测定出所制备的壳聚糖的分子量;采用4种不同分子量的壳聚糖,分别制备含有和不含明胶的壳聚糖膜;初步探索了低分子量壳聚糖(壳寡糖)的成膜方法。2.用7种壳聚糖膜为一组,共4组各加入磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS)30ml,37℃保存,于第1、2、3、4周任意取出一组,于60℃干燥24小时后测定其不同时时间的降解率;用10万分子量壳聚糖膜含明胶及不含明胶各一种,加入PBS溶液5、10、15、20、25、30ml,37℃保存,于1周取出,60℃干燥24小时,测定溶液量对壳聚糖膜降解的影响;用7种壳聚糖膜分别加入含酶(共4种)的蒸馏水20ml,37℃反应4小时,60℃干燥24小时,测定不同酶对壳聚糖膜降解的影响;3.采用纸片扩散法研究壳聚糖的抗菌性能,分别用45万、20万、10万、3.2万、2.19万、1.26万、0.63万、0.55万、0.3万分子量的壳聚糖配制成2%的壳聚糖溶液,以金黄色葡萄球菌的标准菌株为对象研究不同分子量的壳聚糖抗菌性能的差异;以10万分子量的壳聚糖为代表加入明胶使溶液中明胶浓度为1mg/ml、2mg/m1、3mg/m1、4mg/ml,探讨明胶对壳聚糖抗菌性能的影响。
【结果】1.制备低分子量壳聚糖:利用过氧化氢法能降解壳聚糖,可制备分子量最低至3000左右的低分子量壳聚糖(壳寡糖),而利用粘度测定能比较准确的得到壳聚糖的分子量,该方法切实可行;对于大分子量的壳聚糖,含2mg/ml壳聚糖的乙酸溶液40ml,用溶剂蒸发法能很好的制备成膜,在制备过程中,加入明胶与否并非成膜的必须条件。而对于分子量3000的壳聚糖加入明胶是成膜的必备条件,与此同时必须加入甘油来改善该膜的理化性质;2.不同分子量壳聚糖膜降解:在相同pH值条件下不含明胶的壳聚糖比同样分子量含明胶的壳聚糖降解要快;对不同分子量的壳聚糖膜而言,分子量越大降解越慢。所有不含明胶的壳聚糖膜2周内均完全降解;加入酶能促进壳聚糖的降解,酶对壳聚糖膜的降解效果与酶的种类有关,纤维素酶的效果最好,溶菌酶的效果最差,脂肪酶和木瓜蛋白酶效果相近在,上述两者之间。释放率:含明胶的壳聚糖膜突释比不含明胶组明显,所有壳聚糖膜在一定时间内均匀释放蛋白质药物。3.不同分子量壳聚糖的抑菌:壳聚糖具有一定抑菌能力,该能力与壳聚糖的分子量有关,对会黄色葡萄球菌而言,壳聚糖抑菌力随分子量的减小不断增强,在分子量达到6300时抑菌作用最强,此后抑菌作用又逐步减弱。加入明胶能明显抑制壳聚糖的抑菌作用,但加入1mg/ml-4mg/ml的明胶对壳聚糖抑菌作用的影响无明显相关性。
【结论】利用化学降解方法可制备出不同分子量的壳聚糖,不同分子量的壳聚糖成膜性不同。45万、20万、10万的壳聚糖均能不依赖明胶成膜,而3000分子量壳聚糖成膜则需加入明胶和甘油。不含明胶的壳聚糖降解较快,14天左右完全降解,不适于用来作为种植体表面蛋白质药物载体。而含明胶壳聚糖降解较慢,具有良好的缓释性能,3000分子量的含明胶壳聚糖膜从降解、缓释、抑菌作用来看都是较适合用作种植体表面蛋白质药物载体。
【关键词】：
【学位授予单位】：昆明医学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：R318.08【目录】：
中文摘要5-7
英文摘要7-10
论文正文10-60
实验一12-30
材料和方法12-15
实验二30-48
材料和方法30-33
实验三48-60
材料和方法48-50
全文总结60-62
参考文献62-68
在读期间发表文章情况77-78
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京公网安备75号FUSED HETEROARYL COMPOUNDS, PREPARATION METHOD AND USE THEREOF
WIPO Patent Application WO/
Fused heteroaryl compounds represented by general formula (I), wherein X, R1, R2 and R3 are defined as in the description are disclosed. The method for preparing these compounds and the use of these compounds as phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibitors and anticancer agents are also disclosed.
Inventors:
KUANG, Rongren (5th Floor, 1118 Halei RoadZhangjiang High-tech Park, Shanghai 3, 201203, CN)
匡荣仁 (中国上海市张江高科技园区哈雷路1118号五楼, Shanghai 3, 201203, CN)
Application Number:
Publication Date:
03/17/2011
Filing Date:
09/13/2010
Export Citation:
SHANGHAI ALLIST PHARMACEUTICALS, INC. (5th Floor, 1118 Halei RoadZhangjiang High-tech Park, Shanghai 3, 201203, CN)
上海艾力斯医药科技有限公司 (中国上海市张江高科技园区哈雷路1118号五楼, Shanghai 3, 201203, CN)
KUANG, Rongren (5th Floor, 1118 Halei RoadZhangjiang High-tech Park, Shanghai 3, 201203, CN)
International Classes:
C07D495/14; A61K31/4985; A61K31/519; A61P35/00; C07D487/14; C07D491/147
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Domestic Patent References:
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Attorney, Agent or Firm:
CHINA PATENT AGENT (H. K.) LTD. (22/F, Great Eagle Centre23 Harbour Road,Wanchai, Hong Kong, Kong, CN)
权 利 要 求
1. 如以下通式 (I)表示的化合物或其药学上可接受的盐
X代表 0、 S或 N,
R1和 R2与邻接的 N原子相连， 形成含氮饱和杂环基，
R3代表未取代的或被 1 ~ 5个选自 A的取代基取代的芳基、未取代 的或被 1 ~ 5个选自 A的取代基取代的杂芳基、 取代的或被 1 ~ 5个 选自 A的取代基取代的环烷基、 或者未取代的或被 1 ~ 5个选自 A的 取代基取代的含氮饱和杂环基，其中， A选自下列一组基团： 素、 -R、 -(CH2)n-OR、 -(CH2)n-NRR 、 -CO-R、 -COO-R、 -CONRR 、 -NH-CO-R, -NH-CO-(CH2)n-NRR 和 -S02R, R和 R'分别独立地为 -H、 -d ~ C4烷 基、 -未取代的或被卤素、 -d ~ C4烷基、 -OH、 -O-d 烷基、 -COOH、 -NH2、 -NH-d ~ C4烷基、 "N d ~ C4烷基）2、 -CO-d - 烷基或 -COO-C！ - C4烷基取代的芳基、 -未取代的或被鹵素、 -d ~ C4烷基、 -OH、 -O-Cr C^烷基、 -COOH、 -NH2、 -NH-C! Ct烷基、 -N(d ~ C4烷基 )2、 -CO-d - 烷基或 -COO-d - 烷基取代的杂芳基，或者 R和 R'与邻 接的 N原子相连，形成未取代的或被卤素、 -d ~ C4烷基、 -OH、 -O-Ci - C4烷基、 -COOH、 -NH2、 -NH-Ci ~ C4烷基、 -N(Ci ~ C4烷基 )2、 -CO-Ci ~ C4烷基或 -COO-d ~ C4烷基取代的含氮饱和杂环基， 以及
n为 0 ~ 4的整数。
2. 如权利要求 1所述的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐， 其中 R3代表未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的芳基、未取代的或 被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的杂芳基、 未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的环烷基、或者未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基 取代的含氮饱和杂环基。
3. 如权利要求 1或 2所述的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐， 其中所述芳基为 C6~C1()的芳香族烃环基； 所述杂芳基为含有 1-4个选 自 N、 S、 O的杂原子的 5-6元单环杂芳基及其与苯环稠合而成的双环 式杂芳基或部分饱和的双环式杂芳基； 所述环烷基为具有 3 - 6个碳原 子的环脂族基团； 以及所述含氮饱和杂环基为环原子包含 1 ~ 2个 N原 子并且不含或包含 1个 O或 S原子的 5-7元含氮饱和杂环基。
4. 如权利要求 3所述的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐， 其中 所述芳基选自苯基或茶基； 所述杂芳基选自下列一组基团： 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 噻唑基、 异噻唑基、 嚅唑基、 异哺唑基、 三唑基、 四 唑基、 噻二唑基、 吡啶基、 嘧啶基、 1，达嗪基、 p比嗪基、 苯并咪唑基、 吲哚基、 异吲哚基、 p引唑基、 喹啉基、 异喹啉基、 喹唑啉基、 1,2,3,4- 四氢喹啉基； 所述环烷基选自环丙基、 环丁基、 环戊基或环己基； 以 及所述含氮饱和杂环基选自下列一组基团： 吡咯烷基、 哌嗪基、 哌啶 基、 吗啉基和 4代吗淋基。
5. 如权利要求 1-4 之任一项所述的式 (I)化合物或其药学上可接 受的盐， 其中 为 S。
6. 如权利要求 1-5 之任一项所述的式 (I)化合物或其药学上可接 受的盐， 其中 R1和 R2与邻接的 N原子相连形成-吗啉代。
7. 如权利要求 1 -6 之任一项所述的式 (I)化合物或其药学上可接 受的盐， 其中在 R3的定义中， 所述芳基为苯基， 所述杂芳基为吡啶基， 以及所述含氮饱和杂环基为吗啉基或哌啶基， 以及 A选自下列一组基 团： -卤素、 -R、 -(CH2)n-OR、 -(CH2)n-NRR 、 -NH-CO-(CH2)n-NRR 和 -CO-R, 其中， R和 R'分别独立地为 -H、 - -Ci烷基、 未取代的或被 卤素、 -d~C4烷基、 -OH、 -O-d 烷基、 -COOH、 -NH2取代的苯 基、 未取代的或被卤素、 -d~C4烷基、 -OH、 -O-d- 烷基、 -COOH、 -NH2取代的吡啶基或吡嗪基， 或者 R和 R'与邻接的 N原子相连， 形 成未取代的或被卤素、 -d~C4烷基、 -OH、 -O-d-Ct烷基、 -COOH、 -NH2取代的哌嗪基、 哌啶基或吗啉基，
n为 0或 1。
8. 如权利要求 1 -7 之任一项所述的式 (I)化合物或其药学上可接 受的盐， 其中 R3为未取代的或被 1~3个选自 A的取代基取代的苯基、 未取代的或被 1 ~3个选自 A的取代基取代的吗啉基、未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的哌啶基， 或者未取代的或被 1 ~ 3个选自 A 的取代基取代的吡啶基， 其中 A 选自下列一组基团： 1 3/4 素、 -R、 -(CH2)-OR、 -(CH2)-NRR 、 -NH-CO-(CH2)n-NRR 和 -CO-R, 其中 R和 R'分别独立地为 -H或 -d ~ C2烷基，或者 R和 R'与邻接的 N原子相连， 形成未被取代的或被卤素、 -d - ^烷基、 -OH、 -NH2取代的哌嗪基或 哌啶基， n为 0或 1。
9. 如权利要求 1所述的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐， 它选 白：
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯酚；
3- (4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯曱醚； 4-曱氧基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯 曱醚； '
4-曱氧基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯 酚；
2- (4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱醛； 3-(4-硫代吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯酚； 3- (4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))吡啶；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]呋喃并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯酚；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯胺；
2，4-二吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d]嘧啶；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯曱醛； 2-曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱 醚； . ，
2-曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基））苯 酚；
2-(顺式 -2,6-二曱基） -吗啉代 -4-吗啉代吡嗪并 [3 '，2 '.·4，5]噻吩并 [3,2-d]嘧啶；
1-羟基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))哌 啶；
1-羟曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))哌 17定，
3- (4-吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯曱醇； 2，5-二溴 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯 胺；
6-二曱氨基曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶 基))苯酚；
N-(4-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基））苯 基) -2- (二曱氨基）乙酰胺；
N_(4— (4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基））苯 基 )_2-(4-曱基哌嗪基）乙酰胺；
或它们药学上可接受的盐。
10. 药物组合物， 它包含权利要求 1 - 9之任一项所述的式 (I)化合 物或其药学上可接受的盐和制药学上允许的载体。
11. 权利要求 1 - 9之任一项的式 I化合物或其药学上可接受的盐 或权利要求 10的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物方面的应用。
12. 制备权利要求 1所述的式 (I)化合物的方法， 它包括步骤：
(!e) (If) (I)
式中， X、 R1 , R2、 R3定义如权利要求 1 , L表示离去基团，
以 2-氯 -3-氰基吡嗪为起始原料， 2-氯 -3-氰基吡嗪与通式 (la)化合物 反应成环得到通式 (lb)化合物； 通式 (lb)化合物与酰氯化合物 R3COCl 起酰化反应， 得到酰化产物通式 (Ic)化合物； 通式 (Ic)化合物与氨水起 反应， 得到通式 (Id)化合物； 通式 (Id)化合物在碱的存在下发生闭环反 应， 得到通式 (Ie)化合物； 通式 (Ie)化合物与酰氯反应转化成通式 (If)化 合物； 通式 (If)化合物与胺起反应， 得到通式 (I)化合物。
13. 制备权利要求 1所述的式 (I)化合物的方法， 它包括步骤：
式中， X、 R1 , R2 、 R3定义如权利要求 1， L表示离去基团，
以 2-氯 -3-氰基吡嗪为起始原料， 2-氯 -3-氰基吡嗪与通式 (la)化合物 反应成环得到通式 (lb)化合物； 通式 (lb)化合物与氨水起反应， 得到通 式 (li)化合物； 通式 (Π)化合物与尿素发生闭环反应， 得到通式 (Ij)化合 物； 通式 (Ij)化合物与三氯氧磷转化成通式 (Ik)化合物； 通式 (Ik)化合物 与胺发生亲核取代反应， 得到通式 (II), 通式 (II)化合物发生偶联反应， 得到通式 (I)化合物。
14. 权利要求 1 - 9之任一项的式 I化合物或其药学上可接受的盐， 用作为药物。
15. 一种治疗疾病的方法， 所述疾病能通过抑制 PI3K活性而得以 减轻或治疗， 包括步骤： 给需要治疗的病人施用权利要求 1 - 9之任一 项的式 I化合物或其药学上可接受的盐。
Description:
稠合杂芳基化合物及其制备方法和应用 技术领域
本发明涉及稠合杂芳基化合物及其制备方法， 以及这类衍生物作 为磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)抑制剂和抗癌剂的应用。 背景技术
磷脂酰肌醇 (phosphotidylinositol, PI)是在细胞膜中发现的多种磷脂 中的一种， 在细胞内信号转导中起重要作用。 磷脂酰肌醇 3-激酶 (Phosphoinositide 3 -kinases, PI3Ks)是使磷脂酰肌醇的肌醇环的 3位磷 酸化的酶 (D.Whitman等， 1988， Nature, 332， 664)。 PDK催化璘脂酰肌 醇形成 3,4-二磷酸磷脂酰肌醇 1108 11&^(1 ,4 bisphosphate, PI(3,4))P2)和 3，4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate, PI(3,4,5)P3), 引起蛋白激酶 C的活化和细胞内钙动员 [MJ Berridge 等， Nature, 312, 315(1984), Y Nishizuka, Science, 225, )]。
PI3K根据生理底物特异性可分为 I、 II和 III型。 类型 I是由 pi 10 催化亚单元和 p85 调节亚单元组成的杂二聚体。 该家族以调节伙伴和 调节机理为基础进一步被分成类型 la (pi 10 a , pi 10 P , pi 10 δ )和类型 lb (ρ? ?θ γ )酶。 类型 la被酪氨酸激酶体系活化， 类型 lb被 G蛋白偶联的 受体活化。 类型 II包括 PI3KC2 a、 02 β ^ C2 y ^ , 其特征为在 C 末端含有 C2结构域，已知 PI和 PI(4)P为 II类 PI3K的底物。111类 PI3K 底物只有 PI。 PI3K亚型中研究进行得最广泛的是类型 Ia。类型 la是由 HOkDa的催化亚单位和 85/55kDa的调节亚单位构成的。调节亚单位含 有 SH2结构域， 可由与具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体或癌基因 产物磷酸化的酪氨酸残基结合，诱导 pl lO催化性亚单位 (使其脂类底物 磷酸化)的 PI3K活性。 现在有相当有力的证据表明， 类型 IaPDK酶直 接或间接地在各种人类癌症中有致肿瘤性 (Vivanco and Sawyers, Nature Reviews Cancer, 9-501)。 PI3K其它亚型对心血管和免疫抑制 疾病发生相关。
因此， PI3K抑制剂可用作抗癌剂而倍受关注， 并成为肿瘤领域一 大研究热点。 Wortmannin[H Yano等， J Biol Chem., 263, 1] 和下式表示的 LY294002[CJ Vlahos等， J Biol Chem., 269, ] 是两个已知的第一代广谱 PI3K抑制剂。它们对 PI3K各亚型选择性小 , 且毒性大。 随后众多以 PI3K为靶点的化合物纷纷进入临床研究， 其中 一部分为 PI3K选择性抑制剂， 如进入临床 I期的 GDC-0941 (Class I PI3K inhibitor, Institute of Cancer Research UK), XL- 147 (Class I PI3K inhibitor, Exelixis Inc), 和 PX-866 (PI3K α、 δ and γ isoforms inhibitor, Oncothyreon); 还有部分为 PI3K/mTOR双重抑制剂， 如进入临床 II期 的 BEZ235 和 BGT226 (Novartis AG), 进入临床 I 期的 SF-1 126 (Semafore Pharmaceuticals Inc Exelixis Inc)。
国际专利申请 WO01/83456A1描述了作为 PI3K抑制剂和肿瘤剂的 二环或三环稠合杂芳基衍生物或其盐， 结构通式如下式 (a)和 (b)所示。 B为苯环、 或含有选自 0、 S和 N的 1 ~ 2个杂原子的 5-6元单环杂芳 环。
国际专利申请 WOA2公开了一类具有抑制 IKK酶 (ΙκΒ kinase)的三元杂环化合物和在自身免疫性疾病、 炎症和癌症中的应用 , 以及它们的制备方法。 结构通式如下式 (e)、 （f)、 （g)所示,母核分别是吡 啶 [3',2':4,5]噻吩 [3，2- |嘧啶， 吡啶 [3',2':4,5]噻吩 [3，2-? ][1，2，3]三嗪， 嘧 啶 [3'，2':4，5]噻吩 [3，2-?/]吡啶。
国际专利申请 WO公开了一种与选自二氢噻吩、 二氢 呋喃、 环烷烃部分的非芳香环稠合的嘧啶衍生物或其可药用盐， 和包 括所述化合物作为活性成分的药用组合物。 这些化合物表现出优异的 促进胰岛素分泌活性和对抗高血糖活性。但对于 PI3K抑制作用既没有 披露也没有说明。 结构通式如下式 (c)所示。
国际专利申请 WOA1 公开了一系列取代的吡啶 [3',2':4,5]噻吩 [3，2-?/]嘧啶和吡啶 [3',2':4,5]呋喃 [3,2- 嘧啶衍生物，可作 为 phosphodiesterase-4 (PDE-4)抑制剂和 TNF α释放阻断剂。 结构通式 如下 (h)、 （i)、 ①、 （k)所示。
(h) (?) 0) (k)
综上所述， 新颖的稠合杂芳基衍生物具有多种生物活性， 比如抗 高血糖作用， PI3K抑制作用， 癌细胞增殖抑制作用， 抗炎免疫抑制活 性等。在此结构基础上有效寻求特异性 PI3K抑制剂和抗癌剂成为当前 PI3Ks酶研究的一大热点。 发明内容
本发明提供了一种如以下通式 (I)表示的稠合杂芳基化合物， 或其 药学上可接受的盐，
X为 0、 S或 N;
R1和 R2与邻接的 N原子相连， 形成含氮饱和杂环基; R3为未取代的或被 1― 5个选自 A的取代基取代的芳基、未取代的 或被 1 ~ 5个选自 A的取代基取代的杂芳基、 未取代的或被 1 ~ 5个选 自 A的取代基取代的环烷基、 或者未取代的或被 1 ~ 5个选自 A的取 代基取代的含氮饱和杂环基； 其中，
A选自下列一组基团：鹵素、 -R、 -(CH2)n-OR、 -(CH2)n-NRR 、 -CO-R、 -COO-R、 -CONRR 、 -NH-CO-R、 -NH-CO-(CH2)n-NRR 和 -S02R;
R和 R'分别独立地为 -H、 -d ~ C4烷基、 -未取代的或被 素、 -Cj ~ C4烷基、 -OH、 -O-d ~ C4烷基、 -COOH、- NH2、 -NH-C! ~ C4烷基、 -N C! ~ C4烷基 )2、 -CO- 烷基或 -COO- 烷基取代的芳基、 -未取代 的或被卤素、 -d ~ C4烷基、 -OH、 -0-(^ ~ ( 4烷基、 -COOH、 -NH2、 -NH-d - C 烷基、 -Nfd 烷基 )2、 -CO-d - 烷基或 -COO-d 烷基取代的杂芳基， 或者 R和 R'与邻接的 N原子相连， 形成未取代的 或被卤素、 -d ~ C4烷基、 -OH、 -O-Ci ~ C4烷基、 -COOH、 -NH2、 -NH-Cj ~ C4烷基、 -N(d ~ C4烷基 )2、 -CO-d - 烷基或 -COO-d 烷基取代 的含氮饱和杂环基； 以及
n为 0 ~ 4的整数， 如 0、 1、 2、 3、 4。 在本发明中， 术语 "含氮饱和杂环基" 是指环原子包含 1 ~ 2个 N 原子并且不含或包含 1个 O或 S原子的 5-7元含氮饱和杂环基、 该杂 环基可与苯环稠合， 也可带有桥联。 优选的含氮饱和杂环基是吡咯烷 基、 哌嗪基、 哌啶基、 吗啉基和硫代吗啉基。 优选 1-吡咯烷基、 1-哌 嗪基、 哌啶基和吗啉代， 特别优选吗啉代。
在本发明中，术语"芳基"是指芳香族烃环基，优选碳原子数为 6 ~ 14个， 例如 6 - 10个的芳基， 更优选苯基、 萘基。
在本发明中， 术语 "杂芳基" 是指含有 1-4个选自 N、 S、 O的杂 原子的 5-6元单环杂芳基及其与苯环稠合而成的双环式杂芳基，它可以 是部分饱和的。 这里， 作为单环杂芳基， 可以例举， 但不限于， 呋喃 基、 噻吩基、 吡咯基、 咪唑基、 吡唑基、 噻唑基、 异噻唑基、 嚅唑基、 异哺唑基、 三唑基、 四唑基、 噻二唑基、 吡啶基、 嘧啶基、 哒1秦基、 吡 嗪基等； 作为双环式杂芳基， 可以例举， 但不限于， 苯并呋喃基、 苯 并噻吩基、 苯并噻二唑基、 苯并噻唑基、 苯并咪唑基、 吲哚基、 异吲 哚基、 吲唑基、 喹啉基、 异喹啉基、 喹唑啉基等； 作为部分饱和的杂 芳基， 可以例举， 但不限于， 1 ,2,3,4-四氢喹啉基等； 优选 5-6元单环 杂芳基， 例如咪唑基、 噻唑基、 三唑基、 吡啶基和吡嗪基。
在本发明中， 术语 "环烷基" 是指具有 3 - 6个碳原子的环脂族基 团， 例如环丙基、 环丁基、 环戊基和环己基。
在本发明中， 术语 "卤素" 是指氟、 氯、 溴、 碘， 优选氯和溴。 在本发明中， 术语 烷基" 是指曱基、 乙基、 丙基、 异丙 基、 丁基、 异丁基、 仲丁基或叔丁基； 优选曱基、 乙基、 丙基和丁基。
在本发明的一个实施方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 R3为未取 代的或被 1 ~ 5个选自 A的取代基取代的芳基、 未取代的或被 1 ~ 5个 选自 A的取代基取代的杂芳基、 未取代的或被 1 ~ 5个选自 A的取代 基取代的环烷基、或者未取代的或被 1 ~ 5个选自 A的取代基取代的含 氮饱和杂环基， 其中 A选自下列一组基团： -OR、 -NRR' 、 -CO-R、 -COO-R、 -CONRR 、 -NH-CO-R和 -S02R。
在本发明优选的实施方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 X为 s。 在另一优选的实施方案中，本发明通式 (I)化合物中 R1和 R2与邻接 的 N原子相连形成的含氮饱和杂环基为吡咯烷基、 哌嗪基、 哌啶基或 吗啉基， 尤其优选吗啉基。 在一个优选的实施方案中， R1和 R2与邻接 的 N原子相连形成-吗啉代。
在优选的实施方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 R3代表未取代的 或被 ,1 ~ 3个选自 A的取代基取代的芳基、 未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的杂芳基、未取代的或被 1― 3个选自 A的取代基取代 的环烷基、或者未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的含氮饱和 杂环基。
在另一个优选的实施方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 R3为未取 代的或被 1 ~ 5个选自 A的取代基取代的苯基、 未取代的或被 1 ~ 5个 选自 A的取代基取代的吗啉基、 未取代的或被 1 ~ 5个选自 A的取代 基取代的哌啶基、或者未取代的或被 1 ~ 5个选自 A的取代基取代的吡 啶基。在更为优选的实施方案中， R3为未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的 取代基取代的苯基、未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的吗啉 基、 未取代的或被 1 - 3个选自 A的取代基取代的哌啶基， 或者未取代 的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的吡啶基。在一个优选的实施方案 中， R3的定义中的取代基 A优选为卤素、 -R、 -(CH2)n-OR、 -(CH2)n-NRR 、 -NH-CO-(CH2)n-NRR'或 -CO-R, 其中 R和 R'分别独立地为 -H、 -d ~ C4烷基、 未取代的或被 素、 -d ~ C4烷基、 -OH、 -O-Ci C^烷基、 -COOH、 -NH2取代的苯基、 未取代的或被 l 3/4 素、 -d 烷基、 -OH、 -O-d 烷基、 -COOH、 -NH2取代的吡啶基或吡嗪基， 或者 R和 R' 与邻接的 N原子相连， 形成未取代的或被卤素、 -d ~ C4烷基、 -OH、 -O-d - 烷基、 -COOH、 -NH2取代的哌嗪基、 哌啶基或吗啉基。
在另一个优选的实施方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 R3为未取 代的或被 1 ~ 2个选自 A的取代基取代的苯基、 未取代的或被 1 ~ 2个 选自 A的取代基取代的吗啉基、 未取代的或被 1 ~ 2个选自 A的取代 基取代的哌啶基，或者未取代的或被 1 ~ 2个选自 A的取代基取代的吡 啶基。在一个优选的实施方案中，本发明通式 (I)化合物的 R3的定义中， 取代基 A优选为卤素、 -R、 -(CH2)n-OR、 -(CH2)n-NRR 、 -NH-CO-(CH2)n- NRR'或 -CO-R, 其中 R和 R'分别独立地为 -H、 -d ~ C4烷基、 未取代 的或被卤素、 -d - ^烷基、 -OH、 -O-d - 烷基、 -COOH、 -NH2取 代的苯基、 未取代的或被 1 3/4 素、 -C^ 烷基、 -OH、 -O- C^烷基、 -COOH、 -NH2取代的吡啶基或吡嗪基， 或者 R和 R'与邻接的 N原子 相连， 形成未取代的或被卤素、 -d 烷基、 -OH、 -O-d - 烷基、 -COOH、 -NH2取代的哌嗪基、 哌啶基或吗啉基， n为 0 ~ 2， 优选 n为 0或 1。
在优选实施方案中， 本发明通式 (I)化合物的 R3的定义中， 所述芳 基为苯基， 所述杂芳基为吡啶基， 以及所述含氮饱和杂环基为吗啉基 或哌啶基， 以及所述取代基 A 选自下列一组基团： - 1 3/4 素、 -R、 -(CH2)n-OR、 -(CH2)n-NRR 、 -NH-CO-(CH2)n-NRR 和 -CO-R, 其中， R 和 R'分别独立地为 -H、 -d 烷基、 未取代的或被卤素、 -d - 烷 基、 -OH、 -O-d - 烷基、 -COOH、 -NH2取代的苯基、 未取代的或被 卤素、 -C! - Ct烷基、 -OH、 -O-d Ci烷基、 -COOH、 -NH2取代的吡 啶基或吡嗪基，或者 R和 R'与邻接的 N原子相连， 形成未取代的或被 卤素、 -C^ 烷基、 -OH、 -O-d - 烷基、 -COOH、 -NH2取代的哌 嗪基、 哌啶基或吗啉基， n为 0或 1。
在优选的实施方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 R3为未取代的或 被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的苯基、 未取代的或被 1 ~ 3个选自 A 的取代基取代的吗啉基、未取代的或被 1 ~ 3个选自 A的取代基取代的 哌啶基， 或者未取代的或被 1 ~ 3个逸自 A的取代基取代的吡啶基， 其 中取代基 A选自下列一组基团： 卤素、 -R、 -(CH2)-OR、 -(CH2)-NRR 、 -NH-CO-(CH2)n-NRR 和 -CO-R, 其中 R和 R'分别独立地为 -H或 -Ci ~ C2烷基， 或者 R和 R'与邻接的 N原子相连， 形成未被取代的或被卤 素、 -d Cz烷基、 -OH、 -NH2取代的哌嗪基或哌啶基，η为 0或 1。
在本发明优选的方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 R3为可被至少 一个选自卤素、 -OH、 -d ~ C2烷基、 -Od - Cz烷基、 -NH2、 -Ci - C2 烷基 -N(d ~ C2烷基 )2、 -NH-CO-(CH2)n-NRR 和 -CHO的取代基取代的 苯基, 其中 n为 0或 1，R和 R'分别独立地为 -d C^烷基或者 R和 R' 与邻接的 N原子相连，形成未被取代的或被卤素或 -d ^烷基取代的 哌嗪基或哌啶基。
在另一个优选的方案中， 本发明通式 (I)化合物中的 R3为-吗啉代。 在本发明中， 作为通式（I )化合物， 具体优选的化合物为：
3- (4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯酚；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱醚； 4-曱氧基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯 甲醚；
4-曱氧基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯 酚；
2-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱醛； 3-(4-硫代吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯酚； 3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))吡啶；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]呋喃并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯酚；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯胺；
2，4-二吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3，2-d]嘧啶；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱醛； 2-曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯甲 醚；
2-曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基））苯 酚；
2- (顺式 2，6-二甲基) -吗啉代 -4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3，2-d] 嘧啶； 1-羟基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))哌 啶；
1-羟曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))哌 啶；
3-(4-吗啉代吡嗪并 [： Τ,2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯甲醇； 2,5-二溴 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯 胺；
6-二曱氨基甲基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶 基))苯酚；
N— (4-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基））苯 基) -2- (二曱氨基）乙酰胺；
N-(4-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基））苯 基 )_2-(4-曱基哌嗪基）乙酰胺；
以及它们药学上可接受的盐。 本发明还 一种 (I)化合物的方法， 它包括以下步骤：
上述方案中， 取代基 R1, R2, R3, X同上文所述。 L表示离去基 团， 优选!
3/4 素或者曱磺酰氧基、 对曱苯磺酰氧基等有机磺酸残基等。
该方法以 2-氯 -3-氰基吡嗪为起始原料， 将 2-氯 -3-氰基吡嗪与通式 (la)化合物反应成环得到通式 (lb)化合物； 通式 (lb)化合物与酰氯化合物 R3COCl起酰化反应， 得到酰化产物通式 (Ic)化合物； 通式 (Ic)化合物与 氨水起反应， 得到通式 (Id)化合物； 通式 (Id)化合物在碱的存在下发生 闭环反应， 得到通式 (Ie)化合物； 通式 (Ie)化合物与酰氯反应转化成通 式 (If)化合物； 通式 (If)化合物与胺起反应， 得到通式 (I)化合物。
上述方法中的碱， 可以是氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧化钙、 氢氧 化铝、 氢氧化锌、 碳酸钠、 碳酸钟、 碳酸氢钠、 碳酸氢钾、 氨水、 曱 胺、 乙胺、 二曱胺、 二乙胺、 三曱胺、 三乙胺等。
本发明还提供了另一种制备通式 (I)化合物的方法， 它包括以下步 骤：
上述方案中， 取代基 R1 , R2 , X， R3同上文所述。 其中 L表示离 去基团， 优选是 素或者曱磺酰氧基、 对曱苯磺酰氧基等有机磺酸残 基等。
该方法以 2-氯 -3-氰基吡嗪为起始原料， 将 2-氯 -3-氰基吡嗪与通式 (la)化合物反应成环得到通式 (lb)化合物； 通式 (lb)化合物与氨水起反 应， 得到通式 (Ii)化合物； 通式 (Ii)化合物与尿素发生闭环反应， 得到通 式 (Ij)化合物； 通式 (Ij)化合物与三氯氧磷转化成通式 (Ik)化合物； 通式 (Ik)化合物与胺发生亲核取代反应， 得到通式 (II) , 通式 (II)化合物发生 偶联反应， 得到通式 (I)化合物。 本发明还包含通式 (I)化合物的药学上可接受的盐。 术语 "药学上 可接受的盐" 是指相对无毒的本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。 所述酸加成盐为式 (I)化合物与合适的无机酸或者有机酸形成的盐， 这 些盐可在化合物最后的分离和提纯过程中制备， 或者是使纯化的化合 物以其游离碱形式与适宜的有机酸或无机酸进行反应， 再将形成的盐 分离而制成。 代表性酸加成盐包括氢溴酸盐、 盐酸盐、 硫酸盐、 亚硫 酸盐、 乙酸盐、 草酸盐、 戊酸盐、 油酸盐、 棕榈酸盐、 硬脂酸盐、 月 桂酸盐、 硼酸盐、 苯曱酸盐、 乳酸盐、 磷酸盐、 曱苯曱酸盐、 柠檬酸 盐、 马来酸盐、 富马酸盐、 琥珀酸盐、 酒石酸盐、 苯曱酸盐、 甲磺酸 盐、 对曱苯磺酸盐、 葡萄糖酸盐、 乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。 所述 碱加成盐为式 (I)化合物与合适的无机碱或者有机碱形成的盐， 包括例 如与碱金属、 碱土金属、 季铵阳离子形成的盐， 如钠盐、 锂盐、 钾盐、 钙盐、镁盐、四曱基季铵盐、四乙基季铵盐等；胺盐， 包括与氨（NH3 )、 伯胺、 仲胺或叔胺形成的盐， 如： 曱胺盐、 二曱胺盐、 三曱胺盐、 三 乙胺盐、 乙胺盐等。 、 本发明化合物或其药学上可接受的盐可给药于人， 可以口服、 直 肠、 肠胃外 (静脉内、 肌肉内或皮下）、 局部给药（采用例如粉剂、 软膏 剂或滴剂等剂型）。
用于口服给药的固体剂型包括胶嚢剂、 片剂、 丸剂、 散剂和颗粒 剂。 在这些固体剂型中， 活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂（或载 体）混合， 如柠檬酸钠或磷酸二钙， 或与下述成分混合： （a) 填料或增 容剂， 例如， 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇和硅酸； （b) 粘合剂， 例如， 羟曱基纤维素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯基吡咯烷酮、 蔗糖和阿 拉伯胶； （c) 保湿剂， 例如， 甘油； （d) 崩解剂， 例如， 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠； （e)緩溶剂， 例如石蜡； （f) 吸收加速剂， 例如， 季胺化合物； （g) 润湿剂， 例如鲸 蜡醇和单硬脂酸甘油酯； （h) 吸附剂， 例如， 高岭土； 和 (i) 润滑剂， 例如， 滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠， 或其混合物。 胶嚢剂、 片剂和丸剂中， 剂型也可包含緩冲剂。
固体剂型如片剂、 糖丸、 胶嚢剂、 丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳 材制备， 如肠衣和其它本领域公知的材料。 它们可包含不透明剂， 并 且， 这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化 道内的某一部分中释放。 可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类 物质。 必要时， 活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微 胶嚢形式。
用于.口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、 溶液、 悬浮 液、 糖浆或酊剂。 除了活性化合物外， 液体剂型可包含本领域中常规 采用的惰性稀释剂， 如水或其它溶剂， 增溶剂和乳化剂， 例知， 乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 丙二醇、 1,3-丁二醇、 二曱基曱酰胺以 及油， 特别是棉籽油、 花生油、 玉米胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油 或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外， 组合物也可包含助剂， 如润湿剂、 乳化 剂和悬浮剂、 甜味剂、 娇味剂和香料。
除了活性化合物外， 悬浮液可包含悬浮剂， 例如， 乙氧基化异十 八烷醇、 聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、 微晶纤维素、 曱醇铝和琼 脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物包括生理上可接受的无菌含水或无水溶 液、 分散液、 悬浮液或乳液， 和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或 分散液的无菌粉末。 适宜的含水和非水载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂 包括水、 乙醇、 多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、 散剂、 喷射剂 和吸入剂。 活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐 剂、 緩沖剂， 或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明还提供药物组合物，它含有 0.05-50mg上述式 (I)化合物或其 药学上可接受的盐， 以及药学上可接受的载体、 赋形剂或稀释剂。
本发明还提供了一种治疗疾病的方法， 所述疾病可通过抑制 PI3K 活性而得以减轻或治疗， 包括步骤： 给需要治疗的病人使用 0.05-30mg/kg体重 /天的式 I化合物或其药学上可接受的盐。 在优选的 实施方案中， 所述的疾病是肿瘤。
本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐可以单独给药， 或者 与其他药学上可接受的治疗剂联合给药， 特别是与其他抗肿瘤药物组 合。 所述治疗剂包括但不限于： 作用于 DNA化学结构的药物抗肿瘤药 如顺铂， 影响核酸合成的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤 (MTX)、 5-氟尿嘧啶 (5FU)等， 影响核酸转录的抗肿瘤药物如阿霉素、 表阿霉素、 阿克拉霉 素、 光辉霉素等， 作用于微管蛋白合成的抗肿瘤药物如紫杉醇、 长春 瑞滨等， 芳香化酶抑制剂如氨鲁米特、 兰特隆、 来曲唑、 瑞宁德等， 细胞信号通路抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂伊马替尼（ Imatinib )、 吉非替尼 （Gefitinib ) 、 埃罗替尼（ Erlotinib ) 等。 待组合的各成分可 同时或顺序地给予， 以单一制剂形式或以不同制剂的形式给予。 所述 组合不仅包括本发明的化合物和一种其它活性剂的组合， 而且包括本 发明的化合物和两种或更多种其它活性剂的组合。 本发明化合物通过体外细胞实验证明具有癌细胞增殖抑制作用， 可用于制备治疗癌症的药物。 本发明化合物抑制癌细胞增殖的药效可 用常规方法测定，一种优选的评价方法为磺酰罗丹明 B(Sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法： SRB是一种蛋白结合染料， 可与生物大分子中的 碱性氨基酸结合， 其在 510 nm的光密度（ OD )读数与蛋白量呈良好 的线性关系， 故可用作细胞数的定量， 通过测定药物作用于癌细胞后 所产生的光吸收值的变化来计算药物对癌细胞增殖的抑制率。
抑制率（％ ) = ( OD对照 -OD抑制剂 -OD空白对照） /(OD对照 -OD 空白对照） X 100%
OD对照： 指没有药物作用正常生长的细胞的孔的 OD值。
OD 抑制剂： 指加入阳性或者待筛选的化合物作用的细胞的孔的 OD值。
OD空白对照： 指没有接种细胞的平行对照孔的 OD值。
半数抑制剂浓度（ IC5。 )值通过软件 GraphPad Prism 5计算得到。 本发明化合物对 PI3K的抑制作用， 可通过检测 PI3K介导的下游 信号 AKT激酶磷酸化的方法测定， 一种常规的检测方法为蛋白质免疫 印迹法。 研究表明， 本发明化合物能抑制 PI3K介导的下游信号 AKT 激酶磷酸化， 具有 PI3K抑制活性。 附图说明
图 1是实施例化合物 2和阳性对照化合物（ LY294002 )抑制 PI3K 介导的下游信号 AKT激酶磷酸化的蛋白质免疫印迹图。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例 仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明 具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的 条件。 除非另外说明， 否则份数和百分比为重量份和重量百分比。 具体实施方式 实施例 1
3_(4-吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱醚的制 备
以 2-氯 -3-氰基吡嗪为起始原料。 在丙酮中依次加入 2-氯 -3-氰基吡 嗪 ( 143mmol ) 、 （Ia-1)化合物（150mmol)和无水碳酸钾 ( 157mmol ) , 于 55 °C搅拌 6小时反应成环得到（Ib-1)化合物（121mmol)。 在 (Ib-1)化合 物 (60mmol)的曱苯 ( 130ml )溶液中加入间甲氧基苯曱酰氯（192mmol), 于 83 °C搅拌 7小时得到酰化产物 (Ic-1)化合物 (53mmol)。向（Ic-1)化合物 (40mmol)的曱醇 （70ml ) 溶液加入氨水（70ml ) , 室温搅拌过夜得到 (Id-1)化合物 (32mmol)。 5%氢氧化钠水溶液（70ml )加入到（Id-1)化合 物 (30mmol)的甲醇 ( 70ml )溶液中, 70 °C下搅拌 4小时得到（Ie-1)化合 物 (25mmol)。 （Ie-1)化合物 (20mmol)、 草酰氯 ( 71mmol )和 DMF(lml) 依次加入到二氯曱烷 （ 95ml ) 中， 加热回流过夜得到 （If-1)化合物 (l lmmol 将 (If-1)化合物 (9.2mmol)溶于 50ml无水四氢呋喃中， 冰水 浴下向其中滴加 30ml吗啉， 加热回流 1.5小时。 降至室温， 用乙酸乙 酯反复萃取 3次， 合并有机相， 饱和食盐水洗 3次后无水硫酸钠干燥。 硅胶柱层析分离得到黄色固体化合物（l)2.4g，， 收率为 68.8%。
H^NMRCDMSO): δ 9.01(d,lH)， δ 8.94(d,lH)， δ 7.95-7.91 (m， 2Η), δ 7.30(t,lH), δ 6.95(d,lH)5 δ 4.03(t,4H), δ 3.93(s,3H), δ 3.81(t,4H)
ESI(+)m/z: 380 实施例 2
3_(4_吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯酚的制备
将实施例 1中的化合物（1) (6.33mmol)溶于 100ml醋酸和 120ml的 溴化氢（40%水溶液） 中， 加热回流过夜。 降至室温， 减压浓缩后加饱 和碳酸氢钠水溶液调节至弱碱性， 用乙酸乙酯萃取 3次， 合并有机相， 无水硫酸钠干燥。 柱层析分离得到黄色固体化合物 (2)0.58g， 收率为 25.1%。
H^NMRiDMSO): δ 9.59(s,lH), δ 9.02(d,lH), δ 8.91(d,lH), δ 7.99-7.94(m,2H), δ 7.34(t，lH)， δ 6.92(d,lH), δ 4.05(t， 4Η), δ 3.85(t,4H)
ESI(+)m/z: 366 实施例 3
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]呋喃并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯酚的制备
参考实施例 1操作方法， 以 2-氯 -3-氰基吡嗪为起始原料， 与（Ia-3) 化合物反应成环得到 （Ib-3)化合物， 与酰氯化合物反应得到酰化产物 ( Ic-3), 然后与氨水反应得到 （Id-3) ， 再成环得到化合物 （Ie-3), 转 化得到（If-3)化合物。 将 (If-3)化合物 (6mmol)与吗啉 20ml起反应， 得到 (Ig_3)化合物 (4.6mmol)。将 (Ig-3)化合物（3.2mmol)溶于 50ml醋酸和 60ml 的溴化氢（40%水溶液） 中， 加热回流过夜。 降至室温， 减压浓缩后加 饱和碳酸氢钠水溶液调节至弱碱性， 用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机 相， 无水硫酸钠干燥。 柱层析分离得到化合物 (3)0.31g， 收率为 27.8%。
H^NMRCDMSO): δ 9.48(s，lH)， δ 9.04(d，lH)， δ 8.96(d，lH), δ 7.95-7.90(m,2H), δ 7.29(t,lH), δ 6.82(d,lH)， δ 4.07(t，4H)， δ 3.88(t，4H)
ESI(+)m/z: 350 实施例 4
3_(4-硫代吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯酚的 制备
将上述实施例 1 中的（If-1)化合物（lOmmol)与硫代吗啉 (15mmol)起 反应， 得到（Ih-4)化合物 (9.5mmol)。 将 (Ih-4)化合物 (4.2mmol)溶于 60ml 醋酸和 75ml的溴化氢（40%水溶液） 中， 加热回流过夜。 降至室温， 减压浓缩后加饱和碳酸氢钠水溶液调节至弱碱性， 用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机相， 无水硫酸钠干燥。 柱层析分离得到黄色固体化合物 (4)0.5g, 收率为 31.1%。
H^NMRCDMSO): δ 9.51(s，lH), δ 8.98(d,lH), δ 8.87(d,lH), δ 7.99-7.94(m,2H)， δ 7.27(t,lH), δ 6.95(d,lH), δ 4.47(t,4H), δ 2.90(t,4H)
ESI(+)m/z: 382 实施例 5
3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯胺的制备
在上述实施例 1 中的（Ib-1)化合物 (6mmol)的甲苯（ 13ml )溶液中加 入间硝基苯曱酰氯 (20mmol), 于 83 °C搅拌 7小时得到酰化产物 (Ic-5)化 合物 (4.8mmol)。 向（Ic-5)化合物 (4.8mmol)的曱醇（ 10ml )溶液加入氨水 ( 10ml ) , 室温搅拌过夜得到（Id-5)化合物 (2.9mmol)。 5%氢氧化钠水 溶液 （7ml ) 加入到（Id-5)化合物（2.9mmol)的甲醇 （7ml ) 溶液中， 70 °C下搅拌 4 小时闭环反应得到（Ie-5)化合物（1.6mmol)。 （Ie-5)化合物 (1.6mmol)、草酰氯（ 7mmol )和 DMF(0.3ml)依次加入到二氯甲烷（ 9ml ) 中， 加热回流过夜得到 （If-5)化合物（0.75mmol)。 将（If-5)化合物 (0.75mmol)与吗啉 (2ml)反应， 得到（Ih-5)化合物 (0.52mmol)。 将 (Ih-5)化 合物 (0.52mmol)溶于 10ml曱醇， 加入 10%钯碳 0.08g， 过滤， 通氢气 3 小时后浓缩。 硅胶柱层析分离得到化合物 (5)0.09g, 收率为 52.3%。
ESI(+)m/z: 365 买施例 6
3_(4_吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))吡啶的制备
在上述实施例 1的（Ib-1)化合物 (31mmol)的甲苯 ( 65ml ) 溶液中力口 入 3-吡啶曱酰氯 (90mmol), 于 83°C搅拌 7小时得到酰化产物 (Ic-6)化合 物（24mmol)。 向（Ic-6)化合物（24mmol)的曱醇 （35ml) 溶液加入氨水 ( 35ml) , 室温搅拌过夜得到（Id-6)化合物（19mmol)。 5%氢氧化钠水溶 液 （35ml) 加入到（Id-6)化合物（19mmol)的曱醇 (35ml) 溶液中， 70 °C 下搅拌 4 小时闭环反应得到（Ie-6)化合物（14mmol)。 （Ie-6)化合物 (14mmol)、草酰氯（ 35mmol )和 DMF(0.5ml)依次加入到二氯曱烷（ 55ml) 中，加热回流过夜得到 （If-6)化合物 (9.8mmol)。将 (If-6)化合物 (7.5mmol) 溶于 50ml无水四氢呋喃中， 冰水浴下向其中滴加 30ml吗啉， 加热回 流 2.5小时。 降至室温， 用乙酸乙酯反复萃取 3次， 合并有机相， 饱和 食盐水洗 3 次后无水硫酸钠干燥。 硅胶柱层析分离得到固体化合物 (6)2.13g, 收率为 80.1%。
H^NMRCDMSO): δ 9.53(s，lH), δ 9.28(d,lH), δ 8.99(d,lH), δ 8.86(d,lH), δ 8.67(d,lH), δ 8.05(m,lH), δ 4.07(t,4H), δ 3.88(t,4H) ESI(+)m/z: 351 实施例 ?
4-曱氧基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯 曱醚
(Ie-7) (If-7) (7)
在上述实施例 1的（Ib-1)化合物（15mmol)的曱苯 （32ml) 溶液中加 入 2,5-二曱氧基苯曱酰氯 (20mmol)， 于 83°C搅拌 ?小时得到酰化产物 (Ic- 7)化合物（13mmol)。 向（Ic-7)化合物（13mmol)的曱醇（ 15ml)溶液加 入氨水（ 15ml) , 室温搅拌过夜得到（Id-7)化合物（llmmol)。 5%氢氧化 钠水溶液 ( 18ml)加入到（Id-7)化合物（llmmol)的曱醇 ( 18ml)溶液中， 70°C下搅拌 4 小时闭环反应得到（Ie-7)化合物 (8.7mmol)。 （Ie-7)化合物 (8.7mmol)、草酰氯（ 20mmol )和 DMF(0.3ml)依次加入到二氯曱烷（ 35ml ) 中， 加热回流过夜得到 (If-7)化合物（6.3mmol)。 将（If-7)化合物 (6.3mmol ) 溶于 50ml无水四氢呋喃中， 冰水浴下向其中滴加 30ml吗 啉， 加热回流 2.5小时。 降至室温， 用乙酸乙酯反复萃取 3次， 合并有 机相， 饱和食盐水洗 3 次后无水硫酸钠干燥。 硅胶柱层析分离得到固 体化合物 (7)2.07g， 收率为 78.3%。
ESI(+)m/z: 410 实施例 8
4-曱氧基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯 酚的制备
将化合物 (7) (4.93mmol)溶于 80ml醋酸和 110ml的溴化氢（ 40%水 溶液） 中， 加热回流过夜。 降至室温， 减压浓缩后加饱和碳酸氢钠水 溶液调节至弱碱性， 用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机相， 无水硫酸钠 干燥。 柱层析分离得到固体化合物 (8)0.57g， 收率为 29.2%。
H^NMRCDMSO): δ 9.26(s,lH), δ 9.08(d,lH), δ 8.85(d，lH)， δ 7.67(s,lH), δ 7.39(d,lH), δ 7.24(d,lH), δ 3.96(t,4H), δ 3.85(t,4H), δ 3.80(s,3H)
ESI(+)m/z: 396 实施例 9
2,4- '，2':4,5]噻吩并 [3，2-d]嘧啶的制备
在上述实施例 1的（Ib-1)化合物（lOmmol)的曱醇 （ 11ml )溶液加入 氨水（ 1 1ml ) ， 室温搅拌过夜得到（Ii-9)化合物 (7.2mmol)。 (Ii-9)化合物 (7.2mmol)与尿素（ 72mmol )的混合物于 200 °C下加热 5小时，得到（Ij-9) 化合物 (4.9mmol)。 （Ij-9)化合物 (4.9mmol)加入到三氯氧磷（ 100ml ) 中， 加热回流过夜得到（Ik-9)化合物 (0.56mmol)。将 (Ik-9)化合物 （0.56mmol) 溶于 10ml无水四氢呋喃中， 冰水浴下向其中滴加 10ml吗啉。 室温搅 拌 0.5小时， 加水淬灭， 乙酸乙酯反复萃取 3次， 合并有机相， 饱和食 盐水洗 3 次后无水硫酸钠干燥。 硅胶柱层析分离得到固体化合物 (9)24mg, 收率为 1 1.9%。
H^NMRiDMSO): δ 9.04(d,lH), δ 8.96(d,lH), δ 4.10-3.99(m, 8Η), δ 3.86-3.77(m,8H)
ESI(+)m/z: 359 实施例 10
-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱醛的制
(S-9) ( 3/4 -9) (Im-10) (10)
在上述实施例 9的（Ik-9)化合物（0.56mmol)加入吗啉 0.5ml反应生 成 (Im-10)化合物 (0.5mmol)。 在氩气保护下， 将 Pd(Ph3)4 ( 26.24mg, 0.0227mmol ) 迅速加入 (Im-10)化合物（0.227mmol ) 的 DME(25ml)溶液 中， 搅拌 15 分钟。 将 1.5 ml 2M 2C03 水溶液和 2-醛基苯硼酸 ( 0.25mmol )依次加入体系， 加热回流过夜。 TLC监控反应完成， 冷 却至室温， 加水后用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机相， 用无水石克酸钠 干燥。 柱层析分离得到黄色固体化合物（10)65 mg， 收率 76%。
H^NMRCCDCls): δ 10.55(s,lH), δ 8.96(d,lH)， δ 8.80(d,lH), δ 8.39(d,lH), δ 7.92(d,lH), δ 7.66(m,lH), δ 7.47(m,lH)， δ 4.24-4.10(t，4H)， δ 3.94-3.80(t,4H) ESI(+)m/z: 378 实施例 1 1
3·(4_吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))苯曱醛的制 备
在氩气保护下， 将 Pd(Ph3)4 ( 26.24mg, 0.0227mmol )迅速加入实 施例 10 中的（Im-10)化合物（0.227mmol ) 的 DME(25ml)溶液中， 搅拌 15分钟。 将 1.5 ml 2M 2C03水溶液和 3-醛基苯硼酸（ 0.25mmol )依 次加入体系， 加热回流过夜。 TLC监控反应完成， 冷却至室温， 加水 后用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机相， 用无水硫酸钠干燥。 柱层析分 离得到黄色固体化合物（1 1)65 mg， 收率 76%。
HLNMRCCDCls): δ 10.55(s,lH), δ 8.96(d,lH), δ 8.80(d,lH), δ 8.39(d，lH)， δ 7.92(d5lH), δ 7.66(m,lH), δ 7.47(m,lH), δ 4.24-4.10(t,4H), δ 3.94-3.80(t,4H)
ESI(+)m/z: 378 实施例 12
2-曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3 '，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯曱 醚
在上述实施例 1的（Ib-1)化合物 (30mmol)的曱苯（65ml )溶液中加 入邻曱基间甲氧基苯曱酰氯 (45mmol), 于 83 °C搅拌 7小时得到酰化产 物 (Ic-12)化合物（18mmol)。 向（Ic-12)化合物（18mmol)的曱醇（20ml )溶 液加入氨水（20ml ) , 室温搅拌过夜得到（Id-12)化合物（14mmol)。 5% 氢氧化钠水溶液（ 20ml )加入到（Id-12)化合物（14mmol)的曱醇 （ 20ml ) 溶液中， 70°C下搅拌 4小时闭环反应得到（Ie-12)化合物（12mmol)。（Ie-12) 化合物（12mmol)、 草酰氯（ 25mmol )和 DMF(0.4ml)依次加入到二氯曱 烷 ( 40ml ) 中， 加热回流过夜得到 （If-12)化合物 (9.0mmol)。 将 (If-12) 化合物 (9.0 mmol)溶于 50ml无水四氢呋喃中， 冰水浴下向其中滴加 30 ml吗啉， 加热回流 1.5小时。 降至室温， 用乙酸乙酯反复萃取 3次， 合并有机相， 饱和食盐水洗 3 次后无水硫酸钠干燥。 硅胶柱层析分离 得到黄色固体化合物（12) 2.3g，, 收率为 68.2%。
H1-醒 R(CDC13): δ 9.01(d,lH)， δ 8.94(d,lH), δ 7.95-7.91(m, 2Η), δ 7.30(t,lH), δ 6.95(d,lH), δ 4.03(t，4H)， δ 3.93(s,3H), 6 3.81(t,4H) ESI(+)m/z: 394 实施例 13
2-甲基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯酚 的
将实施例 12中的化合物（12) (6.30mmol)溶于 100ml醋酸和 120ml 的溴化氢（40%水溶液） 中， 加热回流过夜。 降至室温， 减压浓缩后加 饱和碳酸氢钠水溶液调节至弱碱性， 用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机 相， 无水硫酸钠干燥。 柱层析分离得到黄色固体化合物（13)0.58 g, 收 率为 25.0%。 H^NMRiCDCls): δ 9.59(s,lH), δ 9.02(d，lH)， δ 8.91(d，lH)， δ 7.99-7.94(m,2H), δ 7.34(t,lH), δ 6.92(d,lH), δ 4.05(t,4H), δ 3.85(t,4H)
ESI(+)m/z: 380 实施例 14
2- (顺式 2，6-二曱基) -吗啉代 -4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3，2-d] 嘧啶的制备
将顺式 2， 6-二曱基吗啉 ( 0.15ml )加入到实施例 10中的（Im-10) 化合物 （0.18mmol ) 的 DMF溶液， 滴加 DIPEA ( 0.4ml ) ， 80°C加热 过夜。 加水淬灭， CH2C12萃取， 无水 Na2S04干燥。 柱层析分离得到黄 色固体化合物（14)55mg, 收率 78%。
H1- NMR(CDC13): δ 8.85 (d,lH), δ 8.69 (d,lH), δ 3.91 - 3.99 (m,2H), δ 3.71 3.75 (m,4H), δ 2.67-2.73 (m,8H), δ 1.32(s，3H)， δ 1.31 (s，3H).
ESI(+)m/z: 387 实施例 15
1-羟基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基))哌啶 的制备
将 3-羟基哌啶 ( 0.90mmol )加入到实施例 10 中的（Im-10)化合物 ( 0.18mmol ) 的 DMF溶液， 滴力口 DIPEA ( 0.4ml ) , 90°C加热过夜。 加水淬灭， CH2C12萃取， 无水 Na2S04干燥。 柱层析分离得到黄色固体 化合物（15)61mg， 收率 86%。
H^NMRCCDCb): δ 8.85(d,lH), δ 8.68(d,lH), δ 4.21(d,lH), δ 4.05-3.88(m,l lH)， δ 3.75(m,lH), δ 1.94(m,2H), δ 1.75(m, 1Η), δ 1.62(m,lH).
ESI(+)m/z: 373 实施例 16
1-羟曱基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4，5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))哌 啶的制备
将 3-羟曱基哌啶（ 0.90mmol )加入到实施例 10中的（Im-10)化合物 ( 0.18mmol ) 的 DMF溶液， 滴加 DIPEA ( 0.4ml ) , 90°C加热过夜。 加水淬灭， CH2C12萃取， 无水 Na2S04干燥。 柱层析分离得到黄色固体 化合物（16)61mg, 收率 86%。
H^NMRCCDC ): δ 8.81(d,lH), δ 8.66(d，lH)， δ 4.08(s，lH)， δ 3.99-3.94(m,4H), δ 3.90(m,6H), δ 3.81(s,lH), δ 3.54(d,2H), δ 2.03(s,lH), δ 1.89(m,lH), δ 1.70(m,lH), δ 1.54(m,2H).
ESI(+)m/z: 387 实施例 17
3·(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯甲醇的制 备
室温下， 将 NaBH4 ( 1.5mmol )加入到实施例 11 中的化合物（1 1) ( 0.15mmol ) 的曱醇溶液中，.搅拌过夜。 减压浓缩， 柱分离得到淡黄 色固体化合物（17)49mg， 收率 86%。
H^NMRCCDCb): δ 8.96 ( s,lH ) , δ 8.78 (s,lH), δ 8.63 (s,lH), δ 8.56(d,l H), δ 7.55 (m,2H), δ 4.85 (s,2H), 6 4.17 (s,4H), δ 3.99(s,4H), δ 1.89(br,lH).
ESI(+)m/z: 380 实施例 18
2，5-二溴 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3，2-d](2-嘧啶基))苯 胺的制备
室温下，将 NBS(0.17mmol)加入实施例 5中的化合物（5) (0.17mmol) 的 DMF(30ml)溶液中， 搅拌过夜。 加水淬灭， 加入 CH2C12 ( 50ml ) ， 分离有机相， 无水 Na2S04干燥。 柱层析分离得到固体化合物（18 ) 22mg, 收率 25%。
H^NMRCCDCls): δ 8.91(s,lH), δ 8.76(d,lH), δ 7.38(d,lH), δ 6.76(d，lH)， 5 4.12(t,4H)， δ 3.74(t,4H), δ 2.79-2.74(br, 2H)
ESI(+)m/z: 522 实施例 19
6-二曱氨基甲基 -3-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶 基))苯酚的制备
将实施例 2 中的化合物 2 ( 0.27mmol ) 悬浮于乙醇中， 加入 38% 曱醛溶液（ 0.1ml)和 33%二曱胺溶液（0.1ml)， 回流过夜。 减压浓缩， 柱层析分离得到黄色固体化合物（19) 62mg, 收率 55%。
H】-NMR(CDC13): δ 8.95(d,lH), δ 8.77(d,lH), δ 8.19(d,lH), δ 8.16(s,lH), δ 7.23(d,lH), δ 4.14(m,4H), δ 3.96(m,6H), δ 2.57(s,6H).
ESI(+)m/z: 423 实施例 20
N-(4-(4-吗啉代吡嗪并 [3'，2':4，5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基））苯 基) -2- (二 乙酰胺的制备
在上述实施例 1中的（Ib-1)化合物（12mmol)的曱苯 (25ml) 溶液中 加入对硝基苯曱酰氯 (40mmol),于 83。C搅拌 7小时得到酰化产物 (Ic-20) 化合物 (9mmol)。 向（Ic-20)化合物 (9mmol)的曱醇（20ml)溶液加入氨水 (20ml) , 室温搅拌过夜得到（Id-20)化合物 (5mmol)。 5%氢氧化钠水溶 液 ( 15ml)加入到（Id-20)化合物 (5mmol)的甲醇 ( 15ml)溶液中， 70 °C 下搅拌 4 小时闭环反应得到（Ie-20)化合物（3mmol)。 （Ie-20)化合物 (3mmol)、草酰氯（ 15mmol)和 DMF(0.5ml)依次加入到二氯曱烷（ 15ml) 中， 加热回流过夜得到 （If-20)化合物（1.5mmol)。 将（If-20)化合物 (1.5mmol)与吗啉 (4ml)反应， 得到（Ih-20)化合物（lmmol)。 将 (Ih-20)化合 物（lmmol)溶于 20ml甲醇， 加入 10%钯碳 0.2g， 过滤， 通氢气 3小时 后浓缩。 硅胶柱层析分离得到（In-20)化合物（lmmol)。 将（ In-20 )化合 物（ lmmol)加入到氯乙酰氯（36ml)中， 80°C下加热搅拌过夜得到（Io-20) 化合物 ( 0.52mmol )。将 (Io-20)化合物 ( 0.25mmol )溶于 THF ( 50ml )， 依次加入碳酸钾 (2.0mmol)和二甲胺（ lmmol) ， 65°C下搅拌过夜。 冷 却， 过滤， 减压蒸去 THF， 残余物用硅胶板制备层析分离， 得到目标 产物淡黄色固体化合物 (20)68mg, 收率 71%。
H^NMRCDMSO): δ 10.03(s，lH)， δ 9.02(d,lH), δ 8.91(d,lH), δ 8.45(d,2H), δ 7.84(d,2H), δ 4.06(m,4H)， δ 3.85(m,4H), δ 3.19(s,2H), δ 2.35 (s, 6Η).
ESI(+)m/z: 450 实施例 21
N-(4-(4-吗啉代吡嗪并 [3',2':4,5]噻吩并 [3,2-d](2-嘧啶基））苯 基 )_2-(4-曱基哌 乙酰胺的制备
将实施例 20中的（IO-20)化合物 ( 0.25mmol )溶于 THF ( 50ml) ， 依次加入碳酸钾 (2.0mmol)和 1-曱基哌嗪盐酸盐 （ lmmol) , 65°C下搅 拌过夜。 冷却， 过滤， 减压蒸去 THF， 残余物用硅胶板制备层析分离， 得到目标产物黄色固体化合物 (21)76mg， 收率 75%。
H^NMRiDMSO): δ 10.08(s,lH), δ 9.03(d,lH), δ 8.94(d,lH), δ 8.48(d,2H), δ 7.83(d,2H), δ 4.04(m,4H), δ 3.87(m,4H), δ 3.34(m,4H) , 53.19(s,2H), δ 2.50(m,4H), δ 2.28(s,3H).
ESI(+)m/z: 505 实施例 22 药物组合物
化合物 （2) 22g
微晶纤维素 68g
按常规方法， 将上述物质混合均勾后， 装入普通明胶胶嚢， 得到 1000颗胶囊。
按类 乂方法， 分别制得含其他实施例化合物的胶嚢。 测试实施例 1 人前列腺癌细胞 （PC-3 ) 增殖抑制作用
将处于对数生长期的人前列腺癌细胞以约 5500 个 /孔的密度接种 于 96孔培养板， 180μ1/孔。 每个浓度设三复孔。 并设相应浓度的溶媒 对照及无细胞调零孔。 贴壁生长 24hr再加实施例化合物或阳性对照药 ( LY294002 ) 20μ1/孔， 细胞在 10% Hyclone胎牛血清， 37°C、 5%C02 条件下培养 72hr。 加入 50 %的冷三氯乙酸（TCA ) 50μ1, 4°C放置 1小 时， 固定细胞。 倾去液体， 用蒸馏水轻緩洗涤 5次， 空气中自然干燥。 加入由 1 %冰醋酸配制的 SRB 4mg/ml溶液 ΙΟΟμΙ/孔， 室温中染色 15 分钟。 弃上清液， 用 1%醋酸洗涤 5次， 空气中干燥。 每孔加入 150μ1 的 10 mM的 Tris 溶液（ pH 10.5 )，溶解结合的 SRB。 酶标仪 510nm波 长下测定 OD值，通过计算获得实施例化合物对于 PC-3细胞的 IC5o值： 化合物 ΙΟ50(μΜ)
实施例 2 0.22
实施例 7 44.3
实施例 8 2.21
实施例 9 12.2
实施例 1 1 1.68
实施例 12 1.27
实施例 13 5.61
实施例 14 9.54
实施例 15 12.59 实施例 16 10.42
实施例 17 1.27
实施例 18 12.59
实施例 19 27.39 测试结果表明： 本发明化合物对人前列腺癌细胞 （PC-3 ) 有良好 的增殖抑制作用。 测试实施例 2 人乳腺癌细胞 （ MDA-MB-231 ) 增殖抑制作用
参照测试实施例 1 实验方法， 通过计算获得实施例化合物对于 MDA-MB-231细月包的 IC50值： 化合物 ΙΟ50(μΜ)
实施例 11 1.85
实施例 12 4.16
实施例 13 13.96
实施例 15 22.07
实施例 14 19.76
实施例 16 17.07
实施例 17 4.16
实施例 18 22.07
实施例 19 9.98 测试结果表明： 本发明化合物对人乳腺癌细胞 （MDA-MB-231 ) 有良好的增殖抑制作用。 测试实施例 3 人非小细胞肺癌细胞 （ A549 ) 增殖抑制作用
参照测试实施例 1 实验方法， 通过计算获得实施例化合物对于 A549细胞的 IC50值： 化合物 ΙΟ50(μΜ)
LY.1 实施例 2 1.04
实施例 7 18.7
实施例 8 2.62
实施例 9 12.2
实施例 1 1 7.89
实施例 12 1.55
实施例 13 14.45
实施例 14 18.86
实施例 15 5.50
实施例 16 6.40
实施例 17 1.55
实施例 18 28.87
实施例 19 14.20 测试结果表明： 本发明化合物对人非小细胞肺癌细胞 （A549 ) 有 良好的增殖抑制作用。 测试实施例 4 人卵巢癌细胞 （ SK-OV-3 ) 增殖抑制作用
参照测试实施例 1 实验方法， 通过计算获得实施例化合物对于 SK-OV-3细胞的 IC5o值： 化合物 Ι。50(μΜ)
实施例 2 0.29
实施例 7 60.1
实施例 8 2.51
实施例 9 5.09
实施例 1 1 1.74
实施例 12 0.64
实施例 13 3.89
实施例 14 5.98
实施例 15 2.05 实施例 16 2.16
实施例 17 0.64
实施例 18 8.36
实施例 19 93.11 测试结果表明： 本发明化合物对人卵巢癌细胞（ SK-OV-3 )有良好 的增殖抑制作用。 测试实施例 5 蛋白质免疫印迹试验
将处于对数生长期的乳腺癌细胞（MDA-MB-231 ) 以约 4 & 105个 / 孔的密度接种于 6孔培养板， 贴壁生长 24hr。 先在三孔中加 EGF 20 1/ 孔， 一孔中不加 EGF, 加了 EGF的两孔中再分别加实施例 2化合物或 阳性对照药 ( LY294002 ) 20μ1/孔， 在 10% Hyclone胎牛血清， 37。C、 5%C02条件下培养 24hr。 细胞用冷 PBS洗涤后， 加入上样緩冲液裂解 细胞。 细胞裂解物于 100 °C中加热 10分钟， 12000g离心 5min, 取上 清。 上清进行 SDS-PAGE电泳分析。 25mA恒流， 湿转 2hr， 将蛋白转 至 PVDF ( polyvinylidine di fluoride )膜上。 取出 PVDF膜， 与相应 的一抗（p-AKT、 AKT或 GAPDH ) 4°C孵育过夜。 TBST洗涤振荡洗 涤 3次， 每次 10 min。 再加入相应的二抗， 室温下孵育 1小时。 TBST 洗涤 3次后， 用 ECL发光试剂盒显影， 并压片， 结果见图 1。 结果表明： 本发明化合物能引起细胞 AKT激酶磷酸化的减弱， 说 明具有 PI3K抑制活性。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每 一篇文献被单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本说明书 之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形 式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
& 2004-. All rights reserved.}